温敏抗菌水凝胶治疗感染性骨缺损

doi:10.12307/2025.498

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

透明质酸：是一种高分子聚合物，由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺通过β-1，3-和β-1，4-配糖键相连组成，这种独特的结构使得透明质酸在体内具有多种功能，在医学领域有着广泛应用。
氧化葡聚糖：是一种通过化学方法改性的葡聚糖，它的化学结构以葡萄糖为基本单位，通过不同的糖苷键连接形成多糖链，主要用于生物医学领域。

背景：治疗感染性骨缺损的传统方法为彻底清创、抗生素浸渍的骨水泥填充后进行自体骨移植，但存在抗生素浓度不足与耐药性、骨量有限等问题，因此，寻求在感染部位局部可控释放抗生素并促进骨修复的双功能生物材料具有重要临床意义。

目的：设计一种基于透明质酸和氧化葡聚糖组成的可注射水凝胶作为万古霉素的局部给药系统，以求治疗感染的同时促进骨再生。
方法：①制备载万古霉素的透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，表征水凝胶的形貌、力学性能与体外药物释放。②将透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶、载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶分别与兔骨髓间充质干细胞共培养，通过活死染色、CCK-8实验检测细胞活性与增殖；成骨诱导后，进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、RUNX2免疫荧光染色与RT-qPCR检测(骨钙素、骨形态发生蛋白2 mRNA表达)，评估兔骨髓间充质干细胞的成骨分化。③将上述两种水凝胶分别与大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)共培养，检测水凝胶的抗菌能力。④取30只家兔，建立左侧桡骨中段1.5 cm感染性骨缺损模型，造模2周后随机分3组干预：空白组(n=10)不进行任何处理，对照组(n=10)骨缺损部位注射透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，实验组(n=10)骨缺损部位注射载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶。注射12周后取材，分别进行Micro-CT扫描、组织形态观察、RT-qPCR检测(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6 mRNA表达)、免疫组化染色。

结果与结论：①载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶具有良好的多孔结构，孔径在100-300 μm之间，具有良好的力学性能与体外药物缓释性能。②活死染色、CCK-8实验证实载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶具有良好的生物相容性；碱性磷酸酶染色、茜素红染色、RUNX2免疫荧光染色与RT-qPCR检测结果显示，两种水凝胶均可促进兔骨髓间充质干细胞的成骨分化。③相较于透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶可显著抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的生长。④Micro-CT扫描结果显示，实验组骨缺损部位新生骨的骨体积分数、骨密度均高于空白组、对照组(P < 0.05)；骨组织形态观察结果显示，实验组骨缺损的修复效果优于空白组、对照组；实验组骨缺损部位肿瘤坏死因子α、白细胞介素6 mRNA表达均低于空白组、对照组(P < 0.05)；免疫组化染色显示，实验组、对照组骨缺损部位骨钙素、RUNX2蛋白表达均高于空白组(P < 0.05)。表明载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶能够有效促进感染状态下的骨再生。

https://orcid.org/0009-0008-8140-5507 (任波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 感染性骨缺损, 药物递送系统, 透明质酸, 氧化葡聚糖, 水凝胶, 万古霉素, 骨修复, 工程化骨材料

