新型胶原膜修复大鼠颅骨缺损

doi:10.12307/2026.208

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (32): 8364-8371.doi: 10.12307/2026.208

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新型胶原膜修复大鼠颅骨缺损

杨平1，戚晓阳2，雷智杰3，陈一心1，2，邱旭升1，2，3

1南京中医药大学鼓楼临床医学院骨科，江苏省南京市 210008；2南京大学医学院附属鼓楼医院骨科，江苏省南京市 210008；3江苏大学鼓楼临床医学院骨科，江苏省南京市 210008

接受日期:2025-09-07 出版日期:2026-11-18 发布日期:2026-04-23
通讯作者: 邱旭升，博士，主任医师，南京中医药大学鼓楼临床医学院骨科，江苏省南京市 210008；南京大学医学院附属鼓楼医院骨科，江苏省南京市 210008；江苏大学鼓楼临床医学院骨科，江苏省南京市 210008
作者简介:杨平，男，1996年生，安徽省阜阳市人，汉族，硕士在读，主要从事骨缺损方面的研究。
基金资助:
南京市卫生科技发展专项项目(ZKX21029)，课题名称：骨引导膜的构建及其在长骨感染性大段骨缺损中的应用和相关机理研究，项目负责人：邱旭升

Novel collagen membrane in repairing skull bone defects in rats

Yang Ping1, Qi Xiaoyang2, Lei Zhijie3, Chen Yixin1, 2, Qiu Xusheng1, 2, 3

1Department of Orthopedics, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 3Department of Orthopedics, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Jiangsu University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Accepted:2025-09-07 Online:2026-11-18 Published:2026-04-23
Contact: Qiu Xusheng, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Jiangsu University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
About author:Yang Ping, Master candidate, Department of Orthopedics, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
Supported by:
Nanjing Municipal Health Science and Technology Development Special Project, No. ZKX21029 (to QXS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
引导骨再生技术：是口腔颌面外科常用的一种骨缺损修复技术，该技术的基本原理：根据各类组织细胞迁移速度不同的特点，将屏障膜置于软组织和骨缺损之间建立生物屏障，创造一个相对封闭的组织环境，阻止结缔组织细胞和上皮细胞进入骨缺损区，允许有潜在生长能力、迁移速度较慢的前体成骨细胞优先进入骨缺损区优势生长，同时保护血凝块，减缓压力，实现缺损区的骨修复性再生。
屏障膜：是引导骨再生技术中所使用的一种膜，用于隔离骨缺损区与周围软组织。屏障膜分为不可吸收屏障膜(如钛膜、膨体聚四氟乙烯膜)和可吸收屏障膜(如胶原膜)，不可吸收屏障膜有需要二次手术取出的缺点，而现有商用胶原膜存在机械强度差的缺点。

