2.1   材料表征结果   
2.1.1   材料大体外观   锰掺杂羟基磷灰石呈现细腻的白色粉状，经聚多巴胺表面修饰后，材料颜色由原先的白色转变为深棕色(图2)，并且聚多巴胺修饰后的样品粉体易团聚，但整体仍保持良好粉末状态。此颜色变化验证了聚多巴胺在材料表面的氧化自聚合反应已完成。




2.1.2   扫描电镜观察材料具体结构   扫描电镜下HA/PDA、5Mn-HA/PDA、10Mn-HA/PDA及15Mn-HA/PDA表面形态未见明显差异，均呈球状，表面为粗糙多孔结构；相较于纯羟基磷灰石，聚多巴胺修饰后的羟基磷灰石微球表面粗糙且见明显的颗粒状纹理(图3A)，提示聚多巴胺成功黏附在羟基磷灰石微球表面。各组微球的粒径检测结果，如图3B所示。各组微球的粒径分布均较为集中，分布在9.86-13.00 μm范围内，呈正态分布趋势，说明材料尺寸具有良好的均一性；其中，纯羟基磷灰石的平均粒径最小，为(9.86±0.35) μm，经过聚多巴胺表面修饰的羟基磷灰石微球粒径均有不同程度增加。为对材料的元素组成进行分析，利用能量色散光谱对5Mn-HA/PDA进行检测，结果显示微球中可检测到Mn、Ca、P、O等元素，其中Ca、P主要来自于羟基磷灰石，O主要来自于聚多巴胺和羟基磷灰石，锰掺杂后可见锰元素均匀分布在微球中(图3C)。
2.1.3   X射线衍射对材料成分进行分析   纯羟基磷灰石样品的衍射峰与羟基磷灰石标准卡片高度一致，主要特征峰出现在2θ= 25.9°，31.8°，32.9°，34.1°，39.8°，46.7°，49.5°和53.2°处，体现出结晶性良好，并且具备较高的相纯度(图3D)。在HA/PDA组样品的图谱中各衍射峰位置均未出现变动，但峰强度略有下降，说明聚多巴胺的包覆并未改变羟基磷灰石的晶体结构，但由于聚多巴胺的无定形特性，能够对X射线信号产生一定吸收，导致衍射强度减弱。在锰掺杂样品中，随着锰掺杂量从5%逐步增加至15%，各组样品的衍射峰强度呈下降趋势且峰形逐渐增宽，尤其是在10Mn-HA/PDA组与15Mn-HA/PDA组中表现更为明显。这可能与Mn2+进入羟基磷灰石晶格后引起的晶格畸变或晶粒尺寸减小有关，但是所有锰掺杂样品的主要特征衍射峰并未发生明显位移。
2.1.4   傅里叶红外光谱检测材料官能团   在4 000-2 000 cm-1范围内，所有样品的光谱透射率变化较小，曲线较为平坦(图3E)。在3 236.6 cm-1处，各样品均显示一个较宽的吸收峰，归结于O-H键的伸缩振动，该峰提示材料中羟基基团的存在；在1 600 cm-1以下区域，HA/PDA组光谱在1 596.9 cm-1处观察到显著的吸收峰，对应芳香环的C=C骨架振动，而在羟基磷灰石组曲线对应位置未见明显特征峰，验证了聚多巴胺涂层的成功黏附。锰掺杂后样品的光谱趋势与羟基磷灰石、HA/PDA一致。另外，所有样品在1 009.7 cm-1处观察到显著吸收峰，对应P-O键的伸缩振动，而604.3 cm-1和563.8 cm-1处呈现的2个较强的吸收峰，归属于PO?3-的弯曲振动，进一步确认了羟基磷灰石成分在复合材料中的存在，并且锰掺杂未改变羟基磷灰石的基本结构。
2.1.5   材料锰离子释放量   从图3F可以看出，第1天观测时各组均有一定程度的Mn2+释放，随着时间的推移，Mn2+累计释放量逐渐增加，并且随着锰掺杂量的增加，材料Mn2+的累计释放量也逐渐升高，其中15Mn-HA组释放水平最高。与相应未修饰组相比，聚多巴胺修饰后的各组曲线整体更为平缓，并且在整个释放周期内Mn2+的累计释放量均低于相对应的未修饰组(P < 0.001)，这一差异随着锰投料比例的增加而更为明显。该结果证明聚多巴胺在一定程度上抑制了Mn2+的突释，起到控释作用。
2.1.6   材料降解速率   如图3G所示，经过28 d的体外降解，6组材料均表现出较好的结构稳定性，剩余质量百分比均超过90%，但是10Mn-HA/PDA材料剩余质量百分比小于10Mn-HA(P < 0.001)，15Mn-HA/PDA剩余质量百分比小于10Mn-HA(P < 0.001)，5Mn-HA/PDA材料剩余质量百分比小于5Mn-HA(P < 0.05)，说明与未修饰材料相比，经过聚多巴胺表面修饰的材料表现出更显著的质量损失。




2.2   大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定   如图4所示，显微镜下见细胞呈长梭形，以漩涡状排列生长；成骨诱导21 d后见明显橘红色钙结节形成，成脂诱导14 d后在胞质内见较多橙色脂滴。上述结果证实培养的细胞符合间充质干细胞的形态特征，并具有多向分化潜能。