Abstract: BACKGROUND: The traditional method for treating infected bone defects is thorough debridement, filling with antibiotic-impregnated bone cement, and then autologous bone transplantation. However, there are problems such as insufficient antibiotic concentration and drug resistance, and limited bone mass. Therefore, it is of great clinical significance to seek dual-functional biomaterials that can locally release antibiotics at the site of infection and promote bone repair.
OBJECTIVE: To design an injectable hydrogel composed of hyaluronic acid and oxidized dextran as a local delivery system for vancomycin to treat infection and promote bone regeneration.
METHODS: (1) Vancomycin-loaded hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogels were prepared to characterize the morphology, mechanical properties, and in vitro drug release of the hydrogels. (2) Hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogels and vancomycin-loaded hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogels were co-cultured with rabbit bone marrow mesenchymal stem cells. Cell activity and proliferation were detected by live-dead staining and CCK-8 assay. After osteogenic induction, alkaline phosphatase staining, alizarin red staining, RUNX2 immunofluorescence staining, and RT-qPCR detection (osteocalcin and bone morphogenetic protein 2 mRNA expression) were performed to evaluate the osteogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells. (3) The above two hydrogels were co-cultured with Escherichia coli (or Staphylococcus aureus) to detect the antibacterial ability of the hydrogels. (4) Thirty rabbits were selected to establish a 1.5 cm infected bone defect model in the middle of the left radius. Two weeks after modeling, they were randomly divided into three intervention groups: the blank group (n=10) did not receive any treatment; the control group (n=10) was injected with hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogel at the bone defect site; the experimental group (n=10) was injected with vancomycin-loaded hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogel at the bone defect site. 12 weeks after injection, the samples were collected for Micro-CT scanning, tissue morphology observation, RT-qPCR detection (tumor necrosis factor α, interleukin 6 mRNA expression), and immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Vancomycin-loaded hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogel had a good porous structure with a pore size between 100-300 μm, and had good mechanical properties and in vitro drug sustained release performance. (2) Live-dead staining and CCK-8 assay results confirmed that vancomycin-loaded hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogel had good biocompatibility. Alkaline phosphatase staining, alizarin red staining, RUNX2 immunofluorescence staining, and RT-qPCR test results showed that both hydrogels could promote osteogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells. (3) Compared with hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogel, vancomycin-loaded hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogel could significantly inhibit the growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus. (4) Micro-CT scanning results showed that the bone volume fraction and bone density of new bone in the bone defect area of the experimental group were higher than those of the blank group and the control group (P < 0.05). The bone tissue morphology observation results showed that the experimental group had better repair effect of bone defects compared with the blank group and control group. The expression of tumor necrosis factor α and interleukin 6 mRNA in the bone defect site in the experimental group was lower than that in the blank group and control group (P < 0.05). Immunohistochemical staining showed that the protein expressions of osteocalcin and RUNX2 at the site of bone defects in the experimental group and control group were higher than those in the blank group (P < 0.05). These findings indicate that vancomycin-loaded hyaluronic acid/oxidized dextran hydrogel can effectively promote bone regeneration under infection.

Key words: infected bone defect, drug delivery system, hyaluronic acid, oxidized dextran, hydrogel, vancomycin, bone repair, engineered bone material

中图分类号:

任波, 唐永亮, 李妮, 刘邦定. 温敏抗菌水凝胶治疗感染性骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7269-7277.

Ren Bo, Tang Yongliang, Li Ni, Liu Bangding. Thermosensitive antibacterial hydrogel for treatment of infected bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(34): 7269-7277.

图/表（结果） 9

2.1 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的构建及表征如图1A所示，载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶具有稳定的成胶性能；扫描电子显微镜下可见载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶具有良好的多孔结构，孔径在100-300 μm之间，见图1B。对载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶进行流变检测，发现随着温度的升高，水凝胶的储能模量(G’)始终大于耗能模量(G’’)，见图1C，证实该水凝胶具有良好的力学性能。载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的体外药物释放曲线显示，在最初的1周内万古霉素呈现快速释放，释放的药物量为(37.07±2.61)%，而后药物释放逐渐减缓，在第42天释放达到平衡，万古霉素的持续释放量为(58.54±3.94)%，见图1D。

2.2 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的生物相容性培养1，3 d的活死染色结果显示，各组的活细胞数量(绿色荧光)明显多于死细胞数量(红色荧光)，并且3组之间活细胞和死细胞数量无明显差别，见图2A所示。
CCK-8检测结果显示，随着培养时间的延长，各组细胞吸光度值增加，相同培养时间下3组细胞吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2B所示，表明载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶具有良好的体外生物相容性。

