长链非编码RNA KIAA0125对急性髓系白血病U937细胞增殖和凋亡的影响

doi:10.12307/2025.510

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 3983-3991.doi: 10.12307/2025.510

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

长链非编码RNA KIAA0125对急性髓系白血病U937细胞增殖和凋亡的影响

胡华丽1，2，邓发滑1，2，刘远程2，王斯奇2，张静馨2，禄婷婷1，2，黄海1，2，韦四喜1，2

1贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学医学检验学院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2024-04-11 接受日期:2024-06-09 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-12
通讯作者: 韦四喜，博士，博士生导师，主任技师，贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学医学检验学院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:胡华丽，女，1999年生，贵州省黔西南州人，贵州医科大学临床检验诊断学在读硕士，主要从事血液肿瘤相关基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81960031，82260033，81660027)，项目负责人：韦四喜；贵州省科技厅资助项目(20185779-70)，项目负责人：韦四喜；贵州医科大学附属医院博士研究启动基金(gyfybsky-2021-29)，项目负责人：禄婷婷；贵州医科大学附属医院国家自然科学基金区域基金培育项目(gyfynsfc-2021-48)，项目负责人：禄婷婷

Effects of long non-coding RNA KIAA0125 on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia U937 cells

Hu Huali1, 2, Deng Fahua1, 2, Liu Yuancheng2, Wang Siqi2, Zhang Jingxin2, Lu Tingting1, 2, Huang Hai1, 2, Wei Sixi1, 2

1Clinical Laboratory Center of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2024-04-11 Accepted:2024-06-09 Online:2025-07-08 Published:2024-09-12
Contact: Wei Sixi, MD, Doctoral supervisor, Chief technician, Clinical Laboratory Center of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Hu Huali, Master candidate, Clinical Laboratory Center of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960031, 82260033, 81660027 (to WSX); a grant from Guizhou Provincial Department of Science and Technology, No. 20185779-70 (to WSX); Doctoral Research Initiation Fund of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, No. gyfybsky-2021-29 (to LTT); National Natural Science Foundation Regional Fund Cultivation Project of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, No. gyfynsfc-2021-48 (to LTT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

急性髓系白血病：是一种以造血干/祖细胞异常克隆扩增和分化停滞为特征的血液恶性肿瘤，主要表现为外周血及骨髓中原始或幼稚髓性细胞异常增生。
长链非编码RNA：是由RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ转录生成的一组长度超过200 nt但不编码蛋白质或编码蛋白质能力极低的RNA分子。
U937细胞：是由NilssonK实验室于1974年从一名37岁患有恶性组织细胞性淋巴瘤的白人男性胸水中分离出来的。该细胞在人混合淋巴细胞培养物上清、佛波酯、维生素D3、γ-干扰素、肿瘤坏死因子和维A酸的诱导下可以向终末单核细胞分化。

摘要
背景：U937细胞可以作为急性髓系白血病细胞模型，用于研究急性髓系白血病的生物学特性、信号通路和治疗靶点。目前虽然已有研究报道长链非编码RNA KIAA0125在急性髓系白血病中呈高表达，但其在U937细胞中的生物学功能尚不清楚，在急性髓系白血病发生发展中的作用机制有待进一步阐明。
目的：探讨长链非编码RNA KIAA0125在急性髓系白血病患者外周血中的表达水平及对U937细胞增殖、凋亡的影响。
方法：RNA-seq分析急性髓系白血病患者骨髓单核细胞样本，筛选得到差异表达基因——长链非编码RNA KIAA0125，利用qRT-PCR检测长链非编码RNA KIAA0125在急性髓系白血病患者外周血中的表达进行验证，通过GEPIA数据库统计分析173例急性髓系白血病患者和70例健康人骨髓细胞中长链非编码RNA KIAA0125 mRNA的表达与预后的关系。随后使用重组慢病毒技术及CRISPR/Cas9-SAM技术分别构建敲低/过表达长链非编码RNA KIAA0125的U937细胞系，qRT-PCR检测长链非编码RNA KIAA0125敲低/过表达效率。接下来，使用CCK-8实验、流式细胞术及Western blot检测敲低/过表达长链非编码RNA KIAA0125对U937细胞增殖、凋亡的影响。最后，使用Western blot检测敲低/过表达长链非编码RNA KIAA0125对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响。

