天然提取与人工合成羟基磷灰石颗粒理化性能及刺激胶原蛋白分泌的差异

doi:10.12307/2025.495

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (34): 7278-7285.doi: 10.12307/2025.495

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

天然提取与人工合成羟基磷灰石颗粒理化性能及刺激胶原蛋白分泌的差异

石彤彤，邓荣霞，张建光

深圳市迈捷生命科学有限公司，广东省深圳市 518000

收稿日期:2024-07-01 接受日期:2024-09-05 出版日期:2025-12-08 发布日期:2025-01-17
通讯作者: 张建光，博士，高级研发工程师，深圳市迈捷生命科学有限公司，广东省深圳市 518000
作者简介:石彤彤，女，1998年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，硕士，主要从事生物材料研究。
基金资助:
深圳市科技重大专项项目(KJZD20230923113959013)，项目名称：重202327245人工肌腱用复合材料关键技术研发，项目负责人：张建光

Differences in physicochemical properties and collagen secretion stimulation of natural and synthetic hydroxyapatite particles

Shi Tongtong, Deng Rongxia, Zhang Jianguang

Shenzhen Maijie Life Science Co., Ltd., Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Received:2024-07-01 Accepted:2024-09-05 Online:2025-12-08 Published:2025-01-17
Contact: Zhang Jianguang, MD, Senior engineer, Shenzhen Maijie Life Science Co., Ltd., Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
About author:Shi Tongtong, MS, Shenzhen Maijie Life Science Co., Ltd., Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
Supported by:
Shenzhen Science and Technology Major Project, No. KJZD20230923113959013 (to ZJG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

羟基磷灰石：是人体骨骼的主要无机成分，因具有良好的生物相容性、低免疫原性等优良特性而被用于人体组织修复，例如骨修复、耳鼻整形、面部注射填充等领域。
胶原蛋白：是皮肤的重要组成成分，主要起支撑、弹性的作用。随着年龄增长，皮下软组织缺失而导致了皱纹、褶皱的产生，而羟基磷灰石可以即时填充皮肤组织，激活成纤维细胞、刺激胶原生成。

背景：目前，羟基磷灰石因良好的生物相容性和低免疫性在面部填充剂领域得到广泛应用，羟基磷灰石的制备方法主要为天然提取与人工合成，而对于天然提取与人工合成羟基磷灰石的对比研究较少，尤其是二者在刺激胶原蛋白分泌效果上的差异。

目的：探究天然提取及市售人工合成羟基磷灰石颗粒的理化性能以及刺激胶原蛋白分泌的差异。
方法：①取猪骨天然羟基磷灰石颗粒与2种市售人工合成羟基磷灰石颗粒(分别记为SYN1、SYN2)，表征3种材料的微观形貌与表面元素含量。②将不同质量浓度(1，5，10 mg/mL)的3种材料分别与人皮肤成纤维细胞共培养，通过CCK-8检测细胞增殖。将5 mg/mL的3种材料分别与人皮肤成纤维细胞共培养，通过CCK-8检测与扫描电镜观察细胞黏附，RT-PCR、ELISA、Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白的表达。③取12只新西兰兔，其中6只背部皮下注射天然羟基磷灰石与2%羧甲基纤维素钠凝胶混合物，另6只背部皮下注射SYN2与2%羧甲基纤维素钠凝胶混合物，注射1，3个月后取材，进行Masson及天狼星红染色。