2.3   材料的细胞相容性评价结果   
2.3.1   细胞增殖实验   如图5A所示，将未经聚多巴胺表面修饰的各组材料与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，培养第1天，各组细胞增殖活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；随培养时间延长，各组细胞呈现持续增殖趋势，至第3天，15Mn-HA组细胞增殖活性显著低于对照组(P < 0.05)；培养第5天，10Mn-HA组、15Mn-HA组细胞增殖活性低于对照组(P < 0.05，P < 0.001)，提示10%及15%锰掺杂羟基磷灰石可能对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖产生一定抑制作用。如图5B所示，培养第1，3，5天，经聚多巴胺修饰后各材料组的细胞增殖活性与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，提示聚多巴胺涂层能够有效调控Mn2+的释放速率，从而防止前期Mn2+突释，降低高浓度Mn2+对细胞活性的潜在负面影响。
2.3.2   细胞活死染色   为进一步验证聚多巴胺修饰后各组材料对大鼠骨髓间充质干细胞活性的影响，将各组材料与大鼠骨髓间充质干细胞共培养5 d后进行活死细胞染色，结果图5C所示。各组均可见到大量形态完整的梭形细胞，绿色荧光分布均匀，显示细胞健康的生长状态及较高的汇合度，代表死细胞的红色荧光信号极少，各组间无显著差异，进一步证明经聚多巴胺表面修饰材料具有较好的细胞相容性。这一结论与CCK-8实验的定量分析结果一致。
综合细胞增殖检测与活死染色结果，5%锰掺杂羟基磷灰石在聚多巴胺修饰前后的细胞活性与对照组相比无显著差别，因骨修复周期较长，为防止Mn2+浓度堆积所带来的潜在毒性影响，选择细胞相容性良好的5Mn-HA与5Mn-HA/PDA进行后续成骨相关实验。




2.4   材料的体外骨诱导能力检测结果   为评价各组材料对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，分别通过碱性磷酸酶活性检测和茜素红S染色对成骨分化早、晚期标志物进行了定性与定量分析，见图6A-D。
2.4.1   碱性磷酸酶活性检测   碱性磷酸酶染色结果显示，与对照组相比，羟基磷灰石组与HA/PDA组染色程度略有加深，5Mn-HA
组和5Mn-HA/PDA组染色程度进一步加深，表现出更加显著的碱性磷酸酶活性。碱性磷酸酶活性定量检测结果进一步印证了染色实验的趋势：5Mn-HA组及5Mn-HA/PDA组碱性磷酸酶活性最高，均显著高于对照组、羟基磷灰石组、HA/PDA组(P < 0.001)；而羟基磷灰石组及HA/PDA组碱性磷酸酶活性亦显著高于对照组(P < 0.001)。
2.4.2   茜素红S染色及定量分析   茜素红S染色结果显示，与对照组相比，羟基磷灰石组和HA/PDA组可见明显的钙盐沉积，并且HA/PDA组钙盐沉积更为显著；另外，相较于羟基磷灰石组和HA/PDA组，5Mn-HA组、5Mn-HA/PDA组钙盐沉积明显增加，其中以5Mn-HA/PDA组增加最为显著。定量检测结果显示，5Mn-HA/PDA组吸光度值高于其余4组，HA/PDA组吸光度值高于对照组、羟基磷灰石组，并且羟基磷灰石组吸光度值高于对照组，差异均有显著性意义。说明引入锰掺杂羟基磷灰石的促成骨分化能力进一步增强，以5Mn-HA/PDA组最为显著。
2.4.3   q-PCR检测成骨相关基因表达   Runx2为成骨分化早期的关键转录因子，骨钙素为晚期成骨标志物，为从分子水平验证材料的促成骨性能，通过q-PCR检测了成骨分化的关键基因Runx2和骨钙素mRNA表达，结果如图6E，F所示。5Mn-HA/PDA组Runx2及骨钙素mRNA表达量最高，显著高于其余4组。羟基磷灰石组、HA/PDA组、5Mn-HA组Runx2及骨钙素mRNA表达表达量亦均显著高于对照组；其中，HA/PDA组Runx2表达量亦显著高于羟基磷灰石组，差异均有显著性意义，该结果进一步证实了5Mn-HA/PDA具有较好的成骨诱导活性。




2.5   材料的动物体内骨诱导能力检测结果   
2.5.1   实验动物数量分析   24只SD大鼠全部进入结果分析。