结果与结论：①qRT-PCR结果显示长链非编码RNA KIAA0125在急性髓系白血病患者外周血中呈高表达，GEPIA数据库显示长链非编码RNA KIAA0125在急性髓系白血病患者骨髓细胞中呈高表达，高表达组具有更差的生存期；②敲低组长链非编码RNA KIAA0125的敲低效率为70%，成功构建了稳定敲低长链非编码RNA KIAA0125表达的U937细胞，过表达组长链非编码RNA KIAA0125的表达是Vector组的4倍，成功构建了稳定过表达长链非编码RNA KIAA0125的U937细胞；③敲低长链非编码RNA KIAA0125抑制U937细胞的增殖并促进其凋亡，过表达长链非编码RNA KIAA0125则促进U937细胞的增殖但对U937细胞的凋亡无显著影响；④敲低长链非编码RNA KIAA0125抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，而过表达长链非编码RNA KIAA0125则激活Wnt/β-catenin信号通路。结果表明，长链非编码RNA KIAA0125在急性髓系白血病外周血中呈高表达，其可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响U937细胞的增殖和凋亡，可能是急性髓系白血病的潜在预后标志物。

https://orcid.org/0009-0007-8466-120X (胡华丽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 急性髓系白血病, lncKIAA0125, Wnt/β-catenin, U937细胞, 增殖

Abstract: BACKGROUND: U937 cells can be used as a cell model for studying the biological characteristics, signaling pathways, and therapeutic targets of acute myeloid leukemia. Although it has been reported that long non-coding RNA KIAA0125 is highly expressed in acute myeloid leukemia, its biological function in U937 cells remains unclear, and its mechanism of action in the occurrence and development of acute myeloid leukemia needs to be further clarified.
OBJECTIVE: To investigate the expression level of long non-coding RNA KIAA0125 in peripheral blood of patients with acute myeloid leukemia and its effect on the proliferation and apoptosis of U937 cells.
METHODS: RNA-sequencing was used to analyze the bone marrow monocyte samples from acute myeloid leukemia patients, and the differentially expressed gene long non-coding RNA KIAA0125 was screened. The expression of long non-coding RNA KIAA0125 in peripheral blood of patients with acute myeloid leukemia was detected by qRT-PCR. The relationship between long non-coding RNA KIAA0125 mRNA expression and prognosis in bone marrow cells of 173 acute myeloid leukemia patients and 70 healthy people was statistically analyzed by GEPIA database. Subsequently, recombinant lentivirus technology and CRISPR/Cas9-SAM technology were used to construct U937 cell lines with knockdown/overexpression of long non-coding RNA KIAA0125. qRT-PCR was used to detect the knockdown/overexpression efficiency of long non-coding RNA KIAA0125. Next, CCK-8 assay, flow cytometry, and western blot assay were used to detect the effects of knockdown/overexpression of long non-coding RNA KIAA0125 on the proliferation and apoptosis of U937 cells. Finally, western blot assay was used to detect the effect of knockdown/overexpressed long non-coding RNA KIAA0125 on Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of qRT-PCR showed that long non-coding RNA KIAA0125 was highly expressed in peripheral blood of acute myeloid leukemia patients. The results of GEPIA database showed that long non-coding RNA KIAA0125 was highly expressed in bone marrow cells of acute myeloid leukemia patients, and the high expression group had worse overall survival. (2) The knockdown efficiency of long non-coding RNA KIAA0125 in knockdown group was 70%, and the U937 cells that stably down-regulated long non-coding RNA KIAA0125 expression were successfully constructed. The expression of long non-coding RNA KIAA0125 in overexpression group was four times that of vector group, and stable U937 cells were successfully constructed. (3) Knockdown of long non-coding RNA KIAA0125 inhibited the proliferation of U937 cells and promoted their apoptosis. Overexpression of long non-coding RNA KIAA0125 promoted the proliferation of U937 cells but had no significant effect on the apoptosis of U937 cells. (4) Knockdown of long non-coding RNA KIAA0125 inhibited the activity of Wnt/β-catenin signaling pathway, while overexpression of long non-coding RNA KIAA0125 activated Wnt/β-catenin signaling pathway. These results confirm that long non-coding RNA KIAA0125 is highly expressed in acute myeloid leukemia peripheral blood. Long non-coding RNA KIAA0125 may affect the proliferation and apoptosis of U937 cells by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway, and may be a potential prognostic marker for acute myeloid leukemia.