背景：引导骨再生技术常用的可吸收屏障膜——Bio-Gide胶原膜(猪皮来源)存在机械强度差、降解速度快的缺点，限制了它的临床应用。因此，研制理化性质更优的胶原膜具有重要意义。
目的：制备猪膀胱来源新型胶原膜，表征该膜的理化特性以及修复大鼠颅骨缺损的效果。
方法：①去除猪膀胱的浆膜层和部分肌肉层，制备新型胶原膜。表征新型胶原膜与Bio-Gide胶原膜的表面形貌、吸水率、孔隙率、降解率与拉伸弹性模量、极限载荷。②将大鼠骨髓间充质干细胞分别与新型胶原膜与Bio-Gide胶原膜共培养，以单独培养的细胞为对照，CCK-8法检测细胞增殖；成骨诱导后7 d，通过碱性磷酸酶染色评估成骨分化情况。③在18只SD大鼠颅骨矢状缝左右两侧各制作1个直径5 mm的圆形全层骨缺损，36个缺损部位随机分6组干预：对照组(n=6)缺损处不植入任何材料，Bio-Oss组(n=6)缺损处填充Bio-Oss骨粉，Bio-Gide组(n=6)缺损处覆盖Bio-Gide膜，新型胶原膜组(n=6)缺损处覆盖新型胶原膜，Bio-Oss+Bio-Gide组(n=6)缺损处填充Bio-Oss骨粉后覆盖Bio-Gide膜，Bio-Oss+新型胶原膜组(n=6)缺损处填入Bio-Oss骨粉后再覆盖新型胶原膜。术后12周取材，分别进行Micro-CT扫描与组织学观察。
结果与结论：①扫描电镜下可见Bio-Gide膜与新型胶原膜的致密层纤维较致密，Bio-Gide膜纤维交错走行，新型胶原膜纤维更加致密且连接成片，二者多孔层纤维较疏松，并且Bio-Gide膜孔隙更多。新型胶原膜的孔隙率、吸水率均低于Bio-Gide膜(P < 0.05)，拉伸弹性模量与极限载荷均高于Bio-Gide膜(P < 0.05)。②相较于Bio-Gide膜，新型胶原膜的降解更稳定。CCK-8检测显示，Bio-Gide膜与新型胶原膜均可促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖。碱性磷酸酶染色显示，Bio-Gide膜与新型胶原膜均不影响大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。③Micro-CT扫描结果显示，对照组骨缺损处有少量新骨形成，其他5组骨缺损处有大量新骨形成，其中Bio-Oss+新型胶原膜组新骨形成量与骨结构成熟度最佳。苏木精-伊红染色与Masson染色显示，对照组缺损区新生骨形成较少，其余5组缺损区新生骨形成较多，其中Bio-Oss+新型胶原膜组新生骨质密度更高、结构更成熟。④结果表明，新型胶原膜的理化特性优于Bio-Gide膜，在配合使用Bio-Oss骨粉时，新型胶原膜表现出比Bio-Gide膜更优的骨修复效果。
https://orcid.org/0009-0004-6290-4213 (杨平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 引导骨再生">, 新型胶原膜">, Bio-Gide膜">, 大鼠">, 颅骨缺损">, 骨髓间充质干细胞">, 疗效">, 微型计算机断层扫描

Abstract: BACKGROUND: The commonly used absorbable barrier membrane in guided bone regeneration technology is Bio-Gide collagen membrane (source of pig skin), which has the disadvantages of poor mechanical strength and fast degradation rate, thus limiting its clinical application. Therefore, it is of great significance to develop collagen membranes with better physicochemical properties.
OBJECTIVE: To prepare a novel collagen membrane derived from porcine bladder, characterize its physicochemical properties and its effect on repairing rat skull bone defects.
METHODS: (1) The serosal layer and partial muscle layer of porcine bladders were removed to prepare a novel collagen membrane. The surface morphology, water absorption, porosity, degradation rate, tensile modulus, and ultimate load of the novel and Bio-Gide collagen membranes were characterized. (2) Rat bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with the novel and Bio-Gide collagen membranes, respectively. Cells cultured alone were used as controls. Cell proliferation was assessed by CCK-8 assay. Osteogenic differentiation was assessed by alkaline phosphatase staining 7 days after osteogenic induction. (3) A 5-mm-diameter circular, full-thickness bone defect was created on each side of the sagittal suture of the skull in 18 SD rats. Thirty-six defect sites were randomly divided into six intervention groups: the control group (n=6) received no implantation at the defect site; the Bio-Oss group (n=6) had the defect filled with Bio-Oss bone powder; the Bio-Gide group (n=6) had the defect covered with a Bio-Gide membrane; the novel collagen membrane group (n=6) had the defect covered with a novel collagen membrane; the Bio-Oss+Bio-Gide group (n=6) had the defect filled with Bio-Oss bone powder and then covered with a Bio-Gide membrane; and the Bio-Oss+novel collagen membrane group (n=6) had the defect filled with Bio-Oss bone powder and then covered with a novel collagen membrane. Twelve weeks after surgery, the tissue samples were harvested for micro-computed tomography and histological observation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy revealed that the fibers in the compact layers of the Bio-Gide and novel collagen membranes were denser, with the fibers in the Bio-Gide membrane interlaced. The fibers in the novel collagen membrane were denser and connected into sheets. The fibers in the porous layers of both membranes were looser, with the Bio-Gide membrane having more pores. The porosity and water absorption of the novel collagen membrane were lower than those of the Bio-Gide membrane (P < 0.05), while the tensile elastic modulus and ultimate load were higher than those of the Bio-Gide membrane (P < 0.05). (2) Compared with the Bio-Gide membrane, the novel collagen membrane was more stable to degradation. CCK-8 assay showed that both the Bio-Gide and novel collagen membranes promoted the proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Alkaline phosphatase staining revealed that neither the Bio-Gide nor the novel collagen membranes affected the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. (3) Micro-computed tomography revealed a small amount of new bone formation at the bone defect site in the control group, while substantial new bone formation was observed in the other five groups. The Bio-Oss+novel collagen membrane group demonstrated the greatest amount of new bone formation and structural maturity. Hematoxylin-eosin and Masson staining revealed less new bone formation at the defect site in the control group, while more was observed in the other five groups. The Bio-Oss+novel collagen membrane group demonstrated higher new bone density and more mature structure. (4) The results demonstrated that the novel collagen membrane exhibited superior physical and chemical properties to the Bio-Gide membrane. When combined with Bio-Oss bone powder, the novel collagen membrane demonstrated superior bone repair efficacy compared with the Bio-Gide membrane.