2.5.2   大鼠颅骨Micro-CT检查   术后第4，8周，各组大鼠颅骨缺损部位Micro-CT成像结果，见图7A。术后第4周，空白对照组骨缺损区内几乎无新骨形成，呈现大面积空洞；羟基磷灰石组和HA/PDA组骨缺损区内可见少量新生骨组织，5Mn-HA组、5Mn-HA/PDA组骨缺损区内可见较多新生骨组织，以5Mn-HA/PDA组新生骨组织更多。术后第8周，空白对照组骨缺损区内仅见少量新生骨组织，羟基磷灰石组和HA/PDA组骨缺损区内新生骨组织较术后4周增加，5Mn-HA组、5Mn-HA/PDA组骨缺损区内可见大量的新生骨组织，并且5Mn-HA/PDA组缺损区域基本被新生骨组织完全覆盖，与周围宿主骨形成了良好的结合。
进一步分析了新生骨的骨体积分数和骨密度，结果如图7B所示。术后第4周，5Mn-HA/PDA组骨体积分数最高，并且显著高于其余4组；5Mn-HA组骨体积分数亦明显高于空白对照组、羟基磷灰石组和HA/PDA组。同时，与空白对照组相比，羟基磷灰石组和HA/PDA组骨体积分数均显著升高。术后第8周，各组骨体积分数较第4周均呈上升趋势，其中5Mn-HA/PDA组仍为最高，显著优于其他4组；此外，羟基磷灰石组、HA/PDA组及5Mn-HA组骨体积分数均显著高于空白对照组。在骨密度方面，术后第4周和第8周，5Mn-HA组及5Mn-HA/PDA组均显著高于羟基磷灰石组与HA/PDA组，羟基磷灰石组和HA/PDA组显著高于空白对照组，差异均具有显著性意义。
2.5.3   组织学分析   苏木精-伊红染色结果直观地反映了缺损区域的组织构成和细胞状态，各组骨缺损处苏木精-伊红染色结果，见图8。术后第4周，空白对照组骨缺损区域主要为疏松的纤维结缔组织，无明显新生骨形成；羟基磷灰石组与HA/PDA组骨缺损边缘可见少量新生骨组织，但新骨形成量有限，中心区域仍为纤维组织占据，HA/PDA组材料被纤维组织包裹；相比之下，5Mn-HA组骨缺损处新生骨小梁数量显著增多，5Mn-HA/PDA组新生骨小梁数量最多，但中央仍以纤维组织为主。术后第8周，空白对照组骨修复基本停滞，羟基磷灰石组与HA/PDA组新生骨量虽有增加，但仍局限于缺损边缘，未能形成有效骨桥接；5Mn-HA组骨缺损中央观察到明显的骨岛形成，伴有成骨细胞在周围聚集，5Mn-HA/PDA组相比于5Mn-HA组修复效果更好，骨缺损中央形成了大面积骨岛，并能明显观察到有从边缘向中心生长的新骨形成。
Masson染色结果：Masson染色结果与苏木精-伊红染色相符，如图9所示。术后第4周，对照组蓝染面积稀少，纤维束松散；羟基磷灰石组与HA/PDA组在缺损边缘出现薄层蓝染向内延伸，但中央仍以浅蓝、疏松的纤维性蓝染为主，并且连续性较弱；而5Mn-HA组可见蓝染的骨基质沿边缘向内侧延伸；5Mn-HA/PDA组边缘蓝染最为明显、范围更大，小梁周围蓝染加深，但中央仍以浅蓝纤维为主，连续性尚不足，骨桥接尚未形成。术后第8周，羟基磷灰石组与HA/PDA组的蓝染范围和强度有所增加，但仍未实现骨性桥接；5Mn-HA组中央出现散在的骨岛样蓝染；5Mn-HA/PDA组则在缺损中央形成了大面积致密的蓝色骨岛，显示出向缺损中心长入的趋势，边缘与中心的骨连接性显著增强。

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口腔颌面部局部骨缺损的修复是口腔医学多学科不断深入研究的重要课题[1-3]，自体骨移植因优异的组织相容性和骨诱导活性被誉为骨缺损治疗的“金标准”，但该方法需要开辟第二术区且并发感染的风险较高，因此临床应用受到一定的限制[4-5]；
同种异体骨和异种骨移植存在免疫排斥反应和传播疾病的隐患[6-7]。相比之下，人工骨移植材料因可控性强、成本较低及手术简便等优点正逐渐成为骨缺损修复的研究热点[8-9]。羟基磷灰石作为人体骨骼和牙齿的主要无机成分，具有与骨组织相似的化学组成和晶体结构，在骨修复领域得到广泛应用[10-11]。羟基磷灰石的制备方法多种多样，可通过调整设计方案及工艺参数来构建具有不同形貌特征的产物，以满足不同的临床需求[12]。其中，微球结构的羟基磷灰石因高比表面积和中空特性而备受关注，这种结构不仅增加了材料与生物环境的接触面积，实现了更均匀的细胞附着和生长因子的分布，而且能够促进血管长入，加速骨再生进程[13]。但是，单纯羟基磷灰石的骨诱导性能不足，难以满足骨缺损修复的需要[14-15]。研究发现，羟基磷灰石晶格中的Ca2+可以通过离子交换被其他金属离子部分取代，形成金属离子掺杂羟基磷灰石，从而进一步提升材料的生物学性能[16-17]。
