核因子I-C调控人根尖牙乳头干细胞的分化

doi:10.12307/2025.649

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (31): 6667-6673.doi: 10.12307/2025.649

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

核因子I-C调控人根尖牙乳头干细胞的分化

吴越，朱永娜，葛翔，刘樊，何泽禹，刘茜

蚌埠医科大学口腔医学院，蚌埠医科大学第二附属医院口腔科，安徽省蚌埠市 233000

收稿日期:2024-04-22 接受日期:2024-07-26 出版日期:2025-11-08 发布日期:2025-02-20
通讯作者: 刘茜，副主任医师，硕士生导师，蚌埠医科大学口腔医学院，蚌埠医科大学第二附属医院口腔科，安徽省蚌埠市 233000
作者简介:吴越，女，1999年生，江苏省苏州市人，汉族，蚌埠医科大学在读硕士，主要从事口腔干细胞相关基础研究。
基金资助:
安徽省高校自然科学研究项目(2023AH051997)，项目负责人：朱永娜；蚌埠医科大学自然科学项目(Byycx23074)，项目负责人：吴越

Nuclear factor I-C regulates differentiation of human stem cells from apical papilla

Wu Yue, Zhu Yongna, Ge Xiang, Liu Fan, He Zeyu, Liu Xi

School of Stomatology of Bengbu Medical University, Department of Stomatology, Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233000, Anhui Province, China

Received:2024-04-22 Accepted:2024-07-26 Online:2025-11-08 Published:2025-02-20
Contact: Liu Xi, Associate chief physician, Master’s supervisor, School of Stomatology of Bengbu Medical University, Department of Stomatology, Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233000, Anhui Province, China
About author:Wu Yue, Master candidate, School of Stomatology of Bengbu Medical University, Department of Stomatology, Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233000, Anhui Province, China
Supported by:
Natural Science Research Program for Universities in Anhui Province, No. 2023AH051997 (to ZYN); Natural Science Program of Bengbu Medical University, No. Byycx23074 (to WY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

核因子I-C：属核因子家族，是在成牙本质细胞分化及牙根发育过程中发挥关键作用的核转录因子，也是调控成骨细胞分化的重要转录因子之一。核因子I-C还可与多种调控细胞成骨/成牙分化至关重要的信号分子相互作用，如Wnt/β-Catenin信号通路。
人根尖牙乳头干细胞：来源于年轻恒牙的根尖周组织，大多取材自根尖尚未发育完全的第三磨牙，是一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，其增殖、分化能力明显高于其他牙源性干细胞。

摘要
背景：体外过表达核因子I-C基因可促进人根尖牙乳头干细胞的分化，Wnt/β-catenin信号通路的激活也可促进人根尖牙乳头干细胞的分化，而且核因子I-C对间充质干细胞中Wnt/β-catenin通路具有调节作用。然而，核因子I-C能否通过激活人根尖牙乳头干细胞中Wnt/β-catenin通路进而影响细胞分化，目前尚未见报道。
目的：探讨核因子I-C通过Wnt/β-Catenin信号通路调控人根尖牙乳头干细胞分化的作用。
方法：玻片覆盖组织块法培养人根尖牙乳头干细胞，慢病毒转染过表达核因子I-C基因。①设置对照组、空载体组和过表达核因子I-C组，Western blot检测β-Catenin、LRP5和TCF7L2的表达。②设置对照组、空载体组、过表达核因子I-C组和过表达核因子I-C+DKK-1(Wnt通路抑制剂)组，细胞成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色及活性定量，细胞成骨诱导14 d后qPCR和Western blot检测 Runt相关转录因子2、牙本质涎磷蛋白、骨钙素mRNA及蛋白的表达，茜素红染色观察矿化结节形成情况。
结果与结论：①与对照组、空载体组相比，过表达核因子I-C组人根尖牙乳头干细胞中Wnt/β-Catenin通路相关蛋白β-Catenin、LRP5、TCF7L2表达显著升高(P < 0.01)；②与对照组、空载体组相比，过表达核因子I-C组人根尖牙乳头干细胞中碱性磷酸酶活性显著升高(P < 0.01)，Runt相关转录因子2、牙本质涎磷蛋白、骨钙素mRNA及蛋白表达均显著升高(P < 0.01)，矿化结节数量显著增加(P < 0.01)；③与过表达核因子I-C组相比，过表达核因子I-C+DKK-1组人根尖牙乳头干细胞中碱性磷酸酶活性、Runt相关转录因子2、牙本质涎磷蛋白、骨钙素mRNA及蛋白表达显著下降(P < 0.05)，矿化结节数量显著减少(P < 0.05)。结果表明：核因子I-C能够激活人根尖牙乳头干细胞中Wnt/β-catenin信号通路，介导人根尖牙乳头干细胞的成骨/成牙分化。

https://orcid.org/0009-0002-9883-9201(吴越)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: human stem cells from apical papilla, nuclear factor I-C, Wnt, signaling pathway, differentiation, osteogenesis, DKK-1, engineered stem cells

