镁植入物激活整合素α10β1促进骨膜干细胞成骨分化的作用机制

doi:10.12307/2026.456

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (32): 8319-8326.doi: 10.12307/2026.456

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镁植入物激活整合素α10β1促进骨膜干细胞成骨分化的作用机制

杨彦军，朱林，顾永春，言湛军

苏州大学附属苏州九院，江苏省苏州市 215200

接受日期:2026-02-05 出版日期:2026-11-18 发布日期:2026-04-23
通讯作者: 言湛军，博士，主任医师，苏州大学附属苏州九院，江苏省苏州市 215200 顾永春，博士，主任医师，苏州大学附属苏州九院，江苏省苏州市 215200
作者简介:杨彦军，女，1987年生，山东省聊城市人，汉族，博士，助理研究员，主要从事骨膜干细胞成骨分化研究。
基金资助:
江苏省健康委-医学科研项目(Z2022082)，项目负责人，杨彦军；苏州市-医疗卫生应用基础研究项目(SKJYD2021027)，项目负责人：杨彦军；苏州市-民生科技项目(SYSD2018042)，项目负责人：言湛军；吴江区卫健委“科教兴卫”项目(WWK202005)，项目负责人：言湛军

Mechanism by which magnesium implant-activated integrin α10β1 promotes osteogenic differentiation of periosteal stem cells

Yang Yanjun, Zhu Lin, Gu Yongchun, Yan Zhanjun

Suzhou Ninth Hospital Affiliated to Soochow University, Suzhou 215200, Jiangsu Province, China

Accepted:2026-02-05 Online:2026-11-18 Published:2026-04-23
Contact: Yan Zhanjun, MD, Chief physician, Suzhou Ninth Hospital Affiliated to Soochow University, Suzhou 215200, Jiangsu Province, China Gu Yongchun, MD, Chief physician, Suzhou Ninth Hospital Affiliated to Soochow University, Suzhou 215200, Jiangsu Province, China
About author:Yang Yanjun, MD, Assistant researcher, Suzhou Ninth Hospital Affiliated to Soochow University, Suzhou 215200, Jiangsu Province, China
Supported by:
Jiangsu Provincial Health Commission Research Project, No. Z2022082 (to YYJ); Suzhou Basic Research Program for Medical and Health Application, No. SKJYD2021027 (to YYJ); Suzhou Municipal Livelihood Technology Program, No. SYSD2018042 (to YZJ); the Ke Jiao Xing Wei Plan of Wujiang District Health Commission, No. WWK202005 (to YZJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨膜干细胞：是一类具有高增殖、迁移和成骨潜能的细胞群体，具有骨骼干细胞的关键特征，并表达与干细胞特性及四肢或骨骼系统发育相关的基因集，甚至比骨髓干细胞具有更高的再生潜能。
整合素：是一类依赖于Mg2+或Ca2+的异型细胞黏附分子。整合素是由α和β亚基通过非共价键结合形成的异源二聚体，通过介导细胞和细胞、细胞和细胞外基质之间相互识别和黏附、跨膜传递信息、激活下游基因表达等，参与和细胞形态、生长、分化、增殖和凋亡有关的多种生理过程。