Key words: guided bone regeneration">, novel collagen membrane">, Bio-Gide membrane">, rat">, skull bone defect">, bone marrow mesenchymal stem cell">, efficacy">, micro-computed tomography

中图分类号:

杨平, 戚晓阳, 雷智杰, 陈一心, 邱旭升. 新型胶原膜修复大鼠颅骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(32): 8364-8371.

Yang Ping, Qi Xiaoyang, Lei Zhijie, Chen Yixin, Qiu Xusheng. Novel collagen membrane in repairing skull bone defects in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(32): 8364-8371.

图/表（结果） 9

2.1 胶原膜的表面形貌观察结果 Bio-Gide膜与新型胶原膜表面形态的外观照、倒置光学显微镜及扫描电镜观察结果，如图2所示。倒置光学显微镜及扫描电镜显示两种膜的致密层纤维都比较致密，Bio-Gide膜纤维交错走行，新型胶原膜纤维更加致密且连接成片；两者多孔层纤维都比较疏松，相对而言，Bio-Gide膜孔隙更多。如图3所示，Bio-Gide膜的孔隙率与吸水率均高于新型胶原膜(P < 0.05，P < 0.01)，两种膜的厚度相近。

2.2 胶原膜的降解率检测结果如图4所示，Bio-Gide膜与新型胶原膜在PBS中均发生降解。Bio-Gide膜在第1，2，3周的降解率分别为(27.56±2.45)%，(64.04±1.40)%，(96.01±2.47)%，表现出较快的降解趋势，初期降解较明显，3周后残留质量较少；新型胶原膜在第1，2，3周的降解率分别为(19.56±4.20)%，(57.38±0.74)%，(87.91±2.68)%，降解速率相对较缓，特别是在第3周，新型胶原膜残留质量高于Bio-Gide膜。降解曲线显示新型胶原膜的降解更为稳定，具有较好的持久性，说明新型胶原膜在组织修复中可能提供更长时间的支撑作用，适合长期的引导组织再生应用。

2.3 胶原膜的生物力学测试结果如图5所示，Bio-Gide膜的断裂载荷低于新型胶原膜[(13.2±2.1)，(19.3±3.0) N，P < 0.05]，弹性模量低于新型胶原膜[(9.2±1.4)， (86.7±2.1) MPa，P < 0.001]，表明表明新型胶原膜表现出更优异的弹性和刚性。

2.4 胶原膜对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响检测结果如图6所示，培养24 h，3组细胞增殖率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养48 h，Bio-Gide膜组、新型胶原膜组细胞增殖率高于对照组(P < 0.05)；培养72 h，Bio-Gide膜组、新型胶原膜组细胞增殖率高于对照组(P < 0.01)。成骨诱导培养7 d后的碱性磷酸酶染色结果显示，3组间碱性磷酸酶相对染色强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7。