金属元素Mn作为人体的必需微量元素[18]，在骨及软骨的发育与合成过程中有至关重要的作用[19]。研究表明，适宜浓度的Mn2+能够上调骨细胞相关基因的表达，促进细胞的成骨向分化，同时参与胶原纤维的交联和矿化，从而提高骨组织的机械强度；此外，Mn2+的抗氧化特性可以去除活性氧物质，减轻炎症对骨再生的抑制，还可通过破坏细菌细胞壁赋予材料抗感染能力[20-22]。因此，此次研究拟引入Mn2+增强羟基磷灰石的成骨诱导能力。但Mn2+的生物学效应具有浓度依赖性[23-25]，多项研究表明，当Mn2+浓度超过0.1 mmol/L时可诱导细胞毒性，抑制成骨基因表达，甚至诱导细胞凋亡[26]。骨缺损修复是一个长期过程，Mn2+的爆发性释放可能导致局部浓度过高，造成周围组织损伤，因此，调控Mn2+的释放速率成为优化材料成骨效果的关键。
为了实现Mn2+的可控释放，聚多巴胺作为一种新型表面改性材料展现出了巨大的潜力[27]。聚多巴胺是一种由多巴胺在弱碱性有氧环境下通过氧化自聚合反应形成的聚合物，因良好的表面附着能力和化学稳定性被广泛应用于材料改性领域[28-29]。聚多巴胺可附着于多种固体表面，其分子结构中的儿茶酚胺基团能与Mn2+形成稳定的配位键[30]，从而有效锚定Mn2+，通过缓慢降解实现Mn2+的可控释放，从而维持促进骨修复的有效浓度。基于此，此次研究提出将聚多巴胺涂层引入锰掺杂羟基磷灰石微球体系，利用配位作用实现Mn2+的可控释放，从而提升骨修复效果，为未来人工骨移植材料的合成提供新的思路。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   材料制备、表征实验，细胞实验，动物实验。实验框架结构见图1。

1.2   时间及地点   实验于2025年1-7月在湖北医药学院附属人民医院口腔医学中心研究所完成。
1.3   材料
1.3.1   试剂与仪器   Ca(NO₃)₂·4H₂O(分析标准品≥98%，天津北联)；硝酸锰溶液(50% in H2O，MACKLIN，中国)；盐酸多巴胺(分析标准品≥98%，MACKLIN，中国)；Tris-base(分析标准品≥99%，BIOFROXX，德国)；尿素、(NH4)2HPO4(分析标准品≥99%，阿拉丁)；10%硝酸(福林)；谷氨酸(分析标准品≥98%，众联试剂)；溶菌酶、Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒(索莱宝，中国)；DMEM/F12培养液(GIBCO，美国)；胎牛血清(Biological Industries，以色列)；1%青霉素-链霉素溶液(Hyclone，美国)；碱性磷酸酶检测试剂盒、茜素红S溶液(碧云天，中国)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、CCK-8 液(Beyotime，中国)；40 g/L多聚甲醛组织固定液(Biosharp)；成脂诱导培养液(成脂诱导小分子化合物Kit-1，索莱宝)；电感耦合等离子体质谱仪(赛默ICAP RQ ICP-MS，美国)；倒置荧光显微镜(奥林巴斯IX53+DP73，阿富汗)；冷冻干燥机(Labconco，美国)；酶标仪(Thermo，美国)；磁力搅拌器(安徽中科中佳科学仪器有限公司，中国)；RT-qPCR检测仪(BIO-RAD，美国)；X射线衍射仪(布鲁克 D8 advance)；场发射扫描电子显微镜(蔡司Sigma 300)；傅里叶变换红外光谱仪(布鲁克ALPHAH)；小动物Micro-CT扫描影像系统(PerkinElmer Quantum GX2)。
1.3.2   实验动物   24只雄性SD大鼠，8周龄，体质量250-300 g，用于颅骨缺损修复实验；6只雄性SD大鼠，三四周龄，体质量80-100 g，用于提取骨髓间充质干细胞。大鼠均购于湖北医药学院实验动物中心，合格证号：SCYK(鄂)2024-0008。实验已通过湖北医药学院伦理委员会批准，审查批号：第2025-实034号。
1.4   实验方法   
1.4.1   材料的制备   采取水热均相共沉淀法制备锰掺杂羟基磷灰石。以Ca(NO₃)₂·4H₂O作为钙源，(NH4)2HPO4作为磷源，硝酸锰溶液作为锰源，按锰/(钙+锰)的摩尔比分别为5%，10%，15%，(钙+锰)/磷=1.67的摩尔比配置混合溶液60 mL，搅拌均匀；将0.06 mol尿素作为均相剂加入溶液中，加入0.036 mol谷氨酸作为反应调节剂，搅拌溶解，使用0.1 mol/L硝酸溶液将溶液pH值调节至3.5，磁力搅拌30 min，确保溶液充分混合均匀。将配制好的溶液转移至反应釜中，置于烘箱中加热至180 ℃反应10 h。