背景：骨膜干细胞是镁诱导新骨形成的关键细胞群。整合素α10β1是一类依赖Mg2+的异型细胞黏附分子，Mg2+可与整合素α10β1中的MIDAS结构域结合，作为分子开关调控下游生物学过程。
目的：探究镁基植入物通过激活整合素α10β1调控骨膜干细胞成骨分化的机制。
方法：将42只C57BL/6小鼠随机分为钛棒植入组(n=21)与镁棒植入组(n=21)，分别在左侧膝关节股骨髁间窝骨髓腔内植入钛棒、镁棒，术后3 d取材，Tunel染色观察植入物周围细胞凋亡情况，Edu染色观察皮质骨增厚区域细胞增殖活性；术后14 d取材，Micro-CT分析股骨皮质骨增厚成骨情况，苏木精-伊红染色观察股骨皮质骨增厚区新生骨形态结构，钙黄绿素荧光双标染色分析骨膜干细胞成骨分化情况，qPCR检测成骨标志基因Runx2、成骨细胞特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白以及整合素α10、整合素β1表达，Western blot检测整合素α10、整合素β1、黏着斑激酶及磷酸化黏着斑激酶蛋白表达，转录组测序分析Wnt/β-catenin、丝裂原活化蛋白激酶信号通路表达以及整合素α10β1与成骨基因表达之间的相关性。
结果与结论：①Tunel染色与Edu染色显示，钛棒周围聚集大量凋亡细胞，骨膜区域仅见少量增殖细胞，无成骨分化；镁棒周围无凋亡细胞，骨膜增厚区域增殖细胞明显增多。②Micro-CT分析显示，钛棒未降解，镁棒降解明显，镁棒植入组皮质骨增厚成骨情况优于钛棒植入组。苏木精-伊红与钙黄绿素荧光双标染色显示，镁棒植入组皮质骨增厚成骨情况优于钛棒植入组。qPCR检测结果显示，镁棒植入组Runx2、成骨细胞特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、整合素α10、整合素β1 mRNA表达高于钛棒植入组；Western blot检测结果显示，整合素α10、整合素β1、黏着斑激酶及磷酸化黏着斑激酶蛋白以及Wnt/β-catenin表达高于钛棒植入组，丝裂原活化蛋白激酶表达低于钛棒植入组。转录组测序分析显示，整合素α10β1 与Runx2、成骨细胞特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白表达具有显著的正相关性。③结果表明，镁基植入物通过激活整合素 α10β1-黏着斑激酶/磷酸化黏着斑激酶信号通路上调Wnt/β-catenin信号、抑制部分丝裂原活化蛋白激酶信号，从而促进骨膜骨干细胞的成骨分化。
https://orcid.org/0009-0006-2689-7188 (杨彦军)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 镁植入物, 整合素α10β1, 成骨分化, 骨膜干细胞, 骨再生, Wnt/β-catenin信号通路, 骨修复, 骨质疏松