结果与结论：①扫描电镜下可见天然羟基磷灰石颗粒的结晶晶粒更规则、均匀，颗粒间均布孔洞，SYN1晶粒较小，排布密集，SYN2晶粒呈不规则状，天然羟基磷灰石颗粒、SYN1、SYN2的中位粒径分别为38，24，40 μm。天然羟基磷灰石含Mg、Zn，SYN1不含Mg、Zn，SYN2不含有Zn。②CCK-8检测显示，1，5 mg/mL的天然羟基磷灰石与SYN2促进人皮肤成纤维细胞的增殖，5，10 mg/mL的SYN1抑制人皮肤成纤维细胞的增殖。天然羟基磷灰石颗粒表面黏附的细胞数量多于SYN1、SYN2，并且天然羟基磷灰石颗粒表面的细胞铺展良好，可见丝状伪足。RT-PCR、ELISA、Western blot检测结果显示，天然羟基磷灰石颗粒组Ⅰ型胶原蛋白表达高于SYN1组、SYN2组。③Masson及天狼星红染色结果显示，天然羟基磷灰石颗粒组注射1，3个月后的皮下组织Ⅰ型胶原形成量均多于SYN2组。④结果表明，相比人工合成羟基磷灰石颗粒，天然羟基磷灰石颗粒具有更丰富的微量元素分布，可以更好地促进成纤维细胞黏附、增殖与胶原蛋白再生。

https://orcid.org/0009-0000-1229-1747(石彤彤)；https://orcid.org/0000-0002-6713-4957(张建光)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 羟基磷灰石, 天然提取, 人工合成, 细胞增殖, 胶原再生, 注射填充材料, 工程化皮肤材料

Abstract: BACKGROUND: At present, hydroxyapatite has been used more and more widely in the field of facial fillers due to its good biocompatibility and low immunity. The main sources are divided into natural extraction and artificial synthesis. However, there are few comparative studies on natural extraction and artificial synthesis of hydroxyapatite, especially the difference in stimulating collagen secretion between the two.
OBJECTIVE: To investigate the physicochemical differences between naturally derived and commercially available synthetic calcium hydroxyapatite particles and promoting collagen secretion.
METHODS: (1) Natural hydroxyapatite particles from pig bones and two kinds of commercially available synthetic hydroxyapatite particles (denoted as SYN1 and SYN2) were used to characterize the microstructure and surface element content of the three kinds of materials. (2) The three kinds of materials with different mass concentrations (1, 5, and 10 mg/mL) were co-cultured with human skin fibroblasts. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The three kinds of materials at 5 mg/mL were co-cultured with human skin fibroblasts. Cell adhesion was observed by CCK-8 assay and scanning electron microscopy. The expression of type I collagen was detected by RT-PCR, ELISA, and western blot assay. (3) Twelve New Zealand rabbits were selected, of which six were subcutaneously injected with a mixture of natural hydroxyapatite and 2% sodium carboxymethylcellulose gel on the back. The remaining six rabbits were subcutaneously injected with a mixture of SYN2 and 2% sodium carboxymethylcellulose gel on the back. The samples were collected 1 and 3 months after injection and stained with Masson and Sirius red.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscope showed that the crystal grains of natural hydroxyapatite particles were more regular and uniform, with holes evenly distributed between particles. The SYN1 grains were smaller and densely arranged, while the SYN2 grains were irregular. The median particle sizes of natural hydroxyapatite particles, SYN1, and SYN2 were 38, 24, and 40 μm, respectively. Natural hydroxyapatite contained Mg and Zn, SYN1 did not contain Mg and Zn, and SYN2 did not contain Zn. (2) CCK-8 assay showed that 1 and 5 mg/mL of natural hydroxyapatite and SYN2 promoted the proliferation of human skin fibroblasts, while 5 and 10 mg/mL of SYN1 inhibited the proliferation of human skin fibroblasts. The number of cells adhered to the surface of natural hydroxyapatite particles was more than that of SYN1 and SYN2, and the cells on the surface of natural hydroxyapatite particles spread well, with visible filopodia. RT-PCR, ELISA, and western blot assay results showed that the expression of type I collagen in the natural hydroxyapatite particle group was higher than that in the SYN1 group and the SYN2 group. (3) The results of Masson and Sirius red staining showed that the amount of type I collagen in the subcutaneous tissue of the natural hydroxyapatite particle group was greater than that of the SYN2 group 1 and 3 months after injection. (4) The results show that compared with synthetic hydroxyapatite particles, natural hydroxyapatite particles have a richer distribution of trace elements and can better promote fibroblast adhesion, proliferation and collagen regeneration.