2.3 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的体外抗菌性能大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别是革兰阴性菌和革兰阳性菌的代表性微生物[23-24]。随着培养时间的延长，空白组与对照组金黄色葡萄球菌吸光度值呈增加趋势，实验组金黄色葡萄球菌吸光度值呈稳定趋势，并且相同培养时间下实验组金黄色葡萄球菌吸光度值明显低于空白组、对照组(P < 0.05)，见图3A。说明实验组中万古霉素在不断缓释发挥作用，而氧化葡聚糖和透明质酸并不具备抗菌性，这与先前的研究结果一致。
随着培养时间的延长，空白组与对照组大肠杆菌吸光度值呈增加趋势，实验组大肠杆菌吸光度值呈稳定趋势，并且相同培养时间下实验组大肠杆菌吸光度值明显低于空白组、对照组(P < 0.05)，见图3B。说明实验组中万古霉素在不断缓释发挥作用，而氧化葡聚糖和透明质酸并不具备抗菌性。同时还可以看出，载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶对大肠杆菌的抑制作用要强于对金黄色葡萄球菌的抑制作用。

以上结果说明，载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶具有良好的体外广谱抗菌性。
2.4 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的体外促成骨性能各组骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果，见图4A。碱性磷酸酶染色结果显示，实验组与对照组可见大量明显聚集的碱性磷酸酶阳性染色，空白组碱性磷酸酶阳性染色少于对照组、空白组。茜素红染色结果显示，实验组钙结节数量最多，空白组钙结节数量最少。定量分析结果显示，实验组、对照组碱性磷酸酶活性、钙结节形成均高于空白组(P < 0.01或P < 0.001)，实验组与对照组碱性磷酸酶活性、钙结节形成比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图4B，C。结果表明，两种水凝胶可以通过促进碱性磷酸酶表达及钙结节生成调节体外成骨活性。

RT-qPCR检测结果显示，实验组、对照组骨形态发生蛋白2、骨钙素mRNA表达均高于空白组(P < 0.01)，实验组与对照组骨形态发生蛋白2、骨钙素mRNA表达比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图5。结果证实，两种水凝胶胶能够通过上调骨形态发生蛋白2和骨钙素的表达促进体外成骨活性。

免疫荧光染色结果显示，实验组RUNX2蛋白表达高于空白组、对照组(P < 0.001)，空白组与对照组RUNX2蛋白表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

2.5 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的体内实验结果
2.5.1 实验动物数量分析 30只家兔全部进入结果分析。
2.5.2 各组家兔桡骨标本Micro-CT扫描结果 Micro-CT扫描结果显示，实验组家兔桡骨缺损部位已有大量新生骨填充，并且骨小梁较为致密，而空白组和对照组家兔桡骨缺损部位可见少量新生骨填充，并且骨小梁较疏松，见图7A。Micro-CT扫描定量分析结果显示，实验组桡骨缺损处新生骨骨体积分数、骨密度均高于空白组、对照组(P < 0.05或P < 0.001)，对照组桡骨缺损处新生骨骨体积分数、骨密度均高于空白组(P < 0.05)，见图7B，C。

2.5.3 各组家兔桡骨标本组织形态观察瑞氏吉姆萨染色结果显示，空白组和对照组桡骨标本中存在大量细菌，骨表面有明显侵蚀现象，表明感染没有得到控制；实验组桡骨标本中几乎没有细菌，见图8A。因此，透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶中万古霉素的持续释放可以有效地清除感染部位的细菌，为骨缺损部位提供适合骨再生的无菌的微环境。
苏木精-伊红染色结果显示，空白组和对照组骨缺损部位有炎症细胞浸润，组织纤维排列紊乱，无明显新生骨小梁和骨组织形成；实验组骨缺损部位未见明显炎症细胞浸润，新生骨小梁排列整齐，见图8B。Masson结果染色显示，空白组骨缺损部位无新生骨和胶原；对照组可见少量新生骨，胶原排列紊乱；实验组骨缺损部位中有明显新骨与胶原形成，见图8C。 2.5.4 各组家兔桡骨标本周围肉芽组织炎症反应检测 RT-qPCR检测结果显示，实验组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6 mRNA表达均低于空白组、对照组(P < 0.001)，空白组与对照组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6 mRNA表达比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图8D，E。结果表明，载有万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶能够通过下调炎症因子的表达抑制感染。