Abstract: BACKGROUND: Periosteal stem cells are the key cellular population in magnesium-induced osteogenesis. Integrin α10β1 is a magnesium-dependent heterodimeric adhesion molecule. Mg²⁺ binds to the MIDAS domain of integrin α10β1, functioning as a molecular switch to regulate downstream biological processes.
OBJECTIVE: To elucidate the mechanism by which magnesium-based implants regulate osteogenic differentiation of periosteal stem cells by activating integrin α10β1.
METHODS: Forty-two C57BL/6 mice were randomly divided into a titanium rod implantation group (n=21) and a magnesium rod implantation group (n=21). Titanium rods and magnesium rods were implanted into the medullary cavity of the intercondylar fossa of the left knee joint femur, respectively. Three days post-surgery, samples were collected for TUNEL staining to observe cell apoptosis around the implants. EdU staining was utilized to observe cell proliferation activity in the cortical bone thickening area. Fourteen days post-surgery, samples were collected for Micro-CT analysis of cortical bone thickening and osteogenesis. Hematoxylin-eosin staining was applied to observe the morphology and structure of newly formed bone in the cortical bone thickening area. Calcein green fluorescent double staining was employed to analyze the osteogenic differentiation of periosteal stem cells. qPCR was used to detect the expression of osteogenic marker genes Runx2, osteoblast-specific transcription factor, alkaline phosphatase, osteopontin, and integrin α10 and integrin β1. Western blot assay was utilized to detect the expression of integrin α10, integrin β1, focal adhesion kinase and phosphorylated focal adhesion kinase proteins. Transcriptome sequencing was applied to analyze the expression of Wnt/β-catenin and mitogen-activated protein kinase signaling pathways and the correlation between integrin α10β1 and osteogenic gene expression.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) TUNEL staining and EdU staining showed a significant accumulation of apoptotic cells around the titanium rods, with only a few proliferating cells observed in the periosteum and no osteogenic differentiation. In contrast, no apoptotic cells were found around the magnesium rods, and a marked increase in proliferating cells was observed in the thickened periosteal region. (2) Micro-CT analysis revealed that the titanium rods did not degrade, while the magnesium rods showed significant degradation. The magnesium rod implantation group exhibited superior cortical bone thickening and osteogenesis compared with the titanium rod implantation group. Hematoxylin-eosin staining and calcein green fluorescence double staining further confirmed that osteogenesis was more pronounced in the magnesium rod implantation group. qPCR results indicated that the mRNA expression of Runx2, osteoblast-specific transcription factors, alkaline phosphatase, osteopontin, integrin α10, and integrin β1 was higher in the magnesium rod implantation group compared with the titanium rod implantation group. Western blot results showed higher expression of integrin α10, integrin β1, focal adhesion kinase (FAK), phosphorylated focal adhesion kinase, and Wnt/β-catenin in the magnesium rod implantation group, whereas mitogen-activated protein kinase (MAPK) expression was lower than in the titanium rod implantation group. Transcriptome sequencing analysis revealed a significant positive correlation between integrin α10β1 and the expression of Runx2, osteoblast-specific transcription factors, alkaline phosphatase, and osteopontin. (3) Conclusion: The results suggest that magnesium-based implants promote osteogenic differentiation of periosteal stem cells by activating the integrin α10β1-focal adhesion kinase/phosphorylated focal adhesion kinase signaling pathway. This activation upregulates Wnt/β-catenin signaling and inhibits certain MAPK signaling pathways, thus facilitating osteogenesis.

Key words: magnesium implants, integrin α10β1, osteogenic differentiation, periosteal stem cells, bone regeneration, Wnt/β-catenin signaling pathway, bone repair, osteoporosis

中图分类号:

杨彦军, 朱林, 顾永春, 言湛军. 镁植入物激活整合素α10β1促进骨膜干细胞成骨分化的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(32): 8319-8326.

Yang Yanjun, Zhu Lin, Gu Yongchun, Yan Zhanjun. Mechanism by which magnesium implant-activated integrin α10β1 promotes osteogenic differentiation of periosteal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(32): 8319-8326.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 42只小鼠全部结果分析。
2.2 两组小鼠股骨样本Micro-CT扫描及分析结果 Micro-CT扫描结果显示，镁棒植入组股骨皮质骨较钛棒植入组更为肥厚和宽大(图1A)，旧皮质骨外侧覆盖一层明显增厚的新生骨组织。从表面形态来看，钛棒保持均匀完整，而镁棒表面呈参差不齐的锯齿状，可见明显降解迹象(图1B)。定量分析结果显示，镁棒植入组骨体积、组织体积和皮质骨厚度均高于钛棒植入组(P < 0.05，P < 0.01)，骨密度低于钛棒植入组(P < 0.01)；两组间骨体积分数比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1C。由此可见，镁植入物有助于成骨分化。

2.3 两组小鼠股骨样本组织学染色结果 Tunel染色显示，钛棒周围可见大量红色标记的凋亡细胞，骨膜区域仅有零星凋亡细胞分布，而镁棒周围及骨膜增厚区域均未观察到凋亡细胞(图2A)。
Edu染色显示，镁棒植入组骨膜增厚区域的细胞增殖表达量显著高于钛棒植入组(图2B)。
苏木精-伊红染色显示，钛棒植入组未见新生骨结构形成，而镁棒植入组皮质骨外侧出现明显增厚的新生骨样组织，新生骨排列紧密，呈不规则网状，内部可见少量骨髓细胞(图2C)。与苏木精-伊红染色结果一致，钙黄绿素荧光染色显示，镁棒植入组可见大量绿色荧光成骨信号覆盖整个骨膜增厚区域，而钛棒植入组未见明显信号(图2D)。
结果表明，镁棒在植入早期可显著减少周围细胞凋亡、促进细胞增殖，并诱导新骨形成。