Key words: acute myeloid leukemia, lncKIAA0125, Wnt/β-catenin, U937 cell, proliferation

中图分类号:

胡华丽, 邓发滑, 刘远程, 王斯奇, 张静馨, 禄婷婷, 黄海, 韦四喜. 长链非编码RNA KIAA0125对急性髓系白血病U937细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 3983-3991.

Hu Huali, Deng Fahua, Liu Yuancheng, Wang Siqi, Zhang Jingxin, Lu Tingting, Huang Hai, Wei Sixi. Effects of long non-coding RNA KIAA0125 on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia U937 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 3983-3991.

图/表（结果） 4

2.1 lncKIAA0125在急性髓系白血病患者骨髓及外周血中的表达 使用高通量测序技术分析3例健康供者及3例急性髓系白血病患者骨髓标本，并使用edgeR分析获得差异表达的lncRNA，结果显示与健康对照组相比，急性髓系白血病组差异表达的lncRNA有1 117个，其中有438个表达上调，679个表达下调(图1A，B)；进一步分析各差异表达基因，结果显示lncKIAA0125在急性髓系白血病患者骨髓中呈高表达(图1C)。利用GEPIA数据库统计分析了173例急性髓系白血病患者和70例健康人骨髓细胞中lncKIAA0125 mRNA的表达与预后的关系，结果显示lncKIAA0125在急性髓系白血病患者骨髓细胞中呈高表达(图1D)，生存分析发现lncKIAA0125高表达组的总生存期短于lncKIAA0125低表达组(P=0.005 8，图1E)。qRT-PCR结果显示lncKIAA0125在急性髓系白血病患者外周血中呈高表达(图1F)。因此选择lncKIAA0125进行后续研究。

2.2 lncKIAA0125表达水平与急性髓系白血病患者临床特征的关系 将74例急性髓系白血病患者以lncKIAA0125相对表达量( 2-ΔΔCt)中位数6.06为界，分为lncKIAA0125低表达组(n=37)及高表达组(n=37)。患者的临床资料如表2所示，lncKIAA0125高表达组比低表达组年龄更大(P=0.045 1)；lncKIAA0125高表达组预后不良患者比例明显高于低表达组(35.1% vs. 13.5%，P=0.030 2)；与lncKIAA0125低表达组相比，lncKIAA0125高表达组性别、外周血白细胞及血小板水平、骨髓原始细胞比例均无显著差异(P > 0.05)。

2.3 敲低lncKIAA0125对U937细胞增殖及凋亡的影响 使用慢病毒技术构建lncKIAA0125稳定敲低的U937细胞系，qRT-PCR验证敲低效率(图2A)，选择sh-lnc KIAA0125#3(即sh-lncKIAA0125组)进行后续研究。CCK-8结果显示与sh-NC组相比，sh-lncKIAA0125组的U937细胞增殖能力减弱(图2B)。流式细胞术结果显示，与sh-NC组相比，sh-lncKIAA0125组的U937细胞凋亡率增加(图2C，D)。Western blot结果显示，与sh-NC组相比，sh-lncKIAA0125组增殖相关蛋白PCNA表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax表达增加(图2E，F)。

