藏红花素水凝胶对软骨细胞与MC3T3-E1细胞的影响

doi:10.12307/2025.888

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (34): 7293-7300.doi: 10.12307/2025.888

• 组织工程软骨材料 tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

藏红花素水凝胶对软骨细胞与MC3T3-E1细胞的影响

尹航1，宋奎2

1武汉商学院体育学院，湖北省武汉市 430056；2吉首大学第一附属医院，湖南省吉首市 416000

收稿日期:2024-06-27 接受日期:2024-09-05 出版日期:2025-12-08 发布日期:2025-01-17
通讯作者: 尹航，硕士，副教授，武汉商学院体育学院，湖北省武汉市 430056
作者简介:尹航，女，1979年生，湖北省武汉市人，汉族，硕士，副教授，主要从事运动人体科学与运动康复方面的研究。
基金资助:
湖南省自然科学基金项目(2023JJ30609)，项目负责人：宋奎

Effect of crocin hydrogel on chondrocytes and MC3T3-E1 cells

Yin Hang1, Song Kui2

1School of Physical Education, Wuhan Business University, Wuhan 430056, Hubei Province, China; 2First Affiliated Hospital of Jishou University, Jishou 416000, Hunan Province, China

Received:2024-06-27 Accepted:2024-09-05 Online:2025-12-08 Published:2025-01-17
Contact: Yin Hang, MS, Associate professor, School of Physical Education, Wuhan Business University, Wuhan 430056, Hubei Province, China
About author:Yin Hang, MS, Associate professor, School of Physical Education, Wuhan Business University, Wuhan 430056, Hubei Province, China
Supported by:
Hunan Natural Science Foundation Project, No. 2023JJ30609 (to SK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

水凝胶：是由具备较强亲水性的聚合物通过各种交联方式形成的具有三维网状结构的聚合物，其内部的多孔结构和细胞外基质类似，有利于软骨与骨组织内部营养物质和代谢产物的交换；并且具有良好的可塑性，可为细胞的增殖、黏附及分化营造良好的微环境。水凝胶已被广泛应用于软骨与骨组织工程中。
藏红花素：是藏红花中的一种有效成分，对中枢神经系统、心血管系统、肾功能等具有保护作用，具有抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗抑郁、抗炎和解毒等功能。

背景：研究发现，藏红花素可抑制骨关节炎软骨细胞的凋亡、减轻骨关节炎大鼠炎症反应，促进骨质疏松大鼠骨形成并抑制骨丢失，在软骨与骨损伤中具有巨大的应用潜力。

目的：观察藏红花素水凝胶对软骨细胞、MC3T3-E1细胞的影响。
方法：将不同浓度(0，15，20，25 mmol/L)的藏红花素溶液分别加入氧化透明质酸-氧化硫酸软骨素-Ⅱ型胶原混合溶液中，采用席夫碱交联方式制备藏红花素水凝胶，随后制备4种水凝胶浸提液。将4种藏红花素水凝胶浸提液分别与人软骨细胞共培养，检测细胞糖胺聚糖合成，CCK-8法检测细胞增殖，Transwell小室实验检测细胞迁移，RT-qPCR检测细胞SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达。将4种藏红花素水凝胶浸提液分别与MC3T3-E1细胞共培养，CCK-8法检测细胞增殖，RT-qPCR检测成骨诱导分化后细胞RUNX2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA表达，成骨诱导分化后的碱性磷酸酶活性与矿化结节形成。

结果与结论：①CCK-8检测结果显示，15，20 mmol/L藏红花素水凝胶浸提液促进软骨细胞的增殖，25 mmol/L藏红花素水凝胶浸提液抑制软骨细胞的增殖。15，20，25 mmol/L藏红花素水凝胶浸提液均可促进软骨细胞的迁移，提升软骨细胞SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达与糖胺聚糖合成，并且呈现剂量依赖性。②15，20，25 mmol/L藏红花素水凝胶浸提液均可促进MC3T3-E1细胞的增殖，提高成骨诱导分化后细胞RUNX2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA表达，并且具有剂量依赖性。15，20，25 mmol/L藏红花素水凝胶浸提液可提高成骨诱导分化后MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性与矿化结节形成，其中以20 mmol/L藏红花素水凝胶浸提液的提高效果最显著。③结果表明，藏红花素水凝胶可促进软骨细胞的增殖、迁移及软骨细胞外基质的合成，促进MC3T3-E1细胞的增殖与成骨分化，其中20 mmol/L藏红花素水凝胶的综合效果较好。

https://orcid.org/0009-0001-0135-0315 (尹航)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 藏红花素, 水凝胶, 软骨细胞, MC3T3-E1细胞, 细胞增殖, 细胞迁移, 细胞分化, 工程化软骨材料