2.5.5 各组家兔桡骨标本免疫组化染色结果免疫组化染色结果显示，实验组与对照组RUNX2、骨钙素蛋白表达均高于空白组(P < 0.001)，实验组与对照组RUNX2、骨钙素蛋白表达比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图9。

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引言

由开放性骨折、手术和慢性疾病等引起的感染性骨缺损常可导致肢体坏死、功能障碍，严重者甚至截肢，目前仍是临床治疗难题[1-3]。当病原菌侵入骨骼系统时会导致局部持续性炎症反应和骨组织的破坏，阻碍骨再生，进而形成骨缺损[4]。目前治疗感染性骨缺损把控制感染放在首要目标，传统治疗方法为彻底清创、抗生素浸渍的骨水泥填充后进行自体骨移植，但常常会出现抗生素浓度不足、耐药性产生等缺点[5-6]；此外，长期进行抗生素治疗还会产生肾毒性及胃肠道不良反应。在骨重建方面，虽然自体骨移植是目前临床治疗的金标准，但也存在供体骨量有限及供区并发症的缺点[7-8]。因此，为了在抗感染和骨再生之间实现平衡，寻求在感染部位局部可控释放抗生素并促进骨修复的双功能生物材料具有重要临床意义。
近年来，生物材料在组织工程中的应用受到了广泛关注。其中，水凝胶作为一种具有良好生物相容性和可塑性的材料，被广泛应用于药物递送来治疗感染性骨缺损[9-11]。
水凝胶的互连多孔结构有利于药物扩散，水凝胶的亲水性为局部组织提供了有利的微环境，并表现出与组织和细胞的良好亲和力[12]。透明质酸是一种亲水性聚合物，具有无免疫原性、优异的生物相容性和抗蛋白质吸附性等特点[13]，作为水凝胶和药物输送系统的成分在生物医学领域有着广泛应用。透明质酸具有多个反应性端基，可为各种药物和材料提供结合位点[14-15]。氧化葡聚糖是一种生物可降解材料，由于可被人体组织代谢和降解而得到广泛应用[16]。透明质酸和氧化葡聚糖可以通过简单混合的方法相互交联形成具有稳定性能的水凝胶，并且不需要额外的化学交联剂，具有良好的生物相容性，并且形成的水凝胶能够模拟细胞外基质，实现对细胞的高黏附性。万古霉素是一种三环糖肽抗生素，对成骨细胞分化没有毒性作用，并且能够有效杀死感染性骨缺损中最常见的病原体金黄色葡萄球菌，因此被广泛认为是治疗感染性骨缺损的首选抗生素[17-19]。透明质酸和氧化葡聚糖相结合的复合水凝胶，为感染性骨缺损局部递送万古霉素提供了一种优良的载体[20]。
此次实验将万古霉素负载于透明质酸/氧化葡聚糖复合水凝胶中构建了一种用于治疗感染性骨缺损的水凝胶药物缓释系统，拟通过细胞实验验证该水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响，通过体外抗菌实验验证该水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制情况，并将该药物递送体系注射至家兔感染性骨缺损模型内，研究其在感染微环境下的治疗效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验、体内动物实验，组间比较进行t检验或单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年8月至2024年2月在西安交通大学附属第一医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞与菌种兔骨髓间充质干细胞购自苏州赛业公司；大肠杆菌(E.coli，ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)均购自上海市鲁微科技有限公司。
1.3.2 主要试剂低糖DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；万古霉素购自西格玛奥尔德里奇(上海)；青霉素链霉素双抗和胰蛋白酶-EDTA(0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA)溶液购自Sigma-Aldrich公司；CCK-8、钙黄绿素-AM-PI 染色试剂盒、RIPA裂解缓冲液、BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒和碱性磷酸酶检测试剂盒均购自碧云天有限公司(中国上海)；PBS、DAPI溶液、TRITC类淀粉样蛋白和40 g/L多聚甲醛购自Solarbio公司(中国北京)；兔骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基和茜素红染色剂购自Cyagen公司(美国圣克拉拉)；FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit、ABScript Ⅱ RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover 和
Universal SYBR Green Fast qPCR Mix购自Abclonal Co.(中国武汉)；氯化十六烷基吡啶溶液(索莱宝，北京)；RUNX2和骨钙素抗体购自博奥森生物技术有限公司(北京)；异硫氰酸荧光素(麦克斯玛生物科技有限公司，中国)。
1.3.3 主要仪器紫外可见分光光度计(Shimadzu Company，Japan)；扫描电子显微镜(Zeiss Sigma 300)；流变仪(Anton Paar)；荧光显微镜(Olympus FV 1000)；Micro-CT扫描仪(比利时，孔蒂奇SkyScan 1076扫描仪)。