2.4 过表达lncKIAA0125对U937细胞增殖及凋亡的影响 利用CRISPR/Cas9-SAM系统构建稳定过表达lncKIAA0125的U937细胞系，qRT-PCR验证lncKIAA0125过表达效率，sgRNA-1的过表达效率最高，因此选择sgRNA-1(即OE-lncKIAA0125组)进行后续研究(图3A)。CCK-8结果显示，与Vector组相比，OE-lncKIAA0125组的U937细胞增殖能力增加(图3B)，流式细胞术结果显示Vector组与OE-lncKIAA0125组的U937细胞凋亡率无显著差异(图3C，D)，Western blot结果显示，与Vector组相比，OE-lncKIAA0125组增殖相关蛋白PCNA表达增加，但抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax表达无显著差异(图3E，F)。
2.5 敲低lncKIAA0125对Wnt/β-catenin通路的影响 研究表明，lncKIAA0125可通过Wnt/β-catenin通路调节结直肠癌的生长和转移[21]，说明lncKIAA0125可能通过影响Wnt/β-catenin信号通路来发挥作用。因此，该研究拟进一步探讨在急性髓系白血病细胞系——U937细胞中敲低lncKIAA0125对Wnt/β-catenin通路的影响。Western blot结果显示，与sh-NC组相比，sh-lncKIAA0125组的β-catenin、TCF4、c-Myc、Cyclin D1蛋白表达水平降低(图4A，B)。qRT-PCR结果显示，与sh-NC组相比，sh-lncKIAA0125组Wnt/β-catenin通路的下游基因c-Myc、Cyclin D1 mRNA表达水平降低(图4C)。以上结果提示，在敲低lncKIAA0125后，抑制了Wnt/β-catenin信号通路，导致通路中的关键蛋白β-catenin降低，与β-catenin相结合的蛋白TCF4水平降低，从而抑制下游基因c-Myc、Cyclin D1的转录，进一步抑制U937细胞的增殖并促进细胞凋亡。
2.6 过表达lncKIAA0125对Wnt/β-catenin通路的影响 Western blot结果显示，与Vector组相比，OE-lncKIAA0125组的β-catenin、TCF4、c-Myc、Cyclin D1蛋白表达水平增加(图5A，B)。qRT-PCR结果显示，与Vector组相比，OE-lncKIAA0125组Wnt/β-catenin通路的下游基因c-Myc、Cyclin D1 mRNA表达水平增加(图5C)。以上结果提示，在过表达lncKIAA0125后，激活了Wnt/β-catenin信号通路，使通路中的关键蛋白β-catenin增加，与β-catenin相结合的蛋白TCF4水平增加，从而促进下游基因c-Myc、Cyclin D1的转录，进一步促进了U937细胞的增殖。