Abstract: BACKGROUND: Studies have found that crocin can inhibit the apoptosis of osteoarthritis chondrocytes, reduce the inflammatory response of osteoarthritis rats, promote bone formation and inhibit bone loss in osteoporotic rats, and has great application potential in cartilage and bone damage.
OBJECTIVE: To observe the effects of crocin hydrogel on chondrocytes and MC3T3-E1 cells.
METHODS: Crocin hydrogels were prepared by Schiff base crosslinking method by adding different concentrations of crocin solution (0, 15, 20, and 25 mmol/L) into oxidized hyaluronic acid -oxidized chondroitin sulfate -type II collagen mixed solution, and then four kinds of hydrogel extracts were prepared. Human chondrocytes were cultured with four kinds of crocin hydrogel extracts to detect glycosaminoglycan synthesis. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. Cell migration was detected by Transwell chamber assay. RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of SOX9, type II collagen, and aggrecan in cells. Four kinds of crocin hydrogel extracts were co-cultured with MC3T3-E1 cells, respectively. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of RUNX2, type I collagen, alkaline phosphatase, and osteocalcin in cells. and the alkaline phosphatase activity and mineralized nodule formation after osteogenic differentiation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 assay results showed that 15 and 20 mmol/L crocin hydrogel extract promoted the proliferation of chondrocytes, while 25 mmol/L crocin hydrogel extract inhibited the proliferation of chondrocytes. 15, 20, and 25 mmol/L crocin hydrogel extracts could all promote the migration of chondrocytes, increase the expression of SOX9, type II collagen, aggrecan mRNA and glycosaminoglycan synthesis of chondrocytes in a dose-dependent manner. (2) 15, 20, and 25 mmol/L crocin hydrogel extract could promote the proliferation of MC3T3-E1 cells and increase the expression of RUNX2, type I collagen, alkaline phosphatase, and osteocalcin mRNA in cells after osteogenic differentiation in a dose-dependent manner. 15, 20, and 25 mmol/L crocin hydrogel extract could increase the alkaline phosphatase activity and mineralized nodule formation of MC3T3-E1 cells after osteogenic induction differentiation. Among them, 20 mmol/L crocin hydrogel extract is the most significant in improvement effect of the extract liquid. (3) The results show that crocin hydrogel can promote the proliferation and migration of chondrocytes and the synthesis of cartilage extracellular matrix, and enhance the proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells. Among them, the comprehensive effect of 20 mmol/L crocin hydrogel is best.

Key words: crocin, hydrogel, chondrocyte, MC3T3-E1 cell, cell proliferation, cell migration, cell differentiation, engineered cartilage material

中图分类号:

尹航, 宋奎. 藏红花素水凝胶对软骨细胞与MC3T3-E1细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7293-7300.

Yin Hang, Song Kui. Effect of crocin hydrogel on chondrocytes and MC3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(34): 7293-7300.

图/表（结果） 8

2.1 水凝胶浸提液对软骨细胞增殖的影响各组软骨细胞CCK-8检测结果见图1。培养1 d后，5组软骨细胞增殖没有明显差异；培养3-7 d后，与对照组相比，藏红花素0组软骨细胞增殖吸光度值无明显差异(P > 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组软骨细胞增殖吸光度值升高(P均< 0.05)，藏红花素25组细胞增殖吸光度值降低(P < 0.05)。

2.2 水凝胶浸提液对软骨细胞迁移的影响与对照组相比，藏红花素0组对软骨细胞迁移无明显影响，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组可促进软骨细胞的迁移，其中以藏红花素25组效果最明显，见图2A。定量分析结果显示，对照组与藏红花素0组迁移细胞数量比较无统计学差异(P均> 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组迁移细胞数量均多于对照组、藏红花素0组(P均< 0.05)，藏红花素25组迁移细胞数量多于藏红花素15组、藏红花素20组(P均< 0.05)，藏红花素20组迁移细胞数量多于藏红花素15组(P < 0.05)，见图2B。