Abstract: BACKGROUND: Overexpression of the nuclear factor I-C gene in vitro promotes the differentiation of human stem cells from apical papilla, as does the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Moreover, nuclear factor I-C regulates the Wnt/β-catenin pathway in mesenchymal stem cells. However, whether nuclear factor I-C can affect cell differentiation by activating the Wnt/β-catenin pathway in human stem cells from apical papilla has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the role of nuclear factor I-C in the Wnt/β-catenin signaling pathway in regulating the differentiation of human stem cells from apical papilla.
METHODS: Human stem cells from apical papilla were cultured by the slide-covered tissue block method and lentiviral transfection overexpressing the nuclear factor I-C gene. (1) A control group, an empty viral vector group, and an overexpressed nuclear factor I-C gene group were set up. The expression of β-Catenin, LRP5, and TCF7L2 was detected by Western blotting. (2) The control group, empty viral vector group, overexpressed nuclear factor I-C gene group, and overexpressed nuclear factor I-C gene+DKK-1 (Wnt pathway inhibitor) group were set up. Alkaline phosphatase staining and activity quantification were performed after 7 days of osteogenic induction. qPCR and Western blotting were performed to detect the expression of Runt-related transcription factor 2, dentin salivary phosphoprotein, osteocalcin mRNA, and protein after 14 days of osteogenic induction. Alizarin Red staining was used to observe the formation of mineralized nodules.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control and empty viral vector groups, the expression of Wnt/β-Catenin pathway-related proteins β-Catenin, LRP5, and TCF7L2 in human apical dentin papilla stem cells was significantly increased in the overexpressed nuclear factor I-C gene group (P < 0.01). (2) Compared with the control and empty viral vector groups, the expression of alkaline phosphatase and osteocalcin in human apical dentin papilla stem cells was significantly increased (P < 0.01); the expression levels of Runt-related transcription factor 2, dentin salivary phosphoprotein, osteocalcin mRNA and protein were significantly higher (P < 0.01), and the number of mineralized nodules was significantly increased (P < 0.01) in the overexpressed nuclear factor I-C gene group. (3) Compared with the overexpressed nuclear factor I-C gene group, the alkaline phosphatase activity and the expression of Runt-related transcription factor 2, dentin salivary phosphoprotein, osteocalcin mRNA and protein expression levels were significantly down-regulated (P < 0.05), and the number of mineralized nodules was significantly reduced (P < 0.05) in human stem cells from apical papilla of the overexpressed nuclear factor I-C gene+DKK-1 group. The results show that nuclear factor I-C can activate the Wnt/β-catenin signaling pathway in human stem cells from apical papilla and mediate the osteogenic/odontogenic differentiation of human stem cells from apical papilla.

Key words: 人根尖牙乳头干细胞, 核因子I-C, Wnt, 信号通路, 分化, 成骨, DKK-1, 工程化干细胞

中图分类号:

吴越, 朱永娜, 葛翔, 刘樊, 何泽禹, 刘茜. 核因子I-C调控人根尖牙乳头干细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6667-6673.

Wu Yue, Zhu Yongna, Ge Xiang, Liu Fan, He Zeyu, Liu Xi. Nuclear factor I-C regulates differentiation of human stem cells from apical papilla[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(31): 6667-6673.