1.3.4 实验动物 8周龄雄性家兔33只，体质量2.5-3.0 kg，购自西安市中心医院动物实验中心，许可证号：SYXK(陕)2021-005。2只1周龄新西兰乳兔购自西安市坊洲动物实验室。动物实验已获得西安市中心医院动物伦理委员会批准(批准号：院医伦[2021]52号)。
1.4 实验方法
1.4.1 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的合成将50 mg透明质酸溶于去离子水中，制备500 mg/mL的透明质酸溶液。将氧化葡聚糖溶于氢氧化钠溶液(100 mg/mL)中，制备最终质量浓度为20 mg/mL的氧化葡聚糖溶液。将透明质酸溶液和氧化葡聚糖溶液以体积比1∶1混合，将溶液的最终pH值调节为7.2，随后将万古霉素加入到混合溶液中，最终万古霉素的质量浓度为10 mg/mL[21]。以同样的方法制备不含有万古霉素的透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，作为对照组。
1.4.2 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的药物释放将载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶与PBS(pH=7.4)以1∶4的体积比一起注入离心管中，置于恒温培养箱中振荡(37 ℃、100 r/min)。在预定好的间隔时间点，收集1 mL PBS，并加入等量全新的无菌PBS。使用紫外可见分光光度计在280 nm波长处测量收集PBS的吸光度值，计算药物累计释放率。
1.4.3 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的表征将载万古霉素的透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶在-80 ℃下冷冻6 h，然后在-70 ℃下冻干 48 h，以确保水凝胶中的水分充分排出，对样品进行喷金溅射涂层处理，通过扫描电子显微镜观察载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的表面形态。使用流变仪测定水凝胶的流动变形特性。在 25 ℃下将载万古霉素的透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶涂抹到流变仪板上，然后以0.5 ℃/min的速度加热，温度范围为0-100 ℃，在恒定应变(0.1%)和频率(1 Hz)条件下，使用流变仪测量水凝胶存储模量(G′)和损耗模量(G′′)的变化。
1.4.4 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的生物相容性
兔骨髓间充质干细胞的分离培养：取新西兰乳兔，脱颈处死后暴露四肢骨，用装有1 mL低糖DMEM培养基的注射器对四肢骨髓腔反复冲洗，直至骨髓腔冲洗液变清亮，收集骨髓清洗液至培养皿中，反复吹打骨髓清洗液以消除细胞团，获得细胞悬液[22]。将细胞悬浮在含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的低糖DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育。传至第3代时用于后续细胞实验。
细胞与水凝胶共培养：将兔骨髓间充质干细胞接种于48孔板中，细胞密度为8×103/孔，分3组处理：空白组不进行任何处理，对照组加入200 μL透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，实验组加入200 μL载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，每组3复孔。
活死染色：培养第1，3天，去除培养基，将活/死染色液加入到孔板中，室温避光条件下孵育30 min，去除染色液，用PBS冲洗2次以去除多余的染色液，置于荧光显微镜下观察并拍照。
细胞增殖检测：培养1，4，7 d，每孔中加入CCK-8染色液，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中避光孵育3 h，使用紫外可见分光光度计在450 nm处测量吸光度值。
1.4.5 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的体外促成骨性能
碱性磷酸酶染色：将兔骨髓间充质干细胞接种到6孔板中，细胞密度为 8×104/孔，在培养 24 h后观察到80%以上的细胞贴壁，更换为成骨诱导培养基，分3组处理：空白组不进行任何处理，对照组加入1 mL透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，实验组加入1 mL载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，每组3复孔。成骨诱导培养7 d后，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，室温下加入 BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试避光孵育1 h，置于显微镜下观察并拍照。同时，用RIPA裂解缓冲液充分裂解各组细胞，12 000×g离心1 min，收集上清液于 96孔板中，依次加入显色底物和二乙醇胺缓冲液于37 ℃孵育30 min，加入反应终止液，使用紫外可见分光光度计在405 nm波长处测量吸光度值。