2.4 各组小鼠股骨样本qPCR检测结果结果显示，镁棒植入组Runx2、成骨细胞特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、整合素α10、整合素β1 mRNA表达高于钛棒植入组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，见图3。上述结果表明，整合素α10β1的表达与成骨分化过程密切相关，整合素α10β1可能参与调控成骨分化。

2.5 两组小鼠股骨样本转录组学分析结果结果显示，相较于钛棒植入组，镁棒植入组整合素α10和整合素β1表达水平显著上调，成骨标志基因Runx2、成骨细胞特异性转录因子、碱性磷酸酶和骨唾液酸蛋白表达量也同步升高(图4A，B)。进一步的相关性分析发现，整合素α10、整合素β1与上述成骨基因之间相关性R值均大于0.950(图4C，D)，呈现显著的正相关关系。上述结果提示，整合素α10β1可能通过正向调控成骨标志基因表达促进骨膜干细胞的成骨分化。

2.6 两组小鼠股骨样本相关蛋白与通路表达检测结果 Mg2+可以配位结合整合素α10β1金属离子依赖位点MIDAS Ⅰ(插入)结构域，继而启动后续生物学行为[15，17]。Western blot检测显示，镁棒植入组整合素α10、整合素β1蛋白表达高于钛棒植入组
(P < 0.05)，钛棒植入组未见明显的黏着斑激酶、磷酸化黏着斑激酶蛋白表达，而镁棒植入组可见明显的黏着斑激酶、磷酸化黏着斑激酶蛋白表达，见图5A-C。
转录组测序分析结果显示，镁棒植入组Wnt/β-catenin信号表达高于钛棒植入组(P < 0.05)，丝裂原活化蛋白激酶信号表达低于钛棒植入组(P < 0.05)，见图5D，E。
结果表明，Mg2+通过激活整合素α10β1-黏着斑激酶/磷酸化黏着斑激酶信号通路而激活Wnt/β-catenin信号并抑制部分丝裂原活化蛋白激酶信号，从而启动后续骨膜骨干细胞的成骨分化行为。