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引言

急性髓系白血病是一种以造血干/祖细胞异常克隆扩增和分化停滞为特征的血液恶性肿瘤，主要表现为外周血及骨髓中原始或幼稚髓性细胞异常增生[1]，其发病率随着年龄的增长而增加[2]。目前，急性髓系白血病治疗以化疗和异基因造血干细胞移植为主[3]，随危险分层诊疗的研究深入，极大提高了患者的总生存率，但由于化疗耐受性差、移植后并发症、治疗相关性死亡率高，患者的总体疗效仍不乐观[4-5]。因此，寻找急性髓系白血病发病过程中的相关致病基因，深入探讨急性髓系白血病的发生发展及其分子机制，对了解疾病的分子基础有重要的价值，并对急性髓系白血病的临床诊断和预后判断具有重要意义。
长链非编码RNA(long nocoding RNA，lncRNA)是由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录生成的长度大于200个核苷酸的RNA[6]。根据lncRNA的定位和与DNA、RNA及蛋白质特定相互作用，在肿瘤细胞的生长、分化及肿瘤的发生发展中起着重要作用[7-8]。近年来，lncRNA在急性髓系白血病中的机制探索也愈发广泛。越来越多的文献报道lncRNA参与急性髓系白血病的发生发展、介导急性髓系白血病细胞耐药、影响急性髓系白血病治疗分层及预后判断，为急性髓系白血病的诊治提供了新的方向[9-12]。
lncKIAA0125(也称为FAM30A)是定位于染色体14q32.33上的lncRNA，近年来的研究发现其在不同的疾病中异常表达并发挥作用。在结直肠癌中，lncKIAA0125可通过海绵化has-miR-29b-3p来调节PI3K-AKT信号通路，促进结直肠癌的发展[13]。研究发现lncKIAA0125在成釉细胞瘤中高表达，但具体作用机制未能阐明[14]。值得注意的是，lncKIAA0125在血液肿瘤中也有相关报道。HUNG等[15]发现lncKIAA0125在骨髓增生异常综合征患者中高表达，是高危骨髓增生异常综合征患者总生存期的潜在预后标志物。在急性髓系白血病中lncKIAA0125高表达，与患者的总生存期呈负相关[16]，且与急性髓系白血病RUNX1/RUNX1T1融合基因、RUNX1突变显著相关[17]。目前lncKIAA0125对急性髓系白血病细胞生物学功能的影响尚不明确，在急性髓系白血病发生发展及预后判断中的作用机制有待进一步阐明。研究表明U937细胞可以作为急性髓系白血病细胞模型，用于研究急性髓系白血病的生物学特性、信号通路和治疗靶点[18]。
该研究首先通过RNA-seq从健康供者及急性髓系白血病患者骨髓样本中筛选得到差异表达基因lncKIAA0125，利用qRT-PCR检测lncKIAA0125在急性髓系白血病患者外周血中的表达情况并分析与临床特征的关系。随后，使用重组慢病毒技术和CRISPR/Cas9-SAM技术分别构建敲低和过表达lncKIAA0125的U937细胞系，通过功能学实验验证过表达和敲低lncKIAA0125对U937细胞增殖、凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响，以期为阐明lncKIAA0125在U937细胞中的作用机制提供实验基础及理论依据，为急性髓系白血病诊疗标志物开发及预后分层因素挖掘提供新的方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 生物信息学分析结合外周血标本验证，qRT-PCR结果采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2022年12月至2024年2月在贵州医科大学医学检验学院中心实验室完成。
1.3 材料 经贵州医科大学附属医院医学伦理委员会批准及患者知情同意，批准号：2019(169)、2023(655)，收集2020-2023年于贵州医科大学附属医院就诊的急性髓系白血病患者的骨髓样本3例及健康对照骨髓样本3例，健康人外周血样本71例及急性髓系白血病患者的外周血样本74例。其中健康人群包括男37例，女34例，年龄为(39±15)岁；急性髓系白血病患者包括男39例，女35例，年龄(42±17)岁，M2型34例，M4型15例，M5型24例，M6型1例。
纳入标准：依据WHO诊断标准，诊断为急性髓系白血病患者，急性髓系白血病分型参照French-America-British(FAB)标准明确诊断[19]。
排除标准：①病史资料不完善或难以随访患者；②FAB分型为 M3型患者；③急性混合细胞白血病患者。
试剂和仪器：人急性髓系白血病细胞株U937细胞为课题组冻存细胞。RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自以色列Biological Industries公司；PCR引物购自上海生工生物工程有限公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒及qRT-PCR试剂均购自日本Takara公司；流式AnnexinV-APC/7AAD试剂购自武汉普诺赛生命科技有限公司；RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂购自大连美仑生物技术有限公司；一抗：GAPDH购自南京巴傲得生物科技有限公司，PCNA购自Santa Cruz公司，c-Myc购自沈阳万类生物技术有限公司，Bax、Bcl-2、β-catenin、TCF4、Cyclin D1均购自武汉三鹰生物技术有限公司；二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗购自南京巴傲得生物科技有限公司；普通PCR仪、Nanodrop One分光光度计、酶标仪及AppliedBiosystems QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司；FACSCanto II流式细胞仪购自美国BD公司；凝胶成像分析仪购自美国BIO-RAD公司。
1.4 方法
1.4.1 RNA-seq 收集3例健康供者及3例急性髓系白血病患者的骨髓样本，使用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，提取骨髓单个核细胞RNA，取1 μg总RNA于Illumina Novaseq 6000系统中行高通量RNA-seq，采用edgeR筛选差异表达基因[20]，差异表达基因筛选条件设置为差异倍数(fold change)> 2，错误发现率(false discovery rate，FDR) < 0.05。骨髓单个核细胞RNA的提取、检测及测序交由武汉生命之美科技有限公司完成。
1.4.2 生物信息学分析 使用基因表达谱交互式分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA2)在线生物信息学软件对癌症基因组图谱(TCGA)数据库中的数据进行统计分析，选择目的基因lncKIAA0125和目的疾病急性髓系白血病进行筛选，得出lncKIAA0125在急性髓系白血病患者骨髓细胞中的表达情况，并进行生存曲线分析。
1.4.3 细胞培养 U937细胞在含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640完全培养基中培养，放于37 ℃、体积分数5%CO2恒湿培养箱中，每隔2 d换液、传代1次。
1.4.4 过表达、敲低lncKIAA0125细胞系构建 使用慢病毒技术构建敲低lncKIAA0125的U937细胞系，使用CRISPR/Cas9-SAM系统构建过表达lncKIAA0125的U937细胞系。将所需感染的第4代U937细胞种植于6孔板中(7×105个/孔)，加入含体积分数10%胎牛血清但不含青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基培养，设置5组：非处理空白组、sh-NC组、sh-lncKIAA0125组，Vector组、OE-lncKIAA0125组，待细胞密度达60%-80%时，按照说明书进行转染，48 h后所有孔内加入Puromycin进行筛选，每2 d换液1次，筛选7 d。待稳定转染细胞系状态良好时，收集各组细胞，使用TRIzol试剂提取RNA，采用qRT-PCR验证敲低效率和过表达效率。
1.4.5 RNA提取和qRT-PCR 按照试剂说明，使用TRIzol试剂提取临床外周血样本和已构建的过表达、敲低lncKIAA0125的第5代U937细胞系总RNA，使用Takara反转录试剂将RNA反转录为cDNA，使用2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix进行qPCR检测，引物序列见表1，以GAPDH为内参，采用 2-ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达量。