茜素红染色：将兔骨髓间充质干细胞接种到24孔板中，细胞密度为2×104/孔，在培养 24 h后观察到80%以上的细胞贴壁，更换为成骨诱导培养基，分3组处理：空白组不进行任何处理，对照组加入0.2 mL透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，实验组加入0.2 mL载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，每组3复孔。成骨诱导培养14 d后，用PBS洗涤细胞2次，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，每孔加入茜素红染液孵育1 h，用PBS漂洗样品2次以除去过量的染色液，置于显微镜观察下观察钙结节数量。同时，使用10%氯化十六烷基吡啶溶液溶解所有钙结节，使用紫外可见分光光度计在540 nm处测量吸光度值。
RUNX2免疫荧光染色：细胞接种与分组处理同茜素红染色。成骨诱导培养14 d后，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，用PBS润洗3次；用0.1%TritonX-100透化细胞15 min，用体积分数10%山羊血清封闭细胞1 h；加入RUNX2抗体(稀释比1∶200)4 ℃下孵育过夜，加入山羊抗兔二抗(稀释比1∶500)于37 ℃下孵育1 h；加入DAPI染液对细胞核染色5 min，置于荧光显微镜下观察并拍照，使用Image J软件统计阳性细胞数量。
RT-qPCR检测：细胞接种与分组处理同茜素红染色。成骨诱导培养14 d后，使用快速提取法提取细胞总RNA，对RNA的纯度进行检测。使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，随后使用2×Fast SYBR Green Master Mix在LightCycler 480上进行qPCR扩增，检测骨形态发生蛋白2与骨钙素mNRA表达。特异基因引物序列见表1。以标准化GAPDH作为管家基因，使用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达。
1.4.6 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的体外抗菌性能将大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)放入LB培养基中，菌液浓度1×107 CFU/mL，置于37 ℃恒温振荡培养箱(振荡频率120 r/min)中孵育过夜，分3组处理：空白组不进行任何处理，对照组加入0.2 mL透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，实验组加入0.2 mL载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，每组设置3个平行对照。培养12，24，48 h，吸取100 μL细菌悬浮液到96孔培养板中，使用紫外可见分光光度计在 600 nm 波长处检测吸光度值，绘制细菌生长曲线。
1.4.7 载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的体内实验
感染性骨缺损动物模型的建立与分组干预：取33只家兔，腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后暴露左前臂桡骨，在桡骨中段截取长度为 1.5 cm的骨缺损，然后将浸泡在金黄色葡萄球菌悬浮液(1×107 CFU/mL)中的可吸收明胶海绵植入缺损部位以诱导感染，逐层缝合切口。术后不进行抗生素治疗。2周后随机挑取3只家兔，观察创面是否有窦道形成并获取桡骨标本，进行Giemsa染色和苏木精-伊红染色，以进一步验证感染性骨缺损模型的建立。验证造模成功后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉剩余30只家兔，暴露感染性骨缺损区后进行简单清创和冲洗，采用随机数字表法分3组干预：空白组(n=10)不做任何处理，对照组(n=10)骨缺损区注射0.5 mL透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，实验组(n=10)骨缺损区注射0.5 mL载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶，逐层缝合切口。术后允许家兔自由活动。注射12周后，麻醉后处死所有家兔，获取左前臂桡骨标本并保存在40 g/L多聚甲醛溶液中，以进行后续相关检测。
Micro-CT扫描：获取桡骨标本后，通过Micro-CT扫描分析骨再生情况，使用多模态三维可视化软件重建每个样本的三维图像，对缺损部位指定感兴趣区域内的骨体积分数和骨密度进行分析，以定量分析新骨形成。
组织形态观察：桡骨样本在Micro-CT扫描后进行分级乙醇系列脱水和脱钙处理，然后将样本固定在石蜡中，切成3.0-4.0 μm厚的切片，分别进行苏木精-伊红、Masson三色与吉姆萨染色，置于显微镜下观察并拍照。