2.3 水凝胶浸提液对软骨细胞相关基因表达的影响 RT-qPCR检测结果显示，培养7 d后，与对照组相比，藏红花素0组SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达无显著变化(P均> 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达均显著升高(P均< 0.05)；藏红花素20组、藏红花素25组SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达均高于藏红花素15组(P均< 0.05)，藏红花素25组SOX9、Ⅱ型胶原mRNA表达均高于藏红花素20组(P均< 0.05)，见表3。培养14 d后，与对照组相比，藏红花素0组SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达无明显变化(P均> 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达均升高(P均< 0.05)；藏红花素20组、藏红花素25组SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达均高于藏红花素15组(P均< 0.05)，藏红花素25组SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达与藏红花素20组相比无显著变化(P均> 0.05)，见表3。

2.4 水凝胶浸提液对软骨细胞糖胺聚糖合成的影响培养7，14，21 d后，与对照组比较，藏红花素0组软骨细胞糖胺聚糖合成量均无明显变化(P均> 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组软骨细胞糖胺聚糖合成量均增加(P均< 0.05)；藏红花素25组软骨细胞糖胺聚糖合成量多于藏红花素15组、藏红花素20组(P均< 0.05)，藏红花素20组软骨细胞糖胺聚糖合成量多于藏红花素15组(P < 0.05)，见图3。

2.5 水凝胶浸提液对MC3T3-E1细胞增殖的影响各组MC3T3-E1细胞增殖CCK-8检测结果见图4。培养1 d后，5组MC3T3-E1细胞增殖吸光度值无明显差异(P > 0.05)。培养3 d后，与对照组比较，藏红花素0组MC3T3-E1细胞增殖吸光度值无明显变化(P > 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组细胞增殖吸光度值升高(P均< 0.05)，并且藏红花素20组、藏红花素25组细胞增殖吸光度值高于藏红花素15组(P均< 0.05)，前两组比较无明显差异(P > 0.05)。培养5，7 d后，与对照组比较，藏红花素0组MC3T3-E1细胞增殖无明显变化(P > 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组细胞增殖吸光度值升高(P均< 0.05)，藏红花素20组、藏红花素25组细胞增殖高于藏红花素15组(P均< 0.05)，藏红花素25组细胞增殖吸光度值高于藏红花素20组(P < 0.05)。

2.6 水凝胶浸提液对MC3T3-E1细胞成骨分化相关基因表达的影响 RT-qPCR检测结果显示，成骨诱导培养7，14 d后，与对照组比较，藏红花素0组RUNX2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA无明显变化(P均> 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组RUNX2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA表达均升高(P均< 0.05)；藏红花素20组RUNX2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA表达高于藏红花素15组(P均< 0.05)，藏红花素25组RUNX2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA表达高于藏红花素20组(P均< 0.05)，见表4。

2.7 水凝胶浸提液对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响 BCIP/NBT碱性磷酸酶染色显示，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组染色较深，对照组与藏红花素0组染色较浅，其中藏红花素20组染色最深，见图5A。碱性磷酸酶活性检测结果显示，相同时间下，对照组与藏红花素0组碱性磷酸酶活性比较无明显差异(P > 0.05)，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组碱性磷酸酶活性高于对照组、藏红花素0组(P均< 0.05)，藏红花素20组碱性磷酸酶活性高于藏红花素15组、藏红花素25组(P均< 0.05)，藏红花素25组碱性磷酸酶活性高于藏红花素15组(P < 0.05)，见图5B，与BCIP/NBT碱性磷酸酶染色结果基本一致。

2.8 水凝胶浸提液对MC3T3-E1细胞矿化形成的影响茜素红染色显示5组均可见矿化结节形成，对照组与藏红花素0组矿化结节形成面积最小，藏红花素20组矿化结节形成面积最大，见图6。