Key words: hydroxyapatite, natural extracts, synthetic, cell proliferation, collagen regeneration, injectable filler material, engineered skin material

中图分类号:

石彤彤, 邓荣霞, 张建光. 天然提取与人工合成羟基磷灰石颗粒理化性能及刺激胶原蛋白分泌的差异[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7278-7285.

Shi Tongtong, Deng Rongxia, Zhang Jianguang. Differences in physicochemical properties and collagen secretion stimulation of natural and synthetic hydroxyapatite particles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(34): 7278-7285.

图/表（结果） 12

2.1 各组羟基磷灰石颗粒的物理性能差异图1为不同羟基磷灰石颗粒的X射线衍射图谱，可以看出3种羟基磷灰石颗粒都具有羟基磷灰石的特征衍射峰，表明3种羟基磷灰石颗粒主相均为羟基磷灰石。

图2为动态光散射检测不同羟基磷灰石颗粒的粒径大小，天然羟基磷灰石颗粒、SYN1、SYN2的中位粒径分别为38，24，40 μm。

图3为3种羟基磷灰石颗粒的扫描电镜观察。扫描电镜下可见天然羟基磷灰石颗粒结晶晶粒更规则、均匀，颗粒间均布孔洞；SYN1结晶晶粒较小、排布密集；SYN2结晶晶粒呈不规则状。材料形貌对细胞活动会产生一定影响，细胞与材料表面接触后形成了接触界面，这种相互作用影响着细胞后续的增殖、分化、迁移等行为[20-22]。

电感耦合等离子体检测结果显示，3种羟基磷灰石颗粒中均含有Ca、P，天然羟基磷灰石颗粒中Mg含量为0.48%、Zn含量为0.02%，SYN1中不含有Mg、Zn，SYN2中不含有Zn，见表1。Mg可以通过刺激整合素β1的表达来调节细胞的运动和黏附，Zn对细胞分泌胶原蛋白的能力有调控作用[23]。天然羟基磷灰石颗粒具有更丰富的微量元素，生物活性更高，能够维持生物酶活性，对生物组织的正常生长至关重要[24-25]。

2.2 各组羟基磷灰石颗粒表面的细胞黏附检测结果 CCK-8检测结果显示，培养2 d后，天然羟基磷灰石颗粒表面黏附的细胞数量多于SYN1(P < 0.05)；培养4 d后，天然羟基磷灰石颗粒表面黏附的细胞数量多于SYN1、SYN2 (P < 0.001，P < 0.01)，见图4。

扫描电镜下观察细胞在3种羟基磷灰石颗粒表面的黏附状态，见图5。天然羟基磷灰石颗粒表面的细胞铺展开来，出现丝状伪足；SYN1表面未见细胞铺展，可能由于细胞贴附程度极弱；SYN2表面的细胞铺展开，但丝状伪足较少。推测羟基磷灰石表面表面形貌可能对细胞产生了一定刺激作用。

2.3 各组羟基磷灰石颗粒对人皮肤成纤维细胞增殖的影响不同质量浓度羟基磷灰石颗粒对人皮肤成纤维细胞增殖影响的检测结果，见图6。培养2 d后，与对照组比较，1，5 mg/mL天然羟基磷灰石颗粒、1 mg/mL SYN1促进人皮肤成纤维细胞的增殖，5，10 mg/mL SYN1抑制人皮肤成纤维细胞的增殖。培养4 d后，1，5 mg/mL的天然羟基磷灰石颗粒与SYN2促进人皮肤成纤维细胞的增殖，5，10 mg/mL SYN1抑制人皮肤成纤维细胞的增殖。