RT-qPCR检测：提取切口处的肉芽组织，使用快速提取法提取组织总RNA，采用RT-qPCR检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素6 mNRA表达。检测方法同上。基因引物设计见表1。

免疫组化染色：将脱钙后的骨组织包埋于石蜡中，然后切成5 μm大小的薄片，将切好的薄片分别与RUNX2和骨钙素抗体在4 ℃下孵育过夜，与异硫氰酸荧光素缀合的山羊抗兔疫球蛋白IgG抗体孵育1 h，置于显微镜下观察图像并拍照，使用Image J软件计算RUNX2和骨钙素阳性细胞数量。
1.5 主要观察指标载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的形貌、力学性能及体外药物释放、生物相容性、抗菌、促成骨分化性能，以及体内修复感染性骨缺损的效果。
1.6 统计学分析所有实验数据均从3个独立实验中获得，并以x±s格式表示。使用SPSS 19.0软件进行统计分析，组间比较进行t检验或单因素方差分析。P < 0.05为组间差异有显著性意义。该文统计学方法已经西安市中心医院生物统计学专家审核。

讨论

在骨缺损修复过程中，病原菌引起的感染是影响局部组织和骨再生能力的重要因素[25]。病原体可通过释放酸性物质和蛋白酶等方式直接损伤细胞外基质成分，降低骨修复能力，但更重要的是可以通过直接抑制成骨细胞和促进破骨细胞形成来抑制骨再生[26]。根据这一病理机制，此次实验将万古霉素负载到透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶内构建了一种可注射药物递送系统，通过局部缓释万古霉素抑制细菌的增殖并改善软局部成骨微环境，从而促进骨再生。万古霉素是一个高度交联的七肽糖苷配基结构，该结构使其能够与细菌细胞壁肽聚糖前体末端结合来发挥作用，尤其是革兰阳性菌，是治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌感染的首选药物[27-28]。已有研究表明，透明质酸可以通过和钛纳米管结合来实现药物的可控性，并且通过聚多巴胺修饰后搭载万古霉素能够实现更好的抗菌性能[29]。此次实验以透明质酸和氧化葡聚糖作为基础材料构建了具有良好生物相容性和药物缓释性的载体，通过局部微创注射方式将万古霉素递送至感染性骨缺损部位，维持有效药物浓度的同时减轻了药物带来的不良反应。载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶具有良好的孔隙结构，这种多孔隙结构有利于万古霉素在水凝胶网络内自由扩散，并缓释到周围微环境中[30]；此外，该水凝胶具有良好的力学性能，保证了在注射过程中不会发生形变。体外药物释放实验表明，水凝胶中万古霉素在初始的7 d内存在快速释放情况，这是由于药物释放主要通过材料降解和扩散进行调节，在初始阶段，水凝胶尚未开始降解，药物主要通过自由扩散释放，这也有利于万古霉素在短时间内快速达到有效浓度[6，31]；而后缓慢释放长达49 d，释放量达到将近60%，满足临床用药时间需求[21，32]。总的来说，此次实验制备的复合水凝胶展现了较好的孔隙率、力学性能以及药物缓释性能，这对万古霉素在局部持续释放、减少局部不良反应具有重要意义。