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引言

由创伤、炎症及肿瘤等原因导致的软骨损伤较常见，由于软骨内没有神经，当发现软骨损伤时常常已经累及到软骨下骨，据报道，80%以上的软骨损伤合并软骨下骨损伤[1]，由此引发的肿胀、疼痛与功能障碍严重影响了人们的生活质量。传统的物理、药物和手术方式治疗软骨损伤的效果均不理想[2]，组织工程与再生医学的出现为软骨损伤的修复带来了新的契机。
水凝胶是由具备较强亲水性聚合物通过各种交联方式形成的具有三维网状结构的聚合物，其内部的多孔结构和细胞外基质类似，有利于软骨与骨组织内部营养物质和代谢产物的交换；并且具有良好的可塑性，可为细胞的增殖、黏附及分化营造良好的微环境，已被广泛应用于软骨与骨组织工程中[3-5]。透明质酸是一种由葡糖醛酸和氨基葡萄糖构成的糖胺聚糖，广泛存在于软骨细胞外基质中，能促进软骨细胞基质沉积，并且对于维持软骨正常的微环境至关重要，参与到细胞增殖、黏附、分化和细胞骨架重排等过程中[6-7]。硫酸软骨素是广泛存在于动物结缔组织和骨组织细胞外基质中的一种糖胺聚糖，具有较强的抗炎性能，可以促进蛋白多糖的分泌，这有利于软骨损伤的再生修复[8-9]。Ⅱ型胶原是广泛存在于软骨细胞外基质中的胶原，作为一种材料添加到软骨水凝胶的制备中可以为软骨细胞生长营造良好的环境[10]。研究已证明，透明质酸/硫酸软骨素/Ⅱ型胶原水凝胶具有良好的细胞相容性、降解性、抗压强度，可作为软骨组织工程支架材料[11]。因此，此次实验选择透明质酸/硫酸软骨素/Ⅱ型胶原水凝胶作为软骨组织工程支架。
藏红花素是藏红花中的一种有效成分，对中枢神经系统、心血管系统、肾功能等具有保护作用，具有抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗抑郁、抗炎和解毒等功能[12-15]。研究发现，藏红花素可抑制骨关节炎软骨细胞的凋亡[16]、减轻骨关节炎大鼠炎症反应[17]、促进骨质疏松大鼠骨形成并抑制骨丢失[18-19]，在软骨与骨损伤中具有巨大的应用潜力。此次实验将藏红花素负载于透明质酸/硫酸软骨素/Ⅱ型胶原水凝胶中，观察对软骨细胞、MC3T3-E1细胞的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞观察实验，多组间比较进行单因素方差分析，事后检验采用LSD-t法。
1.2 时间及地点实验于2023年11月至2024年4月在武汉商学院体育学院完成。
1.3 材料人软骨细胞(上海纪宁实业有限公司)；MC3T3-E1细胞(上海中乔新舟生物科技有限公司)；藏红花素(≥98%，曼斯特(成都)生物科技有限公司)；透明质酸(山东华熙福瑞达有限公司)；硫酸软骨素(陕西浩洋生物科技有限公司)；Ⅱ型胶原(重庆凝骄生物科技有限公司)；高碘酸钠(济南仁源化工有限公司)；乙二醇溶液(山东江泽国际贸易有限公司)；胎牛血清、DMEM/F12基础培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)；碱性磷酸酶活性定量试剂盒、BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；CCK-8检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；Transwell小室(苏州青柠生物科技有限公司)；Hoechst33258染色液(北京百奥莱博科技有限公司)；1，9-二甲基亚甲蓝染色液(范德生物科技公司)；反转录试剂盒(上海海方生物技术有限公司)；茜素红染液(南京森贝伽生物科技有限公司)；酶标仪(HBS-1101，南京德铁实验设备有限公司)；冷冻干燥机(FD-A10N-50，冠森生物科技(上海)有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 制备藏红花素水凝胶将20 mL去离子水加入平底烧杯中，称量4 g透明质酸粉末加入烧杯中，置于磁力搅拌器中匀速搅拌(600 r/min)至透明质酸完成溶解，得到20 g/L透明质酸溶液。将高碘酸钠(含高碘酸钠粉末2.14 g)水溶液20 mL加入透明质酸溶液中，室温下搅拌(600 r/min)24 h，再向烧杯中加入5 mL乙二醇溶液继续搅拌0.5 h，得到氧化透明质酸溶液。将截留相对分子质量为3 500的透析袋裁剪为长20 cm的小段，放入1 mmol/L EDTA溶液中煮沸10 min，冷却后用蒸馏水清洗透析袋。将氧化透明质酸溶液加入到透析袋中，用透析夹子密封后置于去离子水中透析3 d，在透析过程中共更换3次透析液；透析反应结束后取透析袋中溶液放入圆盘中，置于冷冻干燥机中-80 ℃冻干过夜，次日收集干燥的氧化透明质酸分装密封保存，用于后续实验。