反应釜自然冷却至室温，去除上清液，收集釜底的沉淀，依次用去离子水及无水乙醇洗涤3遍，置于烘箱中37 ℃干燥12 h，得到锰掺杂羟基磷灰石，将各组产物分别标记为5Mn-HA、10Mn-HA、15Mn-HA。
聚多巴胺的涂覆：配置2 g/L的盐酸多巴胺-tris缓冲溶液，称取羟基磷灰石、5Mn-HA、10Mn-HA、15Mn-HA分别浸入到缓冲溶液中，避光常氧条件下搅拌24 h。反应结束后，2 000 r/min离心4 min后弃上清，洗涤并冻干(-80 ℃，48 h)，得到的各组产物分别标记为HA/PDA、5Mn-HA/PDA、10Mn-HA/PDA、15Mn-HA/PDA。
1.4.2   材料的表征 
材料形貌、成分与结构：羟基磷灰石、HA/PDA、5Mn-HA/PDA、10Mn-HA/PDA、15Mn-HA/PDA的微观形貌表征采用扫描电子显微镜观察。上述5种材料的晶体结构采用X射线衍射仪分析，扫描方式采用衍射，角度选择10°-60°。在化学组成分析方面，采用附属于电镜的能量色散X射线光谱仪对5Mn-HA/PDA进行元素定性分析，材料表面喷金60 s后，采用能谱面扫形式进行扫描。采用傅里叶变换红外光谱仪对5种材料进行光谱测试，扫描范围为4 000-400 cm-1，检测材料表面或内部的官能团及化学键信息。
Mn2+释放能力：分别称取5 mg冻干后的5Mn-HA/PDA、10Mn-HA/PDA、15Mn-HA/PDA、5Mn-HA、10Mn-HA、15Mn-HA粉末于15 mL离心管中，加入10 mL去离子水后置于恒温振荡器中(37 ℃，60 r/min)。分别在1，3，7，14，21，28 d取出离心管，2 000 r/min离心4 min后收集5 mL上清液，并再向离心管中加入5 mL去离子水。通过电感耦合等离子质谱仪分析上清液中的Mn2+含量，计算Mn2+累计释放量。
材料的降解能力：分别称取20 mg的5Mn-HA/PDA、10Mn-HA/PDA、15Mn-HA/PDA、5Mn-HA、10Mn-HA、15Mn-HA粉末于15 mL
离心管中；另称取0.25 mg溶菌酶溶解于5 mL PBS中，振荡均匀后加入到各组离心管中，将离心管置于37 ℃烘箱中，每3 d更换一次溶菌酶溶液。28 d后取出各离心管，离心后置于烘箱内干燥，重新称量质量(记为mt)，计算材料剩余质量百分比。
剩余质量百分比=mt /20×100%
1.4.3   大鼠骨髓间充质干细胞的提取与鉴定   取三四周龄SD大鼠，过量吸入二氧化碳处死后置于体积分数为75%乙醇溶液中浸泡30 min，转移至超净工作台，取双侧股骨和胫骨，去除骨骺端，用1 mL注射器吸取完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔呈白色。收集冲洗液于15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min后去除上清，用完全培养基重悬后转移至T25培养瓶中，待细胞生长融合至80%后进行传代，选择P3-P5代进行后续实验。
间充质干细胞的鉴定：将第3代大鼠骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×105/孔，使用完全培养基培养24 h后，更换为成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、50 µg/L抗坏血酸、10-2 mol/L β-甘油磷酸钠及10-8 mol/L地塞米松的完全培养基)培养21 d，茜素红染色观察成骨分化能力；更换为成脂诱导培养基培养14 d，油红O染色观察成脂分化能力。
1.4.4   材料的细胞相容性
细胞增殖实验：将大鼠骨髓间充质干细胞以1×104/孔的密度接种于24孔板中，分别加入0.5 mg/mL(该浓度参考文献[31])的羟基磷灰石、5Mn-HA、10Mn-HA、15Mn-HA(或羟基磷灰石、HA/PDA、5Mn-HA/PDA、10Mn-HA/PDA、15Mn-HA/PDA)，设置单独培养的骨髓间充质干细胞为对照，每组3个复孔。每2 d半换液一次模拟体内代谢动态。培养1，3，5 d后，将原培养基更换为含体积分数10% CCK-8工作液的完全培养基，避光孵育1 h后使用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。