图/表（结果） 2

2.1 人根尖牙乳头干细胞的形态 组织取材自新鲜拔除的牙根尚未发育完全的恒牙(图1A)，玻片覆盖组织块法培养原代根尖牙乳头干细胞，培养五六天后发现组织块周围有不规则多角形细胞爬出(图1B)，培养9-10 d后组织块周围大量细胞聚集(图1C)，细胞呈长梭形，以组织块为中心放射状生长。细胞融合度在70%-80%时，胰酶消化传代，扩大培养(图1D)。
2.2 人根尖牙乳头干细胞表面特异抗原鉴定 通过流式细胞仪对人根尖牙乳头干细胞表面抗原进行检测，结果显示细胞高表达间充质干细胞表面特异性抗原，CD44、CD90、CD105表达阳性率均> 90%，低表达造血干细胞表面抗原，CD45表达阳性率< 5%(图2)。
2.3 人根尖牙乳头干细胞多向分化潜能鉴定 人根尖牙乳头干细胞成骨诱导3周后，镜下可见细胞间紧密相连成片。茜素红染色显示，细胞之间出现了暗红色的矿化结节(图3A)。人根尖牙乳头干细胞成脂诱导3周后，油红O染色显示，在细胞质中可以看到暗红色的脂滴形成(图3B)，上述结果表明该细胞具有成骨、成脂分化能力。
2.4 建立过表达核因子I-C基因的人根尖牙乳头干细胞系 转染72 h后，Western blot检测结果显示，过表达核因子I-C组的核因子I-C蛋白表达量显著高于其他两组(图4)，差异有显著性意义(P < 0.01)，对照组与空载体组的核因子I-C蛋白表达量无统计学差异，说明过表达核因子I-C慢病毒对人根尖牙乳头干细胞感染有效，而感染空病毒载体并不会影响细胞核因子I-C基因的表达。
2.5 β-Catenin、LRP5、TCF7L2蛋白表达水平 过表达核因子I-C组Wnt/β-catenin信号通路相关β-catenin、LRP5、TCF7L2蛋白表达水平显著高于对照组(P < 0.01)，对照组与空载体组的β-catenin、LRP5、TCF7L2蛋白表达水平无统计学差异(图5)。上述结果表明，核因子I-C可以促进人根尖牙乳头干细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活，空病毒载体对通路的激活无实质性影响。
2.6 NFIC/Wnt/β-Catenin信号对人根尖牙乳头干细胞分化的影响
2.6.1 NFIC/Wnt/β-Catenin信号对人根尖牙乳头干细胞早期矿化能力的影响 各组人根尖牙乳头干细胞成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色，可见过表达核因子I-C组较空白对照组、空载体组、过表达核因子I-C+DKK-1组染色深(图6A)。过表达核因子I-C组碱性磷酸酶活性高于其他3组(P < 0.01)(图6B)。

2.6.2 NFIC/Wnt/β-Catenin 信号对人根尖牙乳头干细胞成骨/成牙基因表达的影响 各组人根尖牙乳头干细胞成骨诱导14 d后，Western blot和qPCR检测结果显示：与空白对照组相比，过表达核因子I-C组Runt相关转录因子2、骨钙素、牙本质涎磷蛋白的蛋白和mRNA水平显著升高(P < 0.01，图7)；过表达核因子I-C同时使用Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂DKK-1的情况下，Runt相关转录因子2、骨钙素、牙本质涎磷蛋白的蛋白和mRNA水平较过表达核因子I-C组显著下调(P < 0.05，图7)；空白对照组与空载体组Runt相关转录因子2、骨钙素、牙本质涎磷蛋白的蛋白和mRNA水平无统计学差异(图7)。上述结果表明，核因子I-C可通过激活人根尖牙乳头干细胞中Wnt/β-catenin信号通路，上调细胞成骨/成牙基因的表达，而空病毒载体对人根尖牙乳头干细胞的成骨/成牙基因表达无影响。
2.6.3 NFIC/Wnt/β-Catenin 信号对人根尖牙乳头干细胞矿化结节形成的影响 各组人根尖牙乳头干细胞成骨诱导14 d，茜素红染色显示均有矿化结节形成(图8)。过表达核因子I-C组形成的矿化结节数目最多，而过表达核因子I-C+DKK-1组的矿化结节数量较过表达核因子I-C组显著减少。上述结果说明，NFIC/Wnt/β-Catenin 信号对人根尖牙乳头干细胞的矿化能力有促进作用。