2.5 胶原膜修复颅骨缺损实验结果
2.5.1 实验动物数量分析 18只SD大鼠全部进入结果分析。
2.5.2 各组大鼠颅骨缺损处Micro-CT三维重建及分析术后12周各组大鼠颅骨缺损区Micro-CT三维重建分析结果，见图8。结果显示，对照组颅骨缺损处有少量新骨形成，Bio-Oss组次之，其他4组颅骨缺损处均有大量新骨形成。新型胶原膜组颅骨缺损处骨体积分数、骨表面积和骨体积比值与Bio-Gide膜组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，新型胶原膜组颅骨缺损处骨体积分数、骨表面积和骨体积比值与Bio-Oss+Bio-Gide膜组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，Bio-Oss+新型胶原膜组颅骨缺损处骨体积分数高于Bio-Oss+Bio-Gide膜组(P < 0.05)，Bio-Oss+新型胶原膜组骨表面积和骨体积比值低于Bio-Oss+Bio-Gide膜组(P < 0.05)，表明Bio-Oss+新型胶原膜组在新骨形成量及骨结构成熟度方面均表现出最佳效果，显示出优异的骨再生促进作用。

2.5.3 各组大鼠颅骨标本组织学切片观察结果术后12周各组大鼠颅骨标本组织学切片苏木精-伊红染色与Masson染色结果，见图9。苏木精-伊红染色与Masson染色结果显示，5组未见明显炎症反应细胞，对照组缺损区域存在腔隙，仅见少量新生骨形成，并且缺损区域被大量纤维结缔组织填充；Bio-Gide膜组与新型胶原膜组缺损区域均观察到少量纤维组织，并且均有一定量的新生骨形成，提示膜引导在促进骨再生方面发挥一定作用；Bio-Oss+新型胶原膜组、Bio-Oss+Bio-Gide膜组缺损区域新骨生成量多于Bio-Gide膜组与新型胶原膜组，其中Bio-Oss+新型胶原膜组缺损区域新骨形成效果最为显著，新生骨质密度更高、结构更为致密且成熟，显示出较好的骨再生效果。

2.5.4 各组大鼠主要器官组织切片苏木精-伊红染色结果见图10。苏木精-伊红染色结果显示，各组大鼠心脏组织中心肌纤维排列整齐，未见坏死、炎症浸润或间质水肿等病理改变；各组大鼠肝脏中肝细胞结构完整，围绕门静脉中心放射状排列，细胞质均匀，核仁清晰，未观察到炎症细胞浸润、坏死或充血现象；各组大鼠脾脏组织结构正常，脾体和脾窦形态完整，未见坏死或病理性改变；各组大鼠肺组织肺泡壁薄而光滑，肺泡结构完整，未见明显炎症细胞浸润或充血现象；各组大鼠肾脏组织中肾小球结构完整、肾小管排列正常，未观察到坏死、充血或炎症浸润、以上结果提示新型胶原膜及其他材料对大鼠主要器官无明显毒性作用。