1.4.6 CCK-8法检测细胞增殖 计数sh-NC组、sh-lncKIAA0125组、Vector组、OE-lncKIAA0125组细胞，在预先标记好组别及时间(0，24，48，72 h)的96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液(1×104个/孔)，在96孔板外围一圈孔中加入PBS以减少培养基的挥发。在上述标记时间每孔加入10 μL CCK-8试剂，轻轻敲板壁使试剂与细胞悬液混匀后，放入培养箱孵育3 h，采用酶标仪测定450 nm波长的吸光度值(A值)，计算各组细胞存活率。细胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%。As：实验组(sh-lncKIAA0125组、OE-lnc KIAA0125组)吸光度值(含细胞、培养基、CCK-8试剂)；Ac：对照组(sh-NC组、Vector组)吸光度值(含细胞、培养基、CCK-8试剂)；Ab：培养基吸光度值(含培养基、CCK-8试剂，不含细胞)。

1.4.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集sh-NC组、sh-lncKIAA0125组、Vector组、OE-lncKIAA0125组细胞沉淀，用预冷的PBS洗涤后离心弃上清，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，再分别加入5 μL 7-AAD染液及5 μL APC染液，移液器吹打混匀，避光静置15 min(室温)，随后向管中加入400 μL 1×Binding Buffer以重悬细胞，通过FACSCanto II流式细胞仪检测细胞凋亡情况，使用NovoExpress软件分析凋亡率。
1.4.8 Western blot检测蛋白的变化 收集sh-NC组、sh-lncKIAA0125组、Vector组、OE-lncKIAA0125细胞沉淀，加入RIPA试剂(裂解液∶蛋白酶抑制剂=100∶1)，使用超声破碎细胞后4 ℃，12 000 r/min离心20 min，吸取上清，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，取35 μg蛋白经SDS-PAGE电泳后将蛋白转至PDVF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，放入相应的一抗中，稀释比例：GAPDH(1∶10 000)、PCNA(1∶5 000)、Bcl-2(1∶5 000)、Bax(1∶2 000)、β-catenin(1∶1 000)、TCF4(1∶1 000)、Cyclin D1(1∶2 000)、c-Myc(1∶1 000)，于4 ℃孵育过夜后使用1×TBST洗膜3次，放入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗或羊抗鼠二抗(1∶10 000)中，室温孵育1 h后使用1×TBST洗膜3次，最后用ECL化学发光试剂显影。采用Image J软件对蛋白条带灰度进行分析，以GAPDH作为内参计算相对蛋白表达量。
1.5 主要观察指标 ①qRT-PCR检测lncKIAA0125在急性髓系白血病患者外周血中的表达；②qRT-PCR检测敲低或过表达lncKIAA0125后U937细胞中lncKIAA0125的表达；③CCK-8法检测各组U937细胞的增殖情况；④流式细胞术检测各组U937细胞的凋亡率；⑤Western blot检测增殖指标PCNA，凋亡指标Bcl-2、Bax、Wnt/β-catenin信号通路相关因子β-catenin、TCF4、Cyclin D1、c-Myc的蛋白表达；⑥qRT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路下游基因Cyclin D1、c-Myc的mRNA表达。