成骨细胞与细菌在植入生物材料表面的竞争黏附对于骨再生至关重要[33]，如果细菌率先附着，会在植入物表面逐渐形成生物膜，随后合成胞外多糖，进而表现出对抗生素及免疫系统强大的耐受性，使感染难以去除，最终导致感染性骨不连[34]。此次实验通过万古霉素的原位释放来抑制缺损部位金黄色葡萄球菌的增殖，从而改善缺损局部的成骨微环境。研究表明，细菌侵入后的4-6 h是形成生物膜的关键时期[35-36]。此次实验结果表明，载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶能够早期迅速释放万古霉素，并且体外抗菌实验证实，载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶能够同时杀灭大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，并且抑菌效果长达48 h；体内抗菌实验表明，该复合水凝胶植入体内后可以有效杀灭金黄色葡萄球菌，减轻感染状态。对于骨科植入物来说，除了关注抗菌活性，其生物相容性和成骨活性更应得到重视。体外实验结果表明，在加入万古霉素前后透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶的生物相容性不发生明显变化，未对骨髓间充质干细胞的活性造成影响。碱性磷酸酶是一种早期成骨分化标志物，在细胞外基质成熟后表达，参与骨重建过程[37]，而茜素红能够与成骨细胞分泌的钙结节结合，用来分析成骨细胞的后期矿化作用[9]。基于此，此次实验研究了载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶体外对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，结果证实载万古霉素透明质酸/氧化葡水凝胶可以促进早期及晚期的成骨分化。体内实验结果表明，载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖凝胶可以通过促进RUNX2及骨钙素的表达、抑制金黄色葡萄球菌的活性，在体内促进感染性骨缺损的骨修复。
此次实验采用桡骨中段切除填充浸泡金黄色葡萄球菌菌液明胶海绵的方法来诱导家兔感染性骨缺损模型，相比较于股骨钻孔并且直接注射金黄色葡萄球菌菌液诱导感染的方法，直接切除桡骨并且使用可吸收明胶海绵填充具有造模稳定且简单的优点。家兔桡骨显露容易且具有非承重性，切除后不需要额外固定[38]；使用可吸收明胶海绵可以局限金葡菌菌液防止菌液流失，有效诱导感染。载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶注射可以通过抑制缺损局部细菌的增殖来阻碍感染的发展，从而促进成骨细胞的分化，改善缺损局部的成骨微环境，从而促进骨再生。然而，该研究也存在一定的局限性和不足：并未设置万古霉素的浓度梯度来进行疗效的比对，并且关于体内体外抗菌性的验证不够全面，详细机制还需进一步探究。
此次实验以透明质酸和氧化葡聚糖混合凝胶作为载体，通过物理共混的方法将万古霉素装载入复合水凝胶中，从而构建了一种具有抗菌和促成骨双功能的药物缓释体系，该复合水凝胶在体外展现了良好的缓释性能、生物相容性、抗菌性能与促成骨性能，并且该复合水凝胶通过在感染性骨缺损局部释放万古霉素杀灭局部病原菌、改善成骨微环境，从而抑制了感染的发展，有效促进骨再生。因此，作为一种新型的可注射双功能水凝胶制剂，载万古霉素透明质酸/氧化葡聚糖水凝胶可在原位缓释并保持万古霉素的疗效，从而调节骨再生，为移植物相关感染的治疗提供了一种新途径。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程