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引言

较大面积的骨缺损治疗具有一定的挑战性[1-2]。引导骨再生技术是口腔颌面外科中常用的一种骨缺损修复技术[3-5]，该技术的原理是：根据各类组织细胞迁移速度不同的特点，将屏障膜置于软组织和骨缺损之间建立生物屏障，创造一个相对封闭的组织环境，阻止结缔组织细胞和上皮细胞进入骨缺损区，允许有潜在生长能力、迁移速度较慢的前体成骨细胞优先进入骨缺损区优势生长，同时保护血凝块，减缓压力，实现缺损区的骨修复性再生。屏障膜对于引导骨再生技术至关重要[6-8]，它可分为不可吸收屏障膜和可吸收屏障膜[7]。不可吸收性屏障膜(如钛膜[9]、膨体聚四氟乙烯膜膜[10])的机械强度大、骨缺损修复效果好，但需要二次手术取出，增加了患者的创伤和医疗费用。因此，临床上应用更广泛的是可吸收屏障膜，其中最常见的是胶原膜[11-13]，它具有良好的生物相容性和组织再生能力。
目前临床上广泛使用的胶原膜已取得良好效果，但仍存在机械强度差、无抗菌性、成骨性能不佳等问题[11]，因此，学者们还在不断探索新的引导骨再生屏障膜。近年来，屏障膜的改性包括赋予其抗菌性和成骨性等[14-17]，也有研究开发全新材料的屏障膜[18]。针对胶原膜机械强度差这一缺点，学者们主要采用交联法以提高胶原膜的力学性能[11]，文献中报道的交联方法包括化学交联[19]、物理交联和酶交联[20-21]。然而，胶原纤维的高交联度与较高的暴露率有关，同时还增加了胶原膜吸收过程中的异物反应[11]。因此，寻找其他方法以提高胶原膜的力学性能仍值得研究。
目前临床使用的胶原膜主要来源于与人类胶原高度同源的哺乳动物皮肤、肌腱和心包膜[22]，如临床最常用的进口胶原膜Bio-Gide膜来源于猪皮[23-24]，国产胶原膜海奥口腔修复膜来源于猪皮[25]、博纳格生物膜来源于猪心包膜[26]、瑞盛生物膜来源于牛心包膜[27]、吉特瑞生物膜来源于牛跟腱[28]。不同来源的胶原在结构和组成上存在很大差异，这也极大地影响了胶原膜在体内的细胞反应、降解模式和力学性能[29]。此次研究的合作单位吾奇生物医疗科技(江苏)有限公司研制了一种猪膀胱来源新型胶原膜，该文主要表征该膜的理化特性以及修复大鼠颅骨骨缺损的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料的制备与表征，体外细胞学实验，随机分组动物实验。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至 2024年6月在南京医科大学附属南京医院动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料与试剂 Bio-Gide、Bio-Oss(Geistlich-Pharma，瑞士)；α-MEM 培养基、青霉素-链霉素溶液、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA(Gibco，美国)；CCK-8 试剂盒(Dojindo，日本)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天生物技术，中国)；EDTA 脱钙溶液(Servicebio，中国)；苏木精和伊红(Beyotime，中国)；Masson三色染色液(Solarbio，中国)。
1.3.2 主要仪器倒置光学显微镜(Carl Zeiss，德国)；扫描电子显微镜(Carl Zeiss，德国)；VMR小动物专用吸入麻醉机(MATRX，美国)；数字化口腔X射线成像仪 (Handy Dentist，中国)；Micro-CT 扫描仪(SCANCO，瑞士)；生物力学拉伸扭转疲劳仪(Instron E3000，Instron Console，Wave Matrix and Blue Hill System，MA，美国)；细胞培养箱(Thermo Fisher ，美国)；石蜡包埋机(Leica，德国)；石蜡切片机(Leica，德国)；恒温干燥箱(实贝，中国)；小型骨科环钻(烁蒂，中国)；无菌细胞超净台(Thermo Fisher ，美国)；生物安全柜(Thermo Fisher ，美国)；离心机(Thermo Fisher ，美国)；冷冻干燥机(永合创信，中国)；水浴锅(数显，中国)。