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引言

牙体、牙周疾病和创伤是口腔常见病，传统的治疗方法通常能缓解患者的症状，但无法避免牙髓失活、冠根比失调、牙槽骨破坏等问题，最终可能造成牙齿的过早缺失。口腔组织工程为改善牙齿疾病预后提供了可观的前景[1-3]，任何成功的组织工程都需要3个要素：生物兼容的支架材料、有效的生物学因素和具有分化为预期组织类型潜力的祖细胞。
人根尖牙乳头干细胞(human stem cells from apical papilla，hSCAPs)是从尚未发育完全的恒牙根尖端软组织中分离培养的间充质干细胞，可分化为成牙本质细胞和牙髓细胞，其优越性体现在取材便捷、具有多向分化潜能、较低的免疫原性等方面[4-5]。与牙周膜干细胞、牙髓干细胞等其他牙源性干细胞相比，根尖牙乳头干细胞具有更强的组织再生及增殖能力[6-7]，这些特性使其成为具有潜力的牙组织工程种子细胞之一。人根尖牙乳头干细胞的生物学性能受诸多因素影响，如多种信号通路及生长因子等[8]。
经典的Wnt信号通路，即Wnt/β-catenin通路可调控成牙本质细胞、牙源性间充质细胞的增殖、分化和极化，从而影响牙齿的数目、形状、位置和组织形成[9-11]。有学者研究发现，体外激活Wnt/β-catenin信号，可促进人根尖牙乳头干细胞的增殖及分化[12-13]。
核因子I-C能够通过激活或抑制特定基因的转录活性调节多种相关基因的表达，在牙齿发育以及骨骼形成过程中扮演重要角色[14]。研究表明，体外过表达核因子I-C可促进人根尖牙乳头干细胞增殖、成牙/骨向分化，并上调牙源性相关分子的表达，而沉默核因子I-C后，人根尖牙乳头干细胞的增殖、矿化、牙源性相关分子的表达均受到抑制[15]。ZHOU等[16]发现在骨髓间充质干细胞中过表达核因子I-C基因，可激活Wnt/β-Catenin通路，平衡细胞的成骨、成脂分化。
此研究旨在探索核因子I-C通过Wnt/β-Catenin 信号通路对根尖牙乳头干细胞分化的调控，有利于进一步明确牙根发育的分子机制，为根尖牙乳头干细胞应用于牙组织工程提供一定的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年8月至2024年4月在蚌埠医科大学癌症转化医学安徽省重点实验室完成。
1.3 材料 α-MEM培养基(美国Gibco公司)；胰酶消化液(上海碧云天公司)；油红O(美国Sigma公司)；茜素红(武汉塞维尔生物公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；过表达核因子I-C慢病毒
(OV-NFIC)、空载体病毒(LV-empty)(安徽华晓基因公司)；BCA蛋白定量试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒(美国Thermo公司)；Trizol[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；RIPA组织细胞快速裂解液、10%SDS、TEMED、PBS、吐温-20(北京索莱宝公司)；牙本质涎磷蛋白抗体(美国GeneTex公司)；骨钙素抗体(美国CST公司)；Runt相关转录因子2、β-actin抗体(上海艾博抗贸易有限公司)；经典Wnt通路抑制剂DKK-1(苏州近岸蛋白科技股份有限公司)。正置显微镜(日本OLYMPUS公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；Real-time检测仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；CO2培养箱(美国Thermo公司)；低温冷冻离心机(上海卢湘离心机仪器有限公司)；电泳仪(美国BIO-RAD公司)；电转仪(美国HOEFER公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 人根尖牙乳头干细胞的分离培养 收集蚌埠医科大学第二附属医院口腔颌面外科门诊患者因阻生或正畸需要拔除的牙根发育不超过根长2/3 的健康第三磨牙，患牙无龋坏、无牙周炎等，患者及监护人已知情同意。该研究的实施符合蚌埠医科大学第二附属医院的相关伦理要求，伦理批号：伦科批字[2024]第336号。