1.6 统计学分析 应用SPSS 26.0进行实验数据分析，GraphPad Prism 8进行图形绘制。利用Shapiro-Wilk方法检验计量资料是否符合正态分布，计量资料符合正态分布的数据以x±s表示，组间差异采用t检验；不符合正态分布的数据以中位数和四分位数表示，采用非参数检验；计数资料数据以百分比表示，组间比较采用χ2检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

急性髓系白血病是高度异质性的恶性血液病，近年来随着高通量测序技术的发展，对急性髓系白血病的发病机制有了更多的认识，但急性髓系白血病患者仍存在预后不良和长期总生存率低的问题[22]。因此，仍需挖掘新的分子靶点并探索其在急性髓系白血病中的作用以改善患者的预后。
该研究使用高通量测序技术筛选健康供者与急性髓系白血病患者骨髓标本中差异表达的lncRNA并进行分析，得到lncKIAA0125在急性髓系白血病患者骨髓中呈高表达，使用qRT-PCR进一步验证lncKIAA0125在急性髓系白血病患者外周血中也呈高表达，GEPIA数据库分析发现lncKIAA0125高表达组患者的总生存期短于低表达组，通过分析急性髓系白血病患者的临床资料，发现与lncKIAA0125低表达组相比，lncKIAA0125高表达组预后不良的患者比例更高(P=0.030 2)，结果提示lncKIAA0125与急性髓系白血病患者预后相关，lncKIAA0125可能成为急性髓系白血病患者预后标志物。这与已有的文献报道相似，NG等[16]在一个大型训练队列中对白血病干细胞的基因表达与生存率进行回归分析，lncKIAA0125是17个干细胞相关基因之一，可以预测急性髓系白血病患者的预后；WANG
等[17]使用微阵列分析347例急性髓系白血病患者与30名健康对照组骨髓细胞中lncKIAA0125的表达水平，结果显示lncKIAA0125在急性髓系白血病患者骨髓细胞中呈高表达，其高表达与患者总生存期较低相关。结合实验及文献分析说明lncKIAA0125具有较好的临床研究及应用价值。
急性髓系白血病的发病率在65-74岁的人群中为25.1%，而75岁及以上人群中则增加至33.7%[23]。有多种因素可以影响急性髓系白血病的预后，除了基因突变状态、细胞遗传学之外，年龄也是一个重要因素[24]。该研究发现，与lncKIAA0125低表达组相比，lncKIAA0125高表达组年龄更大(P=0.045 1)，预后不良的患者比例更高(P=0.030 2)。研究表明，在急性髓系白血病患者的骨髓及血液中存在大量恶性的白血病细胞，使造血功能受到抑制。初诊急性髓系白血病患者白细胞计数与预后密切相关，白细胞病理性增多是急性髓系白血病患者预后不良的重要指征之一[25]。血小板来源于骨髓中的巨核系细胞，计数外周血中的血小板可以间接反映骨髓造血功能[26]；急性髓系白血病患者血小板计数与患者初诊白细胞计数、年龄、复发率及预后等密切相关[27]。该研究结果显示，lncKIAA0125高表达组与低表达组在性别、外周血白细胞及血小板水平、骨髓原始细胞比例均无显著差异，这可能是由于急性髓系白血病患者具有较高的异质性。
研究表明细胞增殖已被认为是肿瘤患者预后不良的主要原因，PCNA是肿瘤增殖的标志物，与肿瘤的发生发展密切相关[28]。Bcl-2蛋白家族成员是调控细胞凋亡的关键分子，包括Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白，以及Bax、Bak等促凋亡蛋白[29-31]。该研究证实敲低lncKIAA0125可以抑制U937细胞增殖并促进细胞凋亡，增殖相关指标PCNA表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2降低、促凋亡蛋白Bax增加；相反地，过表达lncKIAA0125可以促进U937细胞的增殖但对细胞凋亡影响不大，PCNA蛋白表达增加。说明lncKIAA0125在U937细胞中可能影响细胞增殖，从而促进急性髓系白血病的恶性进程。
Wnt/β-catenin信号通路是一种重要的细胞信号转导通路，在正常情况下它参与了包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡在内的多种生物学过程[32]。然而，当Wnt信号通路被过度