1.3.3 实验动物 SPF级雄性SD大鼠18只，10周龄，体质量260-280 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SYXK(京)2024-0010。大鼠在水和食物供应充足、温度25 ℃、湿度50%-60%的环境下饲养。实验方案已通过南京医科大学附属南京医院动物伦理委员会批准 (审批号：DWSY-22102228)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.4 实验方法
1.4.1 新型胶原膜的制备 6只长白猪(8-10月龄，体质量90-100 kg)膀胱购自南京阳光养殖中心。采用片皮机除去猪膀胱的浆膜层和部分肌肉层，进行以下处理：加入到2%胰蛋白酶溶液(膀胱质量与胰蛋白酶溶液体积的比例为1 g∶10 mL)中于37 ℃浸泡4 h，加入到含2% Tween-20和3%乙酰半胱氨酸混合溶液(膀胱质量与混合溶液体积的比例为1 g∶10 mL)中于25 ℃浸泡16 h，加入到含有2%多糖酶、0.5%DNA酶、0.5%RNA酶和2%木瓜蛋白酶混合酶溶液(膀胱质量与混合溶液体积的比例为1 g∶10 mL)中于37 ℃处理12 h，采用超临界二氧化碳清洗2 h
得到胶原膜，清洗压力为25 MPa、温度为40 ℃、CO2流量为5 L/min。冷冻干燥和辐照灭菌(10-15 kGy)后得到胶原膜成品，它与Bio-Gide膜类似，同样分致密层和多孔层。
1.4.2 胶原膜的表面形貌观察将Bio-Gide膜与新型胶原膜处理成1 cm×1 cm大小，使用倒置光学显微镜进行观察。两胶原膜经喷涂金属涂层处理后，通过扫描电镜(25 kV)观察致密层和多孔层的表面结构；观察多孔层时，随机取多个视野，采用图像处理软件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics公司，美国)计算孔隙率。
1.4.3 胶原膜的吸水率检测将Bio-Gide膜与新型胶原膜切成12 mm×8 mm大小的长方形。在干燥状态下称量每种膜的质量(m0)，然后浸入生理盐水中，置于4 ℃冰箱中保存。24 h后，用干净的纱布吸去膜表面的生理盐水，称量质量(m1)，计算吸水率。
吸水率= (m1-m0)/m0×100%
1.4.4 胶原膜的降解率检测将Bio-Gide膜与新型胶原膜处理为同等规格大小，干燥状态下称量每种膜的质量(m0)，然后分别置于35 mm×12 mm无菌培养皿中，分别加入5 mL PBS，每种膜3份样本。每隔1周，用干净的纱布吸去膜表面的生理盐水，称量膜质量(mx)，计算降解率。
降解率= (m0-mx)/m0×100%
1.4.5 胶原膜的生物力学测试将Bio-Gide膜与新型胶原膜切成30 mm×10 mm大小的长方形，通过电子式疲劳测试仪器进行拉伸测试，初始拉伸长度均为8 mm，采用速率控制方式进行，加载速率为5 mm/min，记录载荷-位移曲线，测量弹性模量和膜断裂时的极限载荷。
1.4.6 胶原膜对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响
大鼠骨髓间充质干细胞的培养：大鼠骨髓间充干细胞(北京斯贝福生物技术有限公司)的培养基为含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基，置于CO2培养箱中于37 ℃下培养，按 1∶3 比例传代。选择第3-5代细胞进行后续实验。