细胞活死染色：将大鼠骨髓间充质干细胞以1×104/孔的密度接种于24孔板中，分别加入0.5 mg/mL的羟基磷灰石、HA/PDA、5Mn-HA/PDA、10Mn-HA/PDA、15Mn-HA/PDA，设置单独培养的骨髓间充质干细胞为对照，每组3个复孔。培养第5天，使用Calcein-AM/PI染色试剂盒对细胞进行染色，避光孵育30 min后在倒置荧光显微镜下观察细胞存活情况。
综合实验结果，选择细胞相容性较好的锰掺杂羟基磷灰石进行后续实验。
1.4.5   材料体外成骨诱导能力检测
实验分组：将大鼠骨髓间充质干细胞以2×104 /孔的密度接种于24孔板中，分别加入0.5 mg/mL的羟基磷灰石、HA/PDA、5Mn-HA和5Mn-HA/PDA，每组设置3个复孔。待细胞生长融合达80%后更换为成骨诱导培养基，每2 d换液一次。
碱性磷酸酶活性检测：成骨诱导培养第7天，使用BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒对细胞进行染色，观察细胞内碱性磷酸酶活性；另外，使用碱性磷酸酶检测试剂盒进行定量检测，收集细胞裂解液后加入相应的底物，在37 ℃孵育10 min后加入终止液终止反应，最后在405 nm波长下测定吸光度值，分析碱性磷酸酶活力。
茜素红S染色：成骨诱导第21天，用PBS轻柔清洗细胞两三次，以去除培养皿中残余的培养基，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，去除多聚甲醛后再次用PBS清洗，加入1%茜素红S溶液(pH=4.2)染色30 min，用去离子水冲洗去除未结合的染液，在显微镜下观察钙结节形成情况。另外，使用10%氯化十六烷基吡啶溶液溶解已经结合的茜素红S染液，在室温下振荡30 min后收集上清液，在562 nm波长下测定吸光度值。
q-PCR检测：成骨诱导培养第7天，提取细胞总RNA，采用RNA试剂盒提取总RNA，测定浓度后使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，进行RT-qPCR检测：首先在95 ℃条件下预变性2 min，随后进行变性-退火-延伸的循环，共计40个循环
(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s)，反应结束后进行熔解曲线分析，以GAPDH作为内参基因，检测Runx2和骨钙素mRNA表达。引物序列见表1。

1.4.6   材料体内成骨诱导能力检测
骨缺损造模与材料植入：大鼠颅骨缺损模型因操作简单、可重复性强、愈合能力有限，是评估骨修复材料成骨能力的标准化模型[32]，因此，实验以大鼠双侧颅骨缺损作为实验模型。

取8周龄SD大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后剔除头顶术区及周围2 cm毛发，术区消毒，沿颅顶正中做一3 cm大小的纵向切口，钝性分离皮下组织，直至颅骨暴露；使用5 mm大小取骨钻在颅骨两侧分别制作1个直径5 mm的圆形全层骨缺损，右侧分别植入羟基磷灰石、HA/PDA、5Mn-HA、5Mn-HA/PDA，每种材料植入6只大鼠，左侧不植入材料作为空白对照，分层缝合切口。术后，大鼠每日肌注4×104 U青霉素钾，持续3 d预防感染。
取材：术后第4，8周，每组材料每个时间点随机挑选3只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后处死，用组织剪取颅骨，剥离颅骨皮肤肌肉后置于40 g/L多聚甲醛固定。
颅骨缺损样本Micro-CT扫描：样本固定48 h后，用PBS冲洗3次，干燥放置，采用小动物Micro-CT扫描影像系统进行扫描并重建，计算骨体积分数及骨密度。
苏木精-伊红染色：将颅骨样本置于EDTA溶液中进行脱钙处理，每两三天换液一次，直至可用针头轻松穿过；乙醇脱水后用石蜡包埋制成蜡块，制作5 µm厚度的切片，二甲苯脱蜡后依次经不同浓度梯度的乙醇水化，苏木精浸染约5 min，流动水清洗，分化液分化，自来水漂洗，0.5%氨水返蓝；伊红复染2 min，体积分数70%，80%，95%，100%乙醇梯度脱水(每级1 min)，二甲苯透明，中性树胶封固，最后在光镜下观察。
Masson染色：切片经脱蜡水化后，先用Weigert铁苏木精核染5 min，流动水下冲洗10 min，置于丽春红酸性品红染液中染色5 min，1%磷钼酸溶液分化3 min，苯胺蓝液复染3 min，1%冰醋酸分化30 s去除背景色；快速脱水透明，树脂封固，在光学显微镜下观察。