在无菌条件下，将收集的牙齿倒置，使用含2%双抗(青霉素+链霉素)的PBS充分冲洗后，用镊子辅助刀片剥离位于根尖部的牙乳头组织，采用玻片覆盖组织块法培养原代细胞[17]，操作方法：用眼科剪将组织剪成1 mm3左右的组织块，将四角带有凡士林的盖玻片盖于组织块上，放入6 cm培养皿，加入含体积分数20%胎牛血清的α-MEM培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱内，每3 d换液1次。待细胞融合度在70%-80%时，用0.25%胰蛋白酶1∶3消化传代，取第3-5代细胞用于实验。
1.4.2 人根尖牙乳头干细胞鉴定 ①免疫表型检测：取生长状态良好的第3-5代人根尖牙乳头干细胞，用PBS重悬，调整细胞浓度为1×109 L-1，每一EP管中加入100 μL细胞悬液，分别加入鼠抗人CD44、CD45、CD90、CD105抗体，同时设立阴性对照组，4 ℃避光孵育1 h，离心，弃上清，200 μL PBS重悬，上流式细胞仪检测。实验单独重复3次。②成骨、成脂分化能力鉴定：取生长状态良好的第3-5代人根尖牙乳头干细胞，以2.5×105个/孔密度接种于6孔培养板中进行培养，待其融合度达80%左右，更换相应诱导液培养，间隔3 d换液1次，成骨、成脂诱导3周后进行茜素红染色、油红O染色，观察矿化结节、脂滴形成情况。成骨诱导液由1%双抗+体积分数10%胎牛血清+50 μg/mL抗坏血酸+0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L甘油酸钠+α-MEM培养基配制而成，成脂诱导液由1%双抗+体积分数10%胎牛血清+0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+200 μmol/L吲哚美辛+10 μg/mL胰岛素+1 μmol/L地塞米松+α-MEM培养基配制而成。
1.4.3 转染过表达核因子I-C慢病毒载体 取第3-5代生长状态良好的人根尖牙乳头干细胞以1×106个密度接种于10 cm2培养皿，在培养箱中放置过夜，保证细胞融合率在30%-50%的情况下，采用1/2小体积感染法，弃去原培养基，过表达核因子I-C组加入含过表达核因子I-C慢病毒载体的1/2体积新鲜培养基，而空载体组加入含空病毒载体的1/2体积新鲜培养基，4 h后分别补足至全培养体积培养基，24 h后换液，用α-MEM完全培养基继续培养。感染72 h后，采用Western blot检测核因子I-C 蛋白表达，实验单独重复3次。
1.4.4 Western blot检测信号通路相关分子β-Catenin、LRP5、TCF7L2的表达 取生长状态良好的第3-5代人根尖牙乳头干细胞、过表达核因子I-C慢病毒载体的人根尖牙乳头干细胞、转染空病毒载体的人根尖牙乳头干细胞，以 2.5×105个/孔密度接种于6孔板，待细胞融合度在70%时，用无血清培养基饥饿24 h，弃去培养基，冰冷PBS润洗3遍，加入RIPA组织细胞快速裂解液。收集裂解后细胞至EP管中，离心，取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据蛋白定量结果加入适量上样缓冲液，蛋白变性后电泳，转膜，25 V转膜30 min，PVDF膜甲醇活化后TBST清洗，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入一抗(1∶1 000稀释的β-catenin、LRP5、TCF7L2一抗，1∶1 500稀释的β-actin)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入按照1∶1 000稀释的HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜，配置ECL发光检测液，在暗室内用化学发光成像仪曝光，扫描并分析结果。实验单独重复3次。
1.4.5 实验分组和矿化诱导 实验分为4组：人根尖牙乳头干细胞均以2.5×105个/孔的密度接种于6孔板。空白对照组：人根尖牙乳头干细胞加入成骨诱导液培养；空载体组：转染空病毒载体的人根尖牙乳头干细胞加入成骨诱导液培养；过表达核因子I-C组：转染过表达核因子I-C慢病毒载体的人根尖牙乳头干细胞加入成骨诱导液培养；过表达核因子I-C+DKK-1组：转染过表达核因子I-C慢病毒人根尖牙乳头干细胞加入含0.15 μg/mL DKK-1的成骨诱导液培养[18]。
1.4.6 碱性磷酸酶染色及活性定量 各组细胞成骨诱导7 d，除去原培养基，PBS润洗2次，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，再用BCIP/NBT染色30 min后抽干染液，PBS洗涤2次，镜下观察并拍照。采用碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。实验单独重复3次。