CCK-8法检测细胞增殖：①膜的预处理[30]：将Bio-Gide膜与新型胶原膜切成合适大小，多孔层朝上，置于96孔板中，1%PBS冲洗3次，吸弃冲洗液；体积分数75%乙醇浸泡30 min，1%PBS冲洗3次，每次5 min；α-MEM培养基浸泡过夜，吸弃液体。②实验分组与处理：消化大鼠骨髓间充干细胞，吹散成单层细胞悬液后接种于96孔板中，分别与Bio-Gide膜、新型胶原膜共培养，以单独培养的细胞为对照，每组设置3个平行孔，细胞密度为5×103/孔，加入含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的α-MEM培养基，置于CO2培养箱于37 ℃下孵育，隔天换液。培养24，48，72 h后，每孔加入CCK-8试剂后置于CO2培养箱于37 ℃培养1h，取每孔上清液置入新的96孔板中，使用Multiskan GO酶标仪在450 nm波长处测量吸光度(A)值，计算细胞增殖率。空白组仅加入含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基(无细胞)。
细胞增殖率 (%) = (实验组A值-空白组A值) / (对照组A值-空白组A值)×100%
成骨诱导后碱性磷酸酶染色：将Bio-Gide膜与新型胶原膜切成合适大小，多孔层朝上，置于6孔板中，预处理同上。将大鼠骨髓间充质干细胞悬液接种于6孔板中，分别与Bio-Gide膜、新型胶原膜共培养，以单独培养的细胞为对照，细胞密度为3×105/孔，加入成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素、20 mmol/L β-甘油磷酸盐、50 mg/L抗坏血酸、0.1 mmol/L 地塞米松的α-MEM培养基)。成骨诱导培养7 d后，加入碱性磷酸酶染色液室温避光孵育30 min，PBS清洗后至光学显微镜下观察并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0软件计算染色强度。
1.4.7 胶原膜修复颅骨缺损实验
大鼠颅骨缺损模型的建立：将Bio-Gide膜与新型胶原膜经辐照灭菌后裁剪成5 mm×5 mm大小的正方形，备用。SD大鼠经适应性饲养3 d后开始实验。腹膜内注射2%戊巴比妥钠2 mL/kg麻醉大鼠，手术区域进行备皮、碘伏消毒，沿颅中缝做一长约2 cm的纵行切口，分离至骨面，使用直径5 mm的牙科环形钻在颅骨矢状缝左右两侧各制作1个直径为 5 mm的圆形全层骨缺损，保持硬脑膜的完整性，36个缺损部位随机分6组干预：对照组(n=6)缺损处不植入任何材料；Bio-Oss组(n=6)缺损处填充Bio-Oss骨粉；Bio-Gide组(n=6)缺损处覆盖Bio-Gide膜，周围用丝线与软组织固定；新型胶原膜组(n=6)缺损处覆盖新型胶原膜，周围用丝线与软组织固定；Bio-Oss+Bio-Gide组(n=6)缺损处填充Bio-Oss骨粉后覆盖Bio-Gide膜，多孔层朝向骨粉，周围用丝线与软组织固定；Bio-Oss+新型胶原膜组(n=6)缺损处填入Bio-Oss骨粉后再覆盖新型胶原膜，多孔层朝向骨粉，周围用丝线与软组织固定(图1)。逐层缝合切口。
大鼠颅骨取材和Micro-CT分析：术后12周，腹腔注射过量戊巴比妥钠处死大鼠，获取大鼠颅骨标本及主要脏器(心、肺、脾、肝、肾)，40 g/L多聚甲醛固定颅骨标本48 h，进行Micro-CT扫描，扫描参数为：70 kV电压、分辨率为18.38 μm，通过多平面重组获得三维图像，确定骨体积分数与骨表面积和骨体积比值。
组织学观察：颅骨标本经EDTA脱钙处理12周，石蜡包埋固定，将包埋后的蜡块按5 μm厚度切片，进行苏木精-伊红染色与Masson染色，倒置光学显微镜下观察。40 g/L多聚甲醛固定心、肺、脾、肝、肾标本24 h，进行苏木精-伊红染色，检测新型胶原膜的器官毒性。
1.5 主要观察指标新型胶原膜与Bio-Gide胶原膜的表面形貌、吸水率、孔隙率、降解率与拉伸弹性模量、极限载荷，两种膜对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响；两种膜修复大鼠颅骨缺损的效果。