5 mg/mL羟基磷灰石颗粒与人皮肤成纤维细胞共培养的显微镜下观察，见图7。天然羟基磷灰石颗粒组细胞数量多于SYN1组、SYN2组。

2.4 各组羟基磷灰石颗粒对人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响人体皮肤中胶原蛋白含量约为70%，主要分为Ⅰ型(85%)、Ⅲ型、Ⅴ型[26]，因此，实验选取Ⅰ型胶原蛋白进行检测。RT-PCR检测结果显示，天然羟基磷灰石颗粒组培养2 d后的Ⅰ型胶原蛋白mNRA表达高于SYN1组、SYN2组(P < 0.001)，天然羟基磷灰石颗粒组培养4 d后的Ⅰ型胶原蛋白mNRA表达高于SYN1组(P < 0.05)，见图8。

2.5 各组羟基磷灰石颗粒对人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响 ELISA检测结果显示，天然羟基磷灰石颗粒组培养4 d后的Ⅰ型胶原蛋白分泌量高于SYN1组、SYN2组(P < 0.001，P < 0.05)，天然羟基磷灰石颗粒组培养7 d后的Ⅰ型胶原蛋白分泌量高于SYN1组(P < 0.001)，见图9A。
为精准确认天然羟基磷灰石颗粒组与SYN2组胶原蛋白分泌量，选择培养7 d后的样品进行Western blot检测。检测结果显示，天然羟基磷灰石颗粒组Ⅰ型胶原蛋白表达高于SYN2组(P < 0.05)，见图9B。

2.6 不同羟基磷灰石颗粒植入兔皮下组织后胶原再生情况
2.6.1 实验动物数量分析 12只新西兰兔全部进入结果分析。
2.6.2 Masson染色及天狼星红染色结果注射后1，3个月两组兔皮下组织的Masson染色及天狼星红染色结果，见图10。