1.4.7 实时荧光定量PCR 检测Runt相关转录因子2、骨钙素、牙本质涎磷蛋白mRNA表达 各组细胞成骨诱导14 d，将细胞置于含700 μL Trizol的匀浆管中，在冰上裂解提取RNA。微量核酸定量仪检测RNA浓度及A260/A280比值，符合要求后进行cDNA合成，然后上机扩增，GAPDH为内参。反应程序：95 ℃，10 min(95 ℃，15 s；55 ℃，45 s)×40个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s；60 ℃，15 s。引物序列见表1，最后采用2-ΔΔCt法计算Runt相关转录因子2、骨钙素、牙本质涎磷蛋白mRNA相对表达水平。实验单独重复3次。

1.4.8 Western blot检测Runt相关转录因子2、骨钙素、牙本质涎磷蛋白表达 各组细胞成骨诱导14 d，使用裂解液提取蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据蛋白定量结果加入适量上样缓冲液，蛋白变性后电泳，转膜，25 V转膜30 min，PVDF膜甲醇活化后TBST清洗，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入一抗(1∶1 000稀释的Runt相关转录因子2、骨钙素，1∶500稀释的牙本质涎磷蛋白和1∶1 500稀释的β-actin)在4 ℃冰箱中孵育过夜，TBST洗膜3次，加入1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，化学发光法成像，扫描并分析结果。实验单独重复3次。
1.4.9 茜素红染色及定量分析 各组细胞成骨诱导14 d，弃去原培养基，PBS润洗3次，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，蒸馏水洗涤1次，加入适量茜素红染液，37 ℃烘箱孵育30 min，蒸馏水充分洗涤，显微镜下观察矿化结节形成情况并拍照记录。定量分析：将10%氯化烷基十六吡啶溶解染料加入各孔，然后取100 μL溶解液至96孔板，在562 nm处测吸光度值，定量各组形成矿化结节的数量。实验单独重复3次。
1.5 主要观察指标 ①人根尖牙乳头干细胞中CD44、CD45、CD90、CD105的表达；②人根尖牙乳头干细胞成骨、成脂诱导后矿化结节、脂滴形成情况；③过表达核因子I-C人根尖牙乳头干细胞中核因子I-C蛋白表达；④过表达核因子I-C人根尖牙乳头干细胞中β-Catenin、LRP5和TCF7L2蛋白表达；⑤加入经典Wnt通路抑制剂DKK-1后，过表达核因子I-C人根尖牙乳头干细胞成骨诱导后的碱性磷酸酶活性、矿化基因表达水平、矿化结节形成情况。
1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 9.5.1 对数据作图并进行统计分析，多样本资料比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经过刘茜专家审核。