1.5   主要观察指标   各组材料的理化性能、生物相容性以及体内外骨诱导能力。
1.6   统计学分析   统计学分析采用SPSS 25.0统计软件完成，所有计量资料均以x±s表示。针对两组之间的比较采用独立样本t检验，多组数据通过单因素方差分析进行检验，在涉及到2个变量的情况下进一步采用双因素方差分析进行检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经湖北医药学院生物统计学专家审核确认。

人工骨充填材料是口腔颌面部局部骨缺损修复的常见临床选择。随着干细胞研究的深入，骨再生已被证实为由骨髓间充质干细胞主导的复杂生物学过程[33]，骨髓间充质干细胞在缺损部位的募集、增殖与成骨分化是实现骨修复的关键环节[34]。因此，理想的骨修复材料不仅应提供物理支撑，更需创建一个能主动引导骨髓间充质干细胞生物学行为的微环境[35-36]。基于此，针对传统骨修复材料的生物学性能进行靶向改良，已成为当前骨修复领域的重要研究方向[37-38]。
在众多骨修复材料中，羟基磷灰石因与天然骨矿物相近而兼具良好生物相容性与骨传导性，已被广泛用于口腔颌面部骨缺损的修复。近年来，羟基磷灰石在骨再生领域的应用研究进展迅猛，特别是通过不同合成方法调控其微观形貌，显著提升了材料的生物活性、机械强度和药物递送能力，从而优化了骨再生效果[39-40]。羟基磷灰石常见合成方法包括湿化学共沉淀法、溶液凝胶法及水热法[41-42]。此次研究采用水热共沉淀法成功制备了羟基磷灰石微球，该方法被广泛应用于制备金属离子掺杂陶瓷材料[43]，优势在于能有效促进金属离子进入羟基磷灰石的晶格内部形成稳定的替代掺杂，而非简单的表面吸附，同时有利于获得均一的球形貌和良好的结晶度。此次研究合成的羟基磷灰石微球形貌均一、粒径集中，具有良好的细胞相容性。植入材料的降解速率对于骨修复过程十分重要，过快的降解速率不足以在骨修复过程中提供良好的支撑，降解速率过缓则会延长材料残留时间并削弱长期再生效率[44-45]。此次研究所制备的单纯羟基磷灰石可提高大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，但作用效果并不明显，并表现出降解过缓的局限性，与以往的研究一致，验证了对纯羟基磷灰石进行功能化改性的必要性[46]。
锰是骨代谢中的必需微量元素，适量浓度的Mn2+可通过激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶等信号通路上调Runx2的表达，有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[47-48]。
参照李承瑜等[31]研究，选择5%，10%，15%为掺杂浓度将Mn2+引入羟基磷灰石中，经过表征分析可见Mn2+均匀分布在微球中，锰掺杂羟基磷灰石的晶体结构稳定，这与前人研究结果基本一致[49]。然而，高浓度Mn2+会降低细胞活性，抑制细胞增殖，甚至诱导细胞凋亡[50]。此次研究结果表明，10%，15%锰掺杂羟基磷灰石对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖表现出明显抑制作用，这可能与初期Mn2+的爆发性释放有关；5%锰掺杂羟基磷灰石则展现出良好的细胞相容性和显著增强的成骨诱导能力，该材料在体外实验中的碱性磷酸酶活性、矿化结节形成以及体内的新骨生成量均显著优于纯羟基磷灰石，证实了羟基磷灰石中低剂量的锰掺杂在促进骨修复中的积极作用，该结论也与VILLASEÑOR-CERÓN等[51]的研究结论相吻合。
聚多巴胺作为一种源于贻贝黏蛋白的仿生聚合物，因优异的表面黏附能力和化学稳定性在材料表面改性领域展现出巨大潜力[52-54]。聚多巴胺分子结构中的邻苯二酚官能团能与多种金属离子(包括Mn2+)发生配位螯合作用[55-56]，从而将离子锚定在材料表面，实现缓慢、可控释放[57]。实验表明，经聚多巴胺涂层修饰后的羟基磷灰石微球晶体结构并未发生改变，微球表面呈现粗糙纹理，这有利于骨髓间充质干细胞的黏附。此次实验发现，聚多巴胺涂层后的锰掺杂羟基磷灰石相较于锰掺杂羟基磷灰石降解速率略有加快，推测与稳定的无机羟基磷灰石基质不同，具有有机聚合物性质的聚多巴胺涂层在溶菌酶等作用下会发生缓慢降解，从而导致复合材料整体更快的质量损失。