Masson染色与天狼星红染色结果显示，随着注射时间的延长，两组胶原组织生成量增加，并且天然羟基磷灰石颗粒组胶原组织更为致密。

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引言

胶原蛋白是构成皮肤结构的主要物质，可为皮肤提供结构支撑和抗拉强度，然而，随着年龄的增长胶原逐渐流失，皮肤结构支撑及抗拉强度减弱，使皮肤出现皱纹等老化现象[1]。通过软组织注射再生材料的方式不仅可以快速改善面部皱纹，也可以促进胶原蛋白再生，改善皮肤老化。目前临床上常用的再生填充材料主要有胶原、聚乳酸、透明质酸、羟基磷灰石等[2-4]。其中，羟基磷灰石因良好的生物相容性和低免疫性成为面部填充材料的理想选择，在面部填充剂领域得到广泛应用[5]。目前羟基磷灰石注射填充类产品主要有FDA批准的Radiesse®和欧盟批准的HArmonyCA，分别由羟基磷灰石颗粒和凝胶组成。研究表明，羟基磷灰石注射剂可以即时填充皮肤组织并激活成纤维细胞，刺激胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖生成[6-9]，这些刺激作用在临床上表现为皮肤的外观变化，比如皮肤更加紧致、更加明亮、弹性更好、皱纹减少等。使用Radiesse®产品针对面部及手背年轻化的研究都体现了羟基磷灰石面部注射的高满意度，面部细纹和手背皮肤质地均有明显改善[10]。相比其他材料，羟基磷灰石也具有更低的免疫反应[11]，研究在患者面部一侧注射透明质酸，另一侧注射Radiesse®产品，通过比较发现Radiesse®产品可以明显刺激胶原蛋白新生，注射后4，9个月的活检显示Radiesse®产品侧Ⅲ型胶原蛋白含量明显高于对侧，但炎性标记物却低于透明质酸注射侧，说明羟基磷灰石注射后局部炎症反应更加轻微，具有更低的免疫反应。体外将人源巨噬细胞分别与聚左旋乳酸和羟基磷灰石共培养，结果显示：羟基磷灰石和聚左旋乳酸通过不同的免疫途径导致新胶原蛋白的合成，羟基磷灰石可能通过支持成纤维细胞功能和诱导细胞外基质再生的途径，而聚左旋乳酸则通过炎症反应途径[12-13]。研究发现，羟基磷灰石通过直接激活成纤维细胞刺激胶原蛋白分泌，与成纤维细胞接触的颗粒越多，细胞受到的刺激越多，并且相较于其他材料羟基磷灰石的维持时间更长[6，14]。
羟基磷灰石是人体中骨组织、牙齿等的主要成分，目前羟基磷灰石相关产品因良好的生物相容性、低免疫原性等被用于人体组织修复，例如骨修复、耳鼻整形、面部注射填充、口腔科组织修复等[15-17]。羟基磷灰石的制备方法主要有天然提取及人工合成2种，目前市场上应用于面部填充的羟基磷灰石多为人工合成，尚无相关研究对比天然与人工合成羟基磷灰石促胶原蛋白再生方面的差异。此次实验旨在探究天然提取羟基磷灰石颗粒与市售人工合成羟基磷灰石颗粒的理化性能差异及促胶原蛋白再生差异。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，动物实验，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较行LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年8月至2024年6月在深圳市迈捷生命科学有限公司进行。
1.3 材料
1.3.1 材料与试剂猪骨片购自安徽神华肉制品有限公司；市售人工合成羟基磷灰石颗粒SYN1购自四川拜阿蒙生物活性材料有限公司；市售人工合成羟基磷灰石颗粒SYN2购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；人皮肤成纤维细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司；聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清购买自赛默飞世尔科技公司；CCK-8试剂盒、Western及IP细胞裂解液、GAPDH引物、Ⅰ型胶原蛋白引物、PVDF膜、TBSTw(10×)、转印滤纸购自上海碧云天生物技术股份有限公司；Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit购自翌圣生物科技股份有限公司；人Ⅰ型胶原蛋白ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。COLIA1(E8F4L)XP®Rabbit mAb、GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb及Anti-rabbit lgG、HRP-linked Antibody购自美国Cell Signaling Technology公司；转印缓冲液、无蛋白快速封闭液购于武汉赛维尔生物科技有限公司；超特敏ECL化学发光底物购自兰杰柯科技有限公司；羧甲基纤维素购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3.2 主要仪器 X射线衍射仪(日本Rigaku SmartLab SE)；激光粒度分析仪(弗布斯FBS-1076)；扫描电子显微镜(捷克TESCAN MIRA LMS)；酶标仪(Infinite 200)；倒置荧光显微镜(Olympus CKX53)；自动化凝胶成像仪(博鹭腾6000 plus)；电感耦合等离子发射光谱仪(Agilent 720ES)。
1.3.3 实验动物雌性新西兰兔12只，4-6月龄，体质量2.0-3.0 kg，购自深圳市领先医疗服务有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2022-0295。动物实验获得深圳市领先医疗服务有限公司实验动物管理和使用委员会批准，动物实验编号为AMS D2310016R。
1.4 方法
1.4.1 天然羟基磷灰石颗粒的制备将猪骨片经体积分数30%双氧水处理8 h，80 ℃下干燥3 h，蒸煮24 h后晾干，粉碎研磨，用标准筛筛取颗粒，1 100 ℃抛光精烧2 h，冷却至室温即得天然羟基磷灰石颗粒。