讨论

人根尖牙乳头干细胞是来自于牙根未发育完全的恒牙根尖的多能干细胞，众多研究表明，人根尖牙乳头干细胞具有成牙本质、成骨、成软骨、成脂和成神经源性组织分化的潜力[4]。随人类牙槽骨的退化，拔除阻生的第三磨牙为口腔组织工程提供了丰富的根尖牙乳头干细胞来源。DING等[19]研究证实冷冻保存不会影响人根尖牙乳头干细胞的生物学和免疫学特性，因此，人根尖牙乳头干细胞可通过冷冻储存，保持其在未来临床应用中的再生潜力。
Wnt/β-catenin信号通路是一个关键的调控网络，它在胚胎发育过程中扮演着至关重要的角色，在成体尤其是哺乳动物体内，该通路对于维持组织稳态、抵抗疾病以及促进再生具有不可忽视的作用[20]。大量研究表明，Wnt/β-catenin在骨骼的发育和细胞的成骨分化过程中发挥着重要的作用。LRP5作为Wnt蛋白的共受体参与经典的Wnt信号传导通路，Wnt蛋白与细胞表面特异性受体FZD和LRP5/6结合并相互作用，继而促进β-catenin的积累和核转位。TCF7L2是TCF/LEF家族的重要成员，也是Wnt/β-catenin通路激活过程中细胞核段的重要转录因子[21-22]。β-catenin的细胞质-核穿梭是Wnt/β-catenin通路被激活的重要特征[23-24]。核因子I-C在骨髓间充质干细胞中促进β-catenin从细胞质向细胞核的转位，增加β-catenin和TCF7L2的核蛋白水平，并且核因子I-C显著诱导了LRP5的表达，但对LRP6、Strp1、Wif1和Sclerostin的表达影响轻微或没有影响，表明核因子I-C是通过诱导LRP5的表达从而激活Wnt/β-catenin通路[16]。实验结果显示，过表达核因子I-C基因的人根尖牙乳头干细胞中LRP5、TCF7L2和β-catenin蛋白表达较对照组均显著上调，因此，作者推测核因子I-C可能通过上调人根尖牙乳头干细胞的胞外受体、β-catenin及下游相关分子，进而活化Wnt/β-catenin通路。
核因子I家族最初是作为体外复制腺病毒 DNA 所需的蛋白家族被发现的，核因子I可调控的基因类别包括普遍表达的基因以及激素、营养和发育调节的基因，脊椎动物中有4个核因子I基因家族成员(核因子I-A、B、C、X)[25]，核因子I-C在牙齿发育过程中调节上皮-间充质的相互转化，是形成牙本质、牙釉质和牙骨质所必须的转录因子[26]。研究发现，敲除小鼠核因子I-C基因后，会影响成牙细胞的分化，造成短根异常和牙骨质形成减少[27]。LEE等[14]研究显示核因子I-C可通过调节小鼠牙上皮细胞、人牙周膜干细胞和人骨髓干细胞中的Sox2表达，参与细胞增殖、干细胞生态位维持和细胞命运决定。
人根尖牙乳头干细胞具有强大的成骨/成牙分化潜力，在一定的诱导条件下可分化为成骨细胞样细胞。碱性磷酸酶活性是干细胞早期分化的重要标志物，该实验人根尖牙乳头干细胞成骨诱导7 d后，碱性磷酸酶染色显示过表达核因子I-C的细胞内形成较多酶粒，碱性磷酸酶活性显著上调，而加入DKK-1组形成的酶粒较过表达核因子I-C组显著减少，碱性磷酸酶活性也显著下调。成骨诱导14 d后，过表达核因子I-C组的矿化基因表达水平最高，矿化结节形成数目最多，加入DKK-1后，人根尖牙乳头干细胞的矿化能力显著下降。DKK-1是经典Wnt通路的抑制剂，它可通过竞争性结合细胞表面的LRP5/6(LRP5/6对DKK-1的亲和力大于Wnt配体)，从而抑制Wnt信号的传导[28]，进而影响成骨细胞分化。有研究表明，在氧化型胆固醇诱导下的骨髓基质细胞使用DKK-1预处理后，阻断了Wnt/β-catenin信号，细胞的碱性磷酸酶活性受到部分但显著性的抑制[29]。此次研究采用的DKK-1质量浓度是0.15 μg/mL，参考了关孟莹等[18]的研究，当DKK-1质量浓度为0.15 μg/mL时，能显著降低人牙周干细胞中β-catenin蛋白的表达水平，根尖牙乳头干细胞与牙周膜干细胞的生物学特性有许多相似之处，因此选用该浓度进行实验。此研究发现，在过表达核因子I-C基因的人根尖牙乳头干细胞中使用DKK-1处理，使Wnt信号通路受到了抑制，导致成骨/成牙基因表达显著下调以及矿化结节显著减少。
综上所述，该研究证实了人根尖牙乳头干细胞具有成牙/成骨、成脂的多向分化潜能。核因子I-C可激活人根尖牙乳头干细胞中Wnt/β-catenin信号通路，并经由该通路促进人根尖牙乳头干细胞的成骨/成牙分化。但核因子I-C是否还与其他信号分子相互作用进而影响人根尖牙乳头干细胞的增殖和分化、人根尖牙乳头干细胞分化方向的调控机制、体内外生态位差异以及个体差异对细胞的影响等问题仍需进一步研究。希望人根尖牙乳头干细胞作为具有分化为预期组织潜力的干细胞、核因子I-C/Wnt/β-catenin通路作为有效生物学因素的组合，能为牙组织工程的应用提供一些理论依据。