另外，经聚多巴胺涂层修饰后，高剂量锰掺杂羟基磷灰石的细胞毒性消失，这可能与聚多巴胺涂层有效缓解了Mn2+的释放速率有关。WESTHAUSER等[58]对5% 锰掺杂的介孔生物活性玻璃纳米颗粒(5Mn-MBGNs)进行了系统研究，发现材料不论是以0.1 mg/mL还是0.4 mg/mL的质量浓度与细胞共培养，细胞的碱性磷酸酶活性均低于对照组，说明材料在早期促成骨分化过程中存在着局限性。这一现象与体系内锰离子的释放行为密切相关，其实测释放速率稳定处于18.2 μmol/d的较高水平。鉴于介孔生物活性玻璃纳米颗粒与此次研究采用的羟基磷灰石在基质组成及溶解释放机制上存在本质差异，上述结论虽不宜直接类推，但研究结果至少提示在骨再生的早期阶段应尽量避免Mn2+在局部微环境中的长期高浓度累积。而此次研究将聚多巴胺涂层引入到锰掺杂羟基磷灰石体系中，有效调控了Mn2+的释放速率，使其28 d的Mn2+累计释放量不超过0.091 mmol/d，规避了持续浓度堆积可能对细胞活性及成骨过程所造成的潜在影响。考虑到骨修复是一个长期发展过程[59-60]，为了避免高浓度Mn2+可能造成的细胞毒性，选择5%锰离掺杂羟基磷灰石进行后续实验。在成骨性能方面，经聚多巴胺修饰后的羟基磷灰石相较于单纯羟基磷灰石能够在一定程度上促进成骨相关基因(Runx2)的表达及矿化结节形成，这是因为聚多巴胺对Ca2+具有强螯合能力，可在材料表面诱导羟基磷灰石的二次沉积，优化局部Ca/P微环境，从而利于大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[61]。
另外，聚多巴胺修饰前后的锰掺杂羟基磷灰石早期促成骨性能并没有显著差异，但是在成骨晚期和体内修复中，聚多巴胺修饰后的锰掺杂羟基磷灰石成骨性能显著优于未修饰组，推测经聚多巴胺修饰后所提供的持续、平稳的低剂量Mn2+微环境，能够更好地促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。在大鼠颅骨缺损模型中，聚多巴胺修饰后的锰掺杂羟基磷灰石组新生骨量显著优于其他实验组，与细胞实验结果相符，证明了锰掺杂羟基磷灰石/聚多巴胺复合材料具有良好的促成骨性能。
综上所述，此次研究成功构建了锰掺杂羟基磷灰石/聚多巴胺复合骨修复材料，材料通过聚多巴胺涂层修饰实现了Mn2+的可控缓释，不仅有效规避了高浓度Mn2+的潜在毒性，更在体外及体内实验中展现出良好的骨修复效能，为未来人工骨移植材料的合成提供思路。但该研究存在着一定的局限性：在去离子水中进行材料的离子释放实验，虽然排除了其他离子对Mn2+测量的干扰，能够更准确地评估材料中Mn2+释放特性，但是去离子水与人体复杂的生理环境有所差异，未来研究应考虑检测材料在模拟体液环境中的离子释放性能，从而更准确地模拟材料在体内的行为；锰掺杂羟基磷灰石/聚多巴胺复合骨修复材料促进大鼠骨髓间充质干细胞生物学性能的具体机制、信号通路等方面的研究尚未探讨，还有待后续进一步深入研究。尽管此次研究验证了锰掺杂羟基磷灰石/聚多巴胺复合骨修复材料具有良好的体外细胞相容性及体内促成骨性能，但是该在体内的长期生物安全性尚未得到验证，后续研究应该包括材料在体内的长期生物安全性评估，例如不同时间点组织病理学的观察、血清生化指标检测等，从而系统地评价材料的临床应用
前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

此次研究创新性地构建了锰羟基磷灰石/聚多巴胺复合骨修复材料，通过水热沉淀法及聚多巴胺自聚合反应合成了锰含量为5%，10%，15%的复合材料，旨在克服传统羟基磷灰石成骨性能不足的局限性，利用锰离子的可控释放来实现骨缺损的有效修复。表征结果显示复合材料呈微球状，晶体结构及粒径稳定，粒径分布在9.8-13µm范围内。聚多巴胺涂层能有效的降低锰离子的释放速率。体外实验证明：聚多巴胺涂层能够通过降低锰离子的释放速率显著降低高锰含量掺杂组的细胞毒性。5%锰含量的羟基磷灰石则展现出良好的生物相容性和显著增强的成骨诱导能力。体内实验中，聚多巴胺修饰后的含锰羟基磷灰石组新生骨量显著优于其他实验组，与细胞实验结果相符，证明了锰羟基磷灰石/聚多巴胺复合材料良好的促成骨性能。该复合材料兼具良好的生物相容性及体内外成骨性能，为口腔颌面部骨缺损修复材料的研发提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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