将20 mL去离子水加入平底烧杯中，称量4 g硫酸软骨素粉末加入烧杯中；并放置于磁力搅拌器上匀速搅拌(600 r/min)至硫酸软骨素粉末完全溶解，得到20 g/L的硫酸软骨素溶液。将 16 mL高碘酸钠水溶液(含高碘酸钠粉末1.8 g)加入到烧杯中，室温下充分搅拌(600 r/min)24 h，再向烧杯中加入5 mL乙二醇溶液继续搅拌0.5 h，得到氧化硫酸软骨素溶液。将截留相对分子质量为 3 500的透析袋裁剪为长约20 cm的小段，放入1 mmol/L EDTA 过夜中煮沸10 min，冷却后用蒸馏水清洗透析袋；将氧化硫酸软骨素溶液加入到透析袋中，用透析夹子密封后置于去离子水中透析3 d，在透析过程中共更换3次透析液；透析反应结束后取透析袋中溶液放入圆盘中，置于冷冻干燥机中-80 ℃冻干过夜，收集干燥的氧化硫酸软骨素分装密封保存，用于后续实验。
称量75 mg氧化硫酸软骨素与25 mg氧化透明质酸加入1.5 mL EP管内，使用移液枪吸取600 µL超纯水加入EP管内，充分搅拌混合均匀，静置待用。将藏红花素用微量的DMSO溶液溶解，然后稀释于超纯水中(DMSO最终浓度为0.1%)，藏红花素的终浓度分别为15，20，25 mmol/L；称量1 g Ⅱ型胶原，加入适量1.5 mol/L NaOH溶液搅拌均匀，调节pH值至7.5，然后加入100 µL藏红花素溶液(15，20，25 mmol/L)、600 µL氧化透明质酸-氧化硫酸软骨素溶液，混合均匀，置入成胶模具中静置成胶，制备的水凝胶分别记为藏红花素15、藏红花素20、藏红花素25。同理制备不含藏红花素的空白水凝胶，记为藏红花素0。
1.4.2 制备藏红花素水凝胶浸提液将0.1 g的4种藏红花素水凝胶置于无菌操作台中紫外消毒3 h，然后浸泡于1 mL无血清DMEM/F12基础培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中浸提24 h，得到水凝胶浸提液，无菌滤头过滤后加入体积分数10%胎牛血清，置于4 ℃冰箱保存备用。
1.4.3 水凝胶浸提液对软骨细胞增殖的影响复苏冻存的人软骨细胞后接种于96孔板内，细胞密度为1.5×103/孔，接种24 h后弃原培养基，分组培养：对照组加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基100 µL，藏红花素0组、藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组分别加入对应的水凝胶浸提液100 µL，每组5复孔，隔天换液。培养1，3，5，7 d后，每孔加入体积分数10% CCK-8溶液避光孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm处吸光度值。
1.4.4 水凝胶浸提液对软骨细胞迁移的影响将人软骨细胞接种于Transwell小室内，加入DMEM/F12培养基200 µL，细胞密度为2×104/孔。将含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(对照组)及藏红花素0、藏红花素15、藏红花素20、藏红花素25水凝胶浸提液分别加入24孔板内，500 µL/孔。将Transwell小室放入24孔板内，培养24 h后取出Transwell小室，吸去小室内液体，用棉签轻轻拭去小室膜上表面的细胞，用 40 g/L多聚甲醛固定30 min，以固定迁移至膜下表面的细胞，用PBS清洗后将小室转移至0.1%结晶紫染液中染色30 min，用蒸馏水清洗2次，置于显微镜下拍照，每组随机取 3个视野，使用Image J软件计数细胞。