1.6 统计学分析数据以x±s表示，体外实验基于3个独立重复的结果，动物实验数据均基于6个独立标本的结果。采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学处理，采用GraphPad Prism 8.4.0软件完成统计图表的绘制。两组或多组计量资料采用t检验或方差分析，两组间均数比较采用两独立样本的t检验，多个样本间进行两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经南京鼓楼医院生物统计学专家审核。

讨论

临床上用于引导骨再生技术最常用的屏障膜是膨体聚四氟乙烯[10]、Bio-Gide胶原膜[23-24]。膨体聚四氟乙烯虽然机械强度大、骨修复效果好，但在固定时需要额外的材料，同时还需要二次取出[10]；而Bio-Gide胶原膜因良好的生物相容性及再生能力、不用二次手术逐渐被广泛使用，但它的降解速率快、机械强度差[23-24]。此次研究探索了新型胶原膜与Bio-Gide胶原膜用于修复大鼠颅骨骨缺损的疗效及安全性，为潜在的临床应用提供理论基础。
新型胶原膜与Bio-Gide胶原膜的厚度相当，同样分为致密层和多孔层。扫描电镜结果显示，Bio-Gide膜致密层可见纤维交错走行，但新型胶原膜纤维更加致密、连接成片；而新型胶原膜多孔层的孔隙更少、孔隙率更小[Bio-Gide膜的孔隙率为(36.2±5.6)%，新型胶原膜的孔隙率为(17.4±7.0)%]，新型胶原膜的这些特性可能是他力学性能提升的主要原因。力学性能的提升提示，新型胶原膜在机械强度方面更加接近不可吸收屏障膜，结合新型胶原膜更慢的降解速度，能够为骨细胞的生长提供更加可靠的生长环境。另一方面，新型胶原膜较低的孔隙率和吸水性理论上是不利于细胞爬行生长的，但是与它提供的可靠内部微环境而言，该材料的不利影响可能微不足道。胶原膜力学性能的提升到什么程度是最有利于引导骨再生的，可能是未来值得研究的一个方向。
动物实验Micro-CT扫描结果表明，单纯新型胶原膜的引导骨再生效果略好于Bio-Gide胶原膜，但是没有达到显著差异，但是新型胶原膜结合Bio-Oss可吸收骨材料引导骨再生效果好于Bio-Gide胶原膜结合Bio-Oss可吸收骨材料。苏木精-伊红染色结果进一步印证了Micro-CT扫描结果，这一结果表明新型胶原膜在引导骨再生方面的效果并不亚于Bio-Gide胶原膜，在结合Bio-Oss可吸收骨材料的情况下甚至优于Bio-Gide胶原膜，这可能与新型胶原膜的孔隙率更小、机械强度更大、降解速度更慢的理化特性有关。单纯新型胶原膜引导骨再生的效果略好于Bio-Gide胶原膜，但是没有达到显著性差异，其原因可能是样本量偏少；当内部骨缺损区域填充了Bio-Oss可吸收骨材料后，新型胶原膜引导骨再生的效果被放大，从而显著强于Bio-Gide胶原膜。
体外细胞增殖实验表明，新型胶原膜促进细胞增殖方面的效果与Bio-Gide胶原膜相仿，未表现出抑制细胞增长的不良作用。动物实验颅骨缺损处与各主要脏器苏木精-伊红染色结果表明，新型胶原膜与Bio-Gide胶原膜都没有明显的炎症反应，同时新型胶原膜与Bio-Gide胶原膜对大鼠主要脏器都没有明显的毒副作用，表明新型胶原膜在生物安全性方面与Bio-Gide胶原膜相当。
不同来源的胶原在结构和组成上存在很大差异，这也导致胶原膜在体内的细胞反应、降解模式和力学性能有所不同[29]。尽管天然猪皮胶原蛋白膜在生物降解模式上表现出时间上的差异，但与从其他组织或动物来源获得的材料的膜相比，这种膜似乎降解得更快[31]。心包膜来源的胶原膜包含了波浪状、多向分布的胶原纤维，它通常表现出优异的多向抗撕裂性[32]。此次研究从猪膀胱提纯研制的新型胶原膜，它的力学性能优于猪皮来源Bio-Gide胶原膜，降解速度慢于Bio-Gide胶原膜，从一定程度上解决了现有胶原膜机械强度差、降解速度快的问题。除了哺乳动物作为胶原膜来源之外，文献中也有尝试采用海洋动物来源胶原膜的研究，如王莉莉等[30]研究了东华大学自研的鱼胶原做为引导骨再生屏障膜，发现鱼胶原膜体内外促进骨再生的效果不如猪胶原膜组，不太适合作为引导骨再生屏障膜。
该研究存在一些局限性：动物实验未设术后4，8周取材点，无法动态观察骨再生的过程；未对胶原膜促进骨再生的分子机制进行深入研究，比如成骨分化以及相关信号通路的蛋白与基因检测，后续研究需要添加相关的实验设计；研究的安全性能测试只进行了器官毒性检测，没有进行血液学检测，在未来进行临床前研究时也需要增加相关内容。
综上所述，相较于Bio-Gide胶原膜，新型胶原膜的孔隙率更小、机械强度更大、降解率更慢，修复大鼠颅骨骨缺损方面的效果与Bio-Gide胶原膜相当；而在结合Bio-Oss可吸收骨材料时，新型胶原膜修复骨缺损的效果优于Bio-Gide胶原膜，同时新型胶原膜的生物安全性与Bio-Gide胶原膜相当。因此，此次研究的新型胶原膜有作为引导骨再生屏障膜的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

新型胶原膜修复大鼠颅骨缺损

Novel collagen membrane in repairing skull bone defects in rats

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