1.4.2 羟基磷灰石颗粒的表征使用X射线衍射仪分析天然羟基磷灰石颗粒、SYN1、SYN2的主要成分，测试条件为：0.3 s每步，每步0.02°，测试范围2θ=20°-80°。
分别取100 mg天然羟基磷灰石颗粒、SYN1、SYN2，与纯化水混合加入激光粒度分析仪中，测试粒径分布情况。
取适量天然羟基磷灰石颗粒、SYN1、SYN2样品分别粘于导电胶上，使用镀膜仪以10 mA喷金45 s，置于扫描电子显微镜下观察形貌。采用电感耦合等离子发射光谱仪检测3种样品表面微区元素的种类与含量。
1.4.3 羟基磷灰石颗粒对人皮肤成纤维细胞黏附的影响 48孔板底部用12%聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯溶液处理，待风干后形成一层亲水薄膜，使细胞无法黏附于孔板底部[18]。将人皮肤成纤维细胞接种于48孔板中，每孔加入0.4 mL DMEM高糖培养基，细胞密度为1×104/孔，分3组培养，分别加入5 mg/mL的天然羟基磷灰石颗粒、SYN1、SYN2，每组3复孔。培养2，4 d后取出孔板，用PBS清洗去除未黏附在颗粒表面的细胞，加入10%CCK-8溶液孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm处吸光度值，评估细胞黏附情况。培养4 d后，用PBS清洗颗粒样品，置入2.5%戊二醛溶液中固定24 h，用PBS漂洗后使用1%锇酸固定2 h，用PBS漂洗后梯度浓度乙醇溶液脱水，干燥后喷金，置于扫描电镜下观察并拍照。
1.4.4 羟基磷灰石颗粒对人皮肤成纤维细胞增殖的影响将人皮肤成纤维细胞接种于48孔板中，每孔加入0.4 mL DMEM高糖培养基，细胞密度为1×104/孔，分别加入不同质量浓度(1，5，10 mg/mL)的天然羟基磷灰石颗粒(或SYN1、SYN2)，以单独培养的人皮肤成纤维细胞为对照，每组3复孔。培养2，4 d后取出孔板，用PBS清洗3次，加入10%CCK-8溶液孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm处吸光度值。同时，倒置荧光显微镜下观察与5 mg/mL天然羟基磷灰石颗粒(或SYN1、SYN2)共培养 4 d的细胞状态。
1.4.5 羟基磷灰石颗粒对人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响
实验分组：将人皮肤成纤维细胞接种于48孔板中，每孔加入0.4 mL DMEM高糖培养基，细胞密度为1×104/孔，分3组培养，分别加入5 mg/mL的天然羟基磷灰石颗粒、SYN1、SYN2，每组3复孔。
RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达：培养4，7 d时，提取各组细胞总RNA，参照RT-PCR试剂盒说明书进行反转录、荧光定量PCR实验，反应程序设定为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。反应结束后得到循环阈值(Ct)，以GAPDH为内参，按照公式2-ΔΔCt计算Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达。胶原蛋白及GAPDH引物购自碧云天生物技术股份有限公司。
ELISA与Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白表达：以单独培养的细胞为对照。培养4，7 d后，吸取上清液，参照ELISA试剂盒说明书检测胶原蛋白含量[19]。培养7 d后，吸取上清液，用PBS清洗3次，加入裂解液100 μL于4 ℃裂解10 min，采用BCA蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度定量分析。在沸水中使蛋白变性，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。对凝胶进行湿法转膜，待蛋白完全转移到PVDF膜上后，用无蛋白封闭液处理1 h，然后与Ⅰ型胶原蛋白、GAPDH抗体(稀释比均为1∶1 000)于4 ℃孵育过夜，与Anti-rabbit lgG，HRP-linked Antibody(稀释比1∶5 000)孵育1 h，用超特敏ECL化学发光底物孵育条带，使用自动化凝胶成像仪对条带进行拍照，使用Image J软件进行半定量分析。
1.4.6 羟基磷灰石颗粒体内促Ⅰ型胶原蛋白再生检测使用羧甲基纤维素及纯化水配制2%羧甲基纤维素钠凝胶，将天然羟基磷灰石颗粒与SYN2分别与羧甲基纤维素钠凝胶按照3∶7的质量比混合均匀，制得填充剂。
取12只新西兰兔，背部脱毛消毒，在其中6只兔背部相同位置注射0.2 mL天然羟基磷灰石颗粒填充剂[3]，另外6只兔背部相同位置注射0.2 mL SYN2填充剂[3]。注射1，3个月后，每个时间点随机选取3只兔，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后处死，揭开相应的皮肤组织，取出组织进行固定，制成6-8 μm厚的切片，分别进行Masson及天狼星红染色，使用Image J软件对天狼星红染色图片进行半定量分析。
1.5 主要观察指标各组羟基磷灰石颗粒对人成纤维细胞增殖、黏附及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响，以及各组羟基磷灰石颗粒对动物皮下组织Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 6.02软件进行数据处理和统计学分析，正态分布的数据表示为x±s，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较行LSD-t检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经东华大学生物统计学专家审核。

讨论

羟基磷灰石已被广泛应用于生物医学领域，由于具有长维持时间、生物相容性良好以及价格合理等优势，近年来也被用于面部注射填充[5，27-29]。已有研究证明，羟基磷灰石可以促进人体皮肤中成纤维细胞产生胶原蛋白，改善皮肤状态[30-32]。羟基磷灰石的制备方法主要分为天然提取及人工合成[33]。此次实验探究了天然提取及人工合成羟基磷灰石颗粒的理化性能及刺激胶原分泌能力差异，结果显示天然羟基磷灰石颗粒含有更丰富的微量元素(Mg/Zn)，并且结晶晶粒更加均匀，刺激胶原分泌能力优于人工合成羟基磷灰石。文献报道，材料物理性能的差异可能导致细胞行为的差异，材料对于细胞的影响起源于细胞与材料表面的相互接触，材料的表面结构会对细胞产生不同的机械调控，细胞黏附情况又进一步影响着细胞的增殖及后续细胞行为[34-35]。作者推测羟基磷灰石表面结构会对细胞行为造成一定影响。有研究显示，微量元素影响着细胞的生长代谢，可促进细胞增殖及迁移[36-37]，Mg元素可能会通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路调节细胞的运动及黏附[38]。此次实验结果显示，天然羟基磷灰石颗粒中Mg含量高于SYN2，SYN1组不含有Mg，推测Mg可能会通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路促细胞黏附及增殖。由此推测，天然羟基磷灰石颗粒与SYN1、SYN2理化性能的差异可能会造成生物学功能的差异，由于细胞相容性及刺激胶原分泌的能力对面部填充注射具有重要意义，因此，分别在细胞及动物实验对不同羟基磷灰石的促细胞增殖效果及刺激胶原蛋白分泌能力进行了探究。
此次实验结果显示，相较于合成羟基磷灰石颗粒，天然羟基磷灰石颗粒的促人皮肤成纤维细胞黏附及增殖的效果更好，生物相容性更佳，促进人皮肤成纤维细胞产生了更多Ⅰ型胶原蛋白。同时，兔皮下注射实验发现，天然羟基磷灰石颗粒刺激胶原蛋白分泌的能力更强，皮下注射1个月后天然羟基磷灰石颗粒组胶原新生量约为人工合成羟基磷灰石SYN2组的2倍，推测可能是微量元素Mg、Zn可能影响了细胞行为，促进了细胞黏附与增殖，进而调节细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的能力[23，39-41]，这对软组织生长至关重要[42-43]；也可能是由于材料中的Mg介导了促细胞增殖作用，从而增加了细胞与材料的接触量，提高了细胞Ⅰ型胶原蛋白分泌量[6]。
综上所述，天然提取与人工合成羟基磷灰石颗粒具有理化及生物学行为上的差异，天然提取羟基磷灰石保留了生物组织的微量元素，如Mg、Zn，并且具有更强的促人皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力，植入兔皮下组织后促胶原纤维再生能力更强，这使得天然提取羟基磷灰石在应用于面部注射填充时具有更强的优势。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

天然提取与人工合成羟基磷灰石颗粒理化性能及刺激胶原蛋白分泌的差异

Differences in physicochemical properties and collagen secretion stimulation of natural and synthetic hydroxyapatite particles

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