1.4.5 水凝胶浸提液对软骨细胞相关基因表达的影响将人软骨细胞接种于6孔板内，细胞密度为2×105/孔，分5组培养，分别加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(对照组)及藏红花素0、藏红花素15、藏红花素20、藏红花素25水凝胶浸提液，2 mL/孔，每组3复孔，隔天换液。培养7，14 d后，采用Trizol法提取软骨细胞总RNA，使用反转录试剂盒反转录得到 cDNA，然后进行RT-qPCR反应。以GAPDH 作为内参基因，采用 2-ΔΔCt 方法计算SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA的相对表达。实验中所用的引物序列如表1所示。

1.4.6 水凝胶浸提液对软骨细胞糖胺聚糖合成的影响将人软骨细胞接种于6孔板内，细胞密度为5×105/孔，培养24 h后弃原培养基，分5组培养，分别加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(对照组)及藏红花素0、藏红花素15、藏红花素20、藏红花素25水凝胶浸提液，2 mL/孔，每组3复孔，隔天换液。培养7，14，21 d后，用PBS清洗，每孔加入1 mL 木瓜蛋白酶消化液，置入65 ℃恒温摇床(60 r/min)中消化16 h，1 200 r/min离心7 min后取上清，采用Hoechst 33258染色法检测DNA含量[20]，采用1，9-二甲基亚甲蓝染色法来检测糖胺聚糖含量[21]。
1.4.7 水凝胶浸提液对MC3T3-E1细胞增殖的影响复苏冻存的MC3T3-E1细胞后种于96孔板内，细胞密度为1.5×103/孔，接种24 h后弃原培养基，分5组培养：对照组加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基100 µL，藏红花素0组、藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组加入对应的水凝胶浸提液100 µL，每组5复孔，隔天换液。培养1，3，5，7 d后，每孔加入体积分数10%CCK-8溶液避光孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.4.8 水凝胶浸提液对MC3T3-E1细胞成骨分化相关基因表达的影响将MC3T3-E1细胞接种于6孔板内，细胞密度为2×105/孔，分5组培养，分别加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(对照组)及藏红花素0、藏红花素15、藏红花素20、藏红花素25水凝胶浸提液，2 mL/孔，每组3复孔，隔天换液。培养基与水凝胶浸提液中均加入成骨诱导剂(含抗坏血酸 50 μg/mL、β-甘油磷酸钠 5 mmol/L、地塞米松10 nmol/L)。成骨诱导培养7，14 d后，采用Trizol 法提取MC3T3-E1细胞总RNA，使用反转录试剂盒反转录得到cDNA，然后进行RT-qPCR反应。以GAPDH 作为内参基因，采用 2-ΔΔCt 方法计算RUNX2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的相对表达。实验中所用的引物序列如表2所示。

1.4.9 水凝胶浸提液对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响将MC3T3-E1细胞接种于12孔板内，细胞密度为5×104/孔，分5组培养，分别加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(对照组)及藏红花素0、藏红花素15、藏红花素20、藏红花素25水凝胶浸提液，2 mL/孔，每组3复孔，隔天换液。培养基与水凝胶浸提液中均加入成骨诱导剂。成骨诱导培养7，14 d后，使用碱性磷酸酶活性定量试剂盒和BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒检测碱性磷酸酶活性。
1.4.10 水凝胶浸提液对MC3T3-E1细胞矿化结节形成的影响将MC3T3-E1细胞接种于6孔板内，细胞密度为2×105/孔，分5组培养，分别加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(对照组)及藏红花素0、藏红花素15、藏红花素20、藏红花素25水凝胶浸提液，2 mL/孔，每组3复孔，隔天换液。培养基与水凝胶浸提液中均加入成骨诱导剂。成骨诱导培养21 d后进行茜素红染色，置于显微镜下观察矿化结节形成，每孔随机选择4个不同视野，使用Image J软件对茜素红染色阳性面积进行定量分析。
1.5 主要观察指标不同浓度藏红花素水凝胶浸提液对软骨细胞增殖、迁移、软骨相关基因表达及糖胺聚糖合成的影响，不同浓度藏红花素水凝胶浸提液MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学处理，计量资料采取x±s的表达方式，多组间比较进行单因素方差分析，事后检验采用LSD-t法。P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经武汉商学院体育学院生物统计学专家审核。