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引言

随着人口老龄化加剧，增龄性骨质疏松、创伤性骨折、骨缺损及股骨头坏死等成骨障碍性疾病的数据逐年攀升。目前，国内外应对上述挑战性骨疾病的治疗方法主要是通过手术植入骨固定和修复材料等[1]，然而，现有材料在治疗过程中存在诸多局限性，如产生应力遮挡效应、释放有毒金属离子、来源有限或引发免疫排斥反应等，临床治疗效果并不理想[2-4]。近年来的多项报道证实，镁及镁合金具有良好的生物相容性、可降解性及成骨活性等优势，能够克服上述骨修复材料的缺陷，在生物材料和骨科应用研究中备受关注，被誉为未来新型骨科内植物材料[5-7]。
前期研究报道指出，镁诱导大鼠皮质骨增厚成骨，此成骨行为具有骨膜依赖性，即新生骨形成主要源于骨膜干细胞[8]。骨膜干细胞是一类具有高增殖、迁移和显著成骨潜能的细胞群体，不仅具有骨骼干细胞的核心特征，还表达与干细胞特性及四肢或骨骼系统发育相关的基因集，再生潜能甚至优于骨髓干细胞[9-10]。
早期研究显示，整合素α10β1分布在骨膜中[11]，在Ranvier骨化沟(一种参与骨发育的结构)内细胞中亦有表达，该区域含有参与骨生长与发育的软骨细胞和成骨细胞前体。此外，研究发现转录因子Kaiso通过整合素α10/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路调控成骨细胞分化[12]。上述理论提示整合素α10β1可能在镁诱导骨膜干细胞的成骨分化中发挥作用。
整合素是一类依赖于Mg2+或Ca2+的异源二聚体细胞黏附分子，由α和β亚基通过非共价键结合形成，能够特异性或交叉识别胶原蛋白在内的多种胞外基质配体[13-14]。整合素受体通过Mg2+介导的机制结合胶原，其中Mg2+既是结构锚定物又起到动态分子开关的作用[15-16]。具体而言，整合素α1β1、整合素α2β1、整合素α10β1和整合素α11β1作为胶原受体亚家族，具有共同的结构特征：它们的Ⅰ结构域(插入结构域)中包含一个金属离子依赖型结合位点MIDAS。整合素与胶原的结合依赖于金属离子依赖型结合位点MIDAS与Mg2+的配位，该过程促使整合素Ⅰ结构域由闭合未结合状态转变为开放结合状态，这一构象变化引发β亚基相关联的Ⅰ结构域C端螺旋-7发生结构重组，进而触发一系列变构效应，最终使整合素激活为高亲和力的直立状态，并启动下游生物学响应[15，17]。基于Mg2+可激活整合素的现有理论，作者推测镁植入机体后局部释放的Mg2+可能激活整合素α10β1，继而调控骨膜干细胞的成骨分化行为，然而该机制有待深入探究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体内实验。
1.2 时间及地点实验于2025年3-7月在苏州大学附属苏州九院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组实验选用雄性C57BL/6小鼠42只，6-8周龄，体质量18-25 g，购买自斯贝福(苏州)生物技术有限公司，生产许可证号，SCXK(苏)2022-0006。所有小鼠均饲养在苏州大学动物中心SPF级屏障设施内，使用许可证号：SYXK(苏) 2017-0043，设施内小鼠均可自由摄取标准灭菌饲料和无菌水。动物健康情况由该中心每日密切监测，实验期间无不良事件发生。采用随机数字表法将小鼠随机分为钛棒植入组(n=21)与镁棒植入组(n=21)。动物实验遵循苏州大学实验动物福利与伦理规范，并通过苏州大学动物伦理委员会的批准(SUDA20250715A04)。
1.3.2 主要试剂及仪器镁(钛)棒(直径0.7 cm，长1 cm，苏州晶俊新材料科技有限公司，中国)；多聚甲醛(sigma，美国)；体积分数10%甲醛固定液(索莱宝，中国)；Hifair® Ⅲ qPCR第一链cDNA合成即用型预混液、2×实时定量PCR扩增的预混合溶液[翌圣生物科技(上海)股份有限公司，中国]；Tunel试剂盒、BeyoClick™ EdU-594细胞增殖检测试剂盒、DAPI、彩色蛋白marker(碧云天生物技术有限公司，中国)；石蜡切片机、烤片机、离心机(Thermo，美国)；荧光实时定量PCR仪、电泳仪(Bio-rad，美国)；显影仪(杭州申花科技公司，中国)；正置荧光显微镜(蔡司公司，德国)；研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司，中国)；PAGE凝胶快速制备试剂盒(雅酶，中国)；整合素α10抗体(默克，德国)；整合素β1抗体(abcam公司，英国)；β-actin抗体(赛维尔生物科技有限公司，中国)；黏着斑激酶抗体、磷酸化FAK抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 髓内钉模型的构建参照文献[18-19]构建髓内钉模型。腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉小鼠后仰卧位固定，于小鼠左后肢膝关节内侧向上划开约1.5 cm切口，露出关节软骨和髁间窝，利用1 mL注射器针头于股骨髁间窝位置轻轻手动转动钻孔骨髓腔内1 cm，钛棒植入组与镁棒植入组分别将镁棒、钛棒缓缓推入骨髓腔，缝合韧带和皮肤组织。
1.4.2 取材术后3 d，每组随机取5只小鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后处死，取左后肢膝关节股骨，用于Tunel染色与Edu染色。术后14 d，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后处死剩余小鼠，依次进行以下处理：每组随机选取4只，不脱钙，用于钙黄绿素荧光双标染色；每组随机取5只，用于Micro-CT扫描分析，分析后样本进行苏木精-伊红染色；每组随机取4只，用于转录组测序分析，测序返回的RNA样本用于qPCR检测；每组剩余的3只样本，用于Western blot 检测相关蛋白表达。
1.4.3 Tunel染色切片脱蜡、复水，PBS液清洗后渗透液室温孵育8 min，加入Tunel试剂于37 ℃孵育1 h，DAPI染色5 min，PBS清洗后封固剂封固后，正置荧光显微镜下采集图像，观察植入物周围细胞凋亡情况。
1.4.4 Edu染色收集样品前6 h，按检测试剂盒说明剂量对两组小鼠腹腔注射Edu(100 mg/kg)。切片经二甲苯脱蜡、复水后加入Click反应液，室温避光孵育30 min，DAPI染色5 min，封固后正置荧光显微镜采集图像，观察皮质骨增厚区域细胞增殖活性。
1.4.5 Micro-CT扫描及分析启动SkyScan 1176 Micro-CT扫描仪电源，样本扫描条件：X射线电压50 kV，电流200 μA，过滤片0.5 mm Al，图像像素9 μm，扫描旋转度数0.7°。扫描结束后启动NRecon及NReconServer，Dataview软件，分别将原始数据分别进行二维重构阈值0-0.075，三维重构获取“Transaxial”数据集，Dataview下载“Transaxial”数据图集，点击Create SPR shadow image，获得对照组和植入图片组整体图片。打开CTan软件，于生长板最下方皮质骨处向下选择100张图片设定为感兴趣区域，获取此区域骨密度、骨体积、组织体积、骨体积分数和皮质骨厚度。用Mimics Research 19对Micro-CT图片进行3D建模。
1.4.6 苏木精-伊红染色取小鼠股骨样本，经体积分数10%甲醛固定24 h，14% EDTA脱钙14 d，每天换液，脱钙结束次日，PBS清洗去除残留EDTA，依次进行梯度浓度乙醇脱水、透明、石蜡包埋与切片(厚度6 μm)，烤片机烤片60 min，二甲苯脱蜡，依次放入体积分数100%乙醇、体积分数70%乙醇、ddH2O复水，苏木精染色2 min，伊红Y染液染色1 min，体积分数70%，100%乙醇脱水、二甲苯透明后中性树脂封固，显微镜下(明场)采集图像，观察股骨皮质骨增厚区新生骨形态结构。
1.4.7 钙黄绿素荧光双标染色在收集样品前7 d和前2 d，小鼠腹腔注射钙黄绿素溶液(10 mg/kg)[20-21]。取小鼠股骨样本，40 g/L多聚甲醛固定24 h，分别转入15%蔗糖、30%蔗糖中各1 d，冰冻切片包埋后切片(厚度8 μm)，DAPI染色5 min，封固后正置荧光显微镜采集图像，骨膜干细胞成骨分化情况。
1.4.8 转录组测序取小鼠股骨样本，液氮冻存后直接送上海欧易生物医学科技有限公司进行测序。TRIzol试剂提取总RNA后，由VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit (Premixed Version)试剂盒构建转录组文库。采用fast软件对fastq格式的raw reads进行处理。使用HISAT2软件进行参考基因组比对，并进行基因表达量计算，通过HTSeg-count获得每个基因的reads计数，利用DESeq2软件进行差异表达基因分析，其中符合q < 0.05且|log2FC| ≥ 1阈值的基因被定义为差异表达基因。使用R(v3.2.0)对差异表达基因进行层次聚类分析，分析整合素α10β1和成骨基因表达之间的相关性。
1.4.9 qPCR检测成骨相关基因与整合素α10、整合素β1基因表达使用转录组测序返回的RNA样本，将500 ng总RNA反转录合成cDNA，配置20 μL反应体系(Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7.5 μL，正向引物0.25 μL，反向引物0.25 μL，cDNA 2 μL)，反应条件为：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s (40 个循环)。靶基因表达量以β-actin为标准对照，用2-ΔΔCt计算成骨细胞特异性转录因子、碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、Runx2与整合素α10 、整合素β1 mRNA表达。qPCR检测引物序列见表1。
1.4.10 Western blot 检测相关蛋白表达水平取小鼠股骨样本，超速离心去除骨髓，无菌PBS多次冲洗骨髓腔，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，研磨仪磨碎组织，冰上静置20 min，4 ℃下13 000 r/min离心20 min，取上清，BCA试剂盒测定总蛋白浓度，加入Loading 100 ℃金属浴10 min。SDS-PAGE凝胶电泳(参数：浓缩胶80 V，30 min；分离胶120 V)分离蛋白，转移至NC膜上转膜(转膜参数：恒压90 V，2 h)，5%脱脂奶粉或5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入整合素α10 (1∶2 000)、整合素β1(1∶2 000)、黏着斑激酶(1∶2 000)、磷酸化黏着斑激酶(1∶2 000)抗体以及内参β-actin(1∶ 2 000)，于4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜后加入二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST再次洗膜，用ECL发光液将NC膜发光凝胶成像仪中，测定目标蛋白整合素α10、整合素β1、黏着斑激酶与磷酸化黏着斑激酶蛋白表达。
1.5 主要观察指标各组小鼠股骨植入物周围细胞凋亡情况、皮质骨增厚区域细胞增殖活性、股骨皮质骨增厚成骨情况、股骨皮质骨增厚区新生骨形态结构、骨膜干细胞成骨分化情况，成骨标志基因与整合素α10、整合素β1 mRNA表达，整合素α10、整合素β1、黏着斑激酶及磷酸化黏着斑激酶蛋白表达，转录组学分析结果。

1.6 统计学分析研究数据采用IBM SPSS Statistics 19统计软件进行处理，所有数据以x±s表示，两组样本数据比较采用独立样本t检验，统计学差异均由平行重复实验获得，并由GraphPad Prism 6软件自动生成，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经苏州第九人民医院生物统计学专家审核。

讨论

骨再生是治疗增龄性骨质疏松、创伤性骨折、骨缺损及股骨头坏死等成骨障碍疾病的根本策略[22]。皮质骨扩张、厚度和孔隙率是人类等多种物种骨强度和骨折风险的关键决定因素[23-24]。
目前，临床治疗骨缺陷的研究多集中于松质骨[25-26]，然而，如何保护和强化患者皮质骨、找到针对性的理论和策略改善皮质骨脆弱性，也是改善预后的重要方向。
作为皮质骨的关键维护系统，骨膜干细胞在皮质骨的形成和生长、骨折修复、稳态维持及微环境调控中均发挥核心作用[9，27]。
镁具有良好的成骨性能，能够促进骨膜干细胞的成骨分化，直接参与皮质骨的外源性生长[8]。与已有研究结果一致，此次研究通过Micro-CT、Tunel染色、Edu染色、苏木精-伊红染色、钙黄绿素荧光双标染色等多种技术手段，进一步证实了镁植入物在促进成骨方面的显著功效。
整合素是一类依赖Mg2+的跨膜受体，Mg2+通过配位键与整合素βI结构域上金属离子依赖型结合位点MIDAS结合，继而改变整合素的构象、蛋白质互作和膜转运等过程 [28-30]。研究表明，Mg2+通过干扰整合素α2 -Ⅰ结构域与胶原复合物形成，抑制下游Ras同源基因A/Rho激酶1信号通路，发挥抗血管生成作用[31]。
在骨再生中，Mg2+能结合胶原并通过整合素α2β1介导的下游信号通路促进成骨细胞的增殖与分化[32]。此外，对镁改性修饰后，可经由整合素介导的机制改变骨髓基质细胞行为[16]，并显著增强滑膜间充质干细胞的黏附与软骨形成能力。此次研究通过Micro-CT明确了镁促进骨膜干细胞成骨分化作用，进一步发现成骨分化标志基因(Runx2、成骨细胞特异性转录因子、碱性磷酸酶和骨唾液酸蛋白)与整合素基因(整合素α10 、整合素β)均同步上调，表达趋势一致。随后的转录组测序分析证实，整合素α10β1与成骨分化标志基因之间存在极强的正相关性。相较于前人主要采用MC3T3-E1细胞模型，此次研究主要基于动物体内实验模型，聚焦骨膜干细胞，发现镁植入物或通过激活整合素促进成骨分化基因的表达，提示整合素α10β1在成骨分化中具有尚未被充分认识的潜在功能。
整合素α10β1是目前公认的软骨组织理想细胞标志物[33-34]，随着条件基因敲除技术的进步，它们在骨形成过程中的功能逐渐被揭示。研究表明，整合素α10β1在Ranvier骨化沟区域的细胞中表达，该区域富含参与骨发育的软骨细胞和成骨前体细胞；此外，miR-4739/ITGA10轴可被认为在骨质疏松症诊断和治疗中具有潜在价值[35]。在整合素下游信号传导过程中，黏着斑激酶的激活是一个关键的早期事件，整合素被激活后发生构象变化，导致其胞内段聚集并细胞骨架链接，形成黏着斑；随后，黏着斑激酶被募集至黏着斑并发生自身磷酸化，进而启动下游多条通路。其中，Wnt/β-catenin通路在黏着斑激酶的下游，是调控骨形成(成骨)最关键的正向调控通路之一[36-37]。丝裂原活化蛋白激酶信号通路在调控成骨细胞增殖、分化和存活中发挥核心作用，可促进早期细胞的增殖，后期抑制干细胞向成骨细胞分化与成熟[38]。此次研究结果显示，Mg2+特异性激活骨膜细胞中整合素α10β1-黏着斑激酶信号轴，黏着斑激酶的激活进而差异化地调控下游成骨相关通路：一方面显著上调促进骨形成的关键通路Wnt/β-catenin，另一方面部分抑制了丝裂原活化蛋白激酶通路，从分子层面阐明了镁促进成骨的作用，为其作为优良骨科植入材料提供了理论支持。
这项研究从影像学、组织学、分子生物学以及转录组学等多个层面，证明了Mg2+通过激活整合素α10β1-黏着斑激酶信号轴在调控骨膜干细胞成骨分化中的关键作用，为治疗成骨障碍性疾病提供了新的理论依据和潜在干预靶点。然而，受限于当前实验条件，研究尚未通过基因敲除、抑制剂干预或过表达等手段对该信号轴具体作用机制进行深入功能验证，未来拟进一步构建条件性基因敲除动物模型或利用siRNA等技术在体内外验证整合素α10β1在镁诱导成骨中的必要性，从而更完整地揭示其分子调控网络。
综上所述，Mg²⁺通过整合素α10β1-黏着斑激酶轴双向调控Wnt/丝裂原活化蛋白激酶信号通路，一方面激活Wnt/β-catenin
通路促进成骨基因表达，另一方面部分抑制丝裂原活化蛋白激酶通路，从而协同促进骨膜干细胞分成骨分化。该研究不仅揭示了镁基材料在骨修复中的新机制，也为临床治疗骨质疏松、骨缺损等成骨障碍性疾病提供了潜在靶点与理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

镁植入物激活整合素α10β1促进骨膜干细胞成骨分化的作用机制

Mechanism by which magnesium implant-activated integrin α10β1 promotes osteogenic differentiation of periosteal stem cells

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