人根尖牙乳头干细胞是来自于牙根未发育完全的恒牙根尖的多能干细胞，众多研究表明，人根尖牙乳头干细胞具有成牙本质、成骨、成软骨、成脂和成神经源性组织分化的潜力[4]。随人类牙槽骨的退化，拔除阻生的第三磨牙为口腔组织工程提供了丰富的根尖牙乳头干细胞来源。DING等[19]研究证实冷冻保存不会影响人根尖牙乳头干细胞的生物学和免疫学特性，因此，人根尖牙乳头干细胞可通过冷冻储存，保持其在未来临床应用中的再生潜力。
Wnt/β-catenin信号通路是一个关键的调控网络，它在胚胎发育过程中扮演着至关重要的角色，在成体尤其是哺乳动物体内，该通路对于维持组织稳态、抵抗疾病以及促进再生具有不可忽视的作用[20]。大量研究表明，Wnt/β-catenin在骨骼的发育和细胞的成骨分化过程中发挥着重要的作用。LRP5作为Wnt蛋白的共受体参与经典的Wnt信号传导通路，Wnt蛋白与细胞表面特异性受体FZD和LRP5/6结合并相互作用，继而促进β-catenin的积累和核转位。TCF7L2是TCF/LEF家族的重要成员，也是Wnt/β-catenin通路激活过程中细胞核段的重要转录因子[21-22]。β-catenin的细胞质-核穿梭是Wnt/β-catenin通路被激活的重要特征[23-24]。核因子I-C在骨髓间充质干细胞中促进β-catenin从细胞质向细胞核的转位，增加β-catenin和TCF7L2的核蛋白水平，并且核因子I-C显著诱导了LRP5的表达，但对LRP6、Strp1、Wif1和Sclerostin的表达影响轻微或没有影响，表明核因子I-C是通过诱导LRP5的表达从而激活Wnt/β-catenin通路[16]。实验结果显示，过表达核因子I-C基因的人根尖牙乳头干细胞中LRP5、TCF7L2和β-catenin蛋白表达较对照组均显著上调，因此，作者推测核因子I-C可能通过上调人根尖牙乳头干细胞的胞外受体、β-catenin及下游相关分子，进而活化Wnt/β-catenin通路。
核因子I家族最初是作为体外复制腺病毒 DNA 所需的蛋白家族被发现的，核因子I可调控的基因类别包括普遍表达的基因以及激素、营养和发育调节的基因，脊椎动物中有4个核因子I基因家族成员(核因子I-A、B、C、X)[25]，核因子I-C在牙齿发育过程中调节上皮-间充质的相互转化，是形成牙本质、牙釉质和牙骨质所必须的转录因子[26]。研究发现，敲除小鼠核因子I-C基因后，会影响成牙细胞的分化，造成短根异常和牙骨质形成减少[27]。LEE等[14]研究显示核因子I-C可通过调节小鼠牙上皮细胞、人牙周膜干细胞和人骨髓干细胞中的Sox2表达，参与细胞增殖、干细胞生态位维持和细胞命运决定。
人根尖牙乳头干细胞具有强大的成骨/成牙分化潜力，在一定的诱导条件下可分化为成骨细胞样细胞。碱性磷酸酶活性是干细胞早期分化的重要标志物，该实验人根尖牙乳头干细胞成骨诱导7 d后，碱性磷酸酶染色显示过表达核因子I-C的细胞内形成较多酶粒，碱性磷酸酶活性显著上调，而加入DKK-1组形成的酶粒较过表达核因子I-C组显著减少，碱性磷酸酶活性也显著下调。成骨诱导14 d后，过表达核因子I-C组的矿化基因表达水平最高，矿化结节形成数目最多，加入DKK-1后，人根尖牙乳头干细胞的矿化能力显著下降。DKK-1是经典Wnt通路的抑制剂，它可通过竞争性结合细胞表面的LRP5/6(LRP5/6对DKK-1的亲和力大于Wnt配体)，从而抑制Wnt信号的传导[28]，进而影响成骨细胞分化。有研究表明，在氧化型胆固醇诱导下的骨髓基质细胞使用DKK-1预处理后，阻断了Wnt/β-catenin信号，细胞的碱性磷酸酶活性受到部分但显著性的抑制[29]。此次研究采用的DKK-1质量浓度是0.15 μg/mL，参考了关孟莹等[18]的研究，当DKK-1质量浓度为0.15 μg/mL时，能显著降低人牙周干细胞中β-catenin蛋白的表达水平，根尖牙乳头干细胞与牙周膜干细胞的生物学特性有许多相似之处，因此选用该浓度进行实验。此研究发现，在过表达核因子I-C基因的人根尖牙乳头干细胞中使用DKK-1处理，使Wnt信号通路受到了抑制，导致成骨/成牙基因表达显著下调以及矿化结节显著减少。
综上所述，该研究证实了人根尖牙乳头干细胞具有成牙/成骨、成脂的多向分化潜能。核因子I-C可激活人根尖牙乳头干细胞中Wnt/β-catenin信号通路，并经由该通路促进人根尖牙乳头干细胞的成骨/成牙分化。但核因子I-C是否还与其他信号分子相互作用进而影响人根尖牙乳头干细胞的增殖和分化、人根尖牙乳头干细胞分化方向的调控机制、体内外生态位差异以及个体差异对细胞的影响等问题仍需进一步研究。希望人根尖牙乳头干细胞作为具有分化为预期组织潜力的干细胞、核因子I-C/Wnt/β-catenin通路作为有效生物学因素的组合，能为牙组织工程的应用提供一些理论依据。

核因子I-C调控人根尖牙乳头干细胞的分化

Nuclear factor I-C regulates differentiation of human stem cells from apical papilla

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