讨论

关节软骨缺乏血管、神经和淋巴等结构，并且随着年龄的增长软骨组织内的蛋白多糖会逐渐发生退行性改变，软骨组织内的纤维网状结构出现破坏，导致成年软骨损伤后的再生修复能力极其有限，无法自行愈合[22]。既往的多种治疗手段(物理治疗、口服药物治疗和关节腔内药物注射等)虽然在短期内对软骨损伤有一定修复效果，但无法维持长期稳定的疗效。水凝胶具有与软骨细胞外基质相似的成分和结构，具有较好的润滑性与机械强度，同时可携载种子细胞、生长因子与药物等，为软骨损伤的再生修复提供了新的治疗策略[23-24]。
藏红花素为鸢尾科番红花属多年生药用植物，具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、免疫调节、降血脂、抗抑郁症及抗糖尿病等。研究已证实，藏红花素可抑制软骨细胞的凋亡、促进成骨细胞的增殖[16，18-19]。以往藏红花素的给药方式主要为口服、静脉注射，药物半衰期较短，生物利用度较低。为提高藏红花素的生物利用度，此次实验采用席夫碱交联方式制备藏红花素水凝胶，该方法在温和的生理条件下进行，不需要额外添加其他的交联剂，操作步骤简单，不需要光照、控制温度等，并且反应的副产物是水，不会对细胞生长环境产生不利影响，具有良好的细胞相容性[25-26]。预实验结果显示，在体外藏红花素水凝胶可持续释放藏红花素达21 d以上，能够使藏红花素较持续稳定的发挥作用。
制备藏红花素水凝胶后进一步观察其对软骨细胞与MC3T3-E1细胞的影响。CCK-8检测结果显示，藏红花素15组、藏红花素20组可促进人软骨细胞的增殖，藏红花素25组抑制人软骨细胞的增殖，藏红花素15组、藏红花素20组、藏红花素25组可促进MC3T3-E1细胞的增殖，表明水凝胶中释放的藏红花素量过高会抑制人软骨细胞的增殖，具有一定的细胞毒性，因此，水凝胶中负载的藏红花素适宜剂量还有待进一步探讨。软骨细胞除了分裂能力较弱外，迁移能力也较弱，难以向损伤区域迁移，导致软骨损伤后的自愈能力较弱[27]。此次实验结果显示，3种剂量的藏红花素水凝胶均可促进人软骨细胞的迁移，并且呈现剂量依赖性，后续将通过动物实验进一步验证藏红花素水凝胶对体内软骨细胞迁移的影响。
SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖是维持软骨细胞表型的标志，在透明软骨中高度表达[28-30]。糖胺聚糖是软骨细胞外基质的重要组成成分，在维持软骨组织的完整性方面具有重要作用[31]。此次实验结果显示，3种剂量的藏红花素水凝胶可促进人软骨细胞SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖基因的表达以及糖胺聚糖的合成，并且呈现剂量依赖性，表明藏红花素水凝胶可维持软骨细胞表型，促进软骨细胞外基质的合成。RUNX2作为骨特异性转录因子，通过调控成骨细胞特异性细胞外基质蛋白与基因表达参与成骨细胞的分化周期，促进前成骨细胞中各种矿化相关蛋白和基因的转录和活化，参与骨形成与骨吸收过程[32]。RUNX2可与成骨细胞特异性顺式作用原件结合，从而调控碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素的转录和翻译，从而促进细胞的成骨分化，加速细胞外基质沉积[33]。此次实验结果显示，3种剂量的藏红花素水凝胶可促进MC3T3-E1细胞中RUNX2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素基因的表达，并且呈现剂量依赖性，表明藏红花素水凝胶可促进MC3T3-E1细胞合成细胞外基质，进而促进成骨分化。同样，碱性磷酸酶活性检测与茜素红染色进一步验证了藏红花素水凝胶可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。
Wnt3a可以通过β-catenin信号传导促进软骨细胞增殖，并通过Ca2C信号传导诱导体内软骨细胞分化[34]。转化生长因子β信号通路在软骨发育及再生中占据着核心地位，该通路被激活后，下游的Smad2/3被激活并与Smad4形成蛋白复合物，然后磷酸化并转移到细胞核中，进而促进软骨细胞靶基因(如SOX9、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖)的转录[35]。丝裂原活化蛋白激酶的亚族p38和细胞外调节蛋白激酶1/2在调控软骨细胞增殖和相关基因表达中发挥着重要的作用[36]。因此，作者推测藏红花素水凝胶可能通过调控上述通路促进软骨细胞的增殖、迁移与细胞外基质的合成，并且这些通路可能也此参与了藏红花素水凝胶促进成骨分化的过程，后续实验将进行验证。
综上所述，藏红花素水凝胶可促进软骨细胞的增殖、迁移及软骨细胞外基质的合成，促进MC3T3-E1细胞的增殖与成骨分化，并且藏红花素20组是此次实验中3种剂量水凝胶中综合效果较好的组别。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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藏红花素水凝胶对软骨细胞与MC3T3-E1细胞的影响

Effect of crocin hydrogel on chondrocytes and MC3T3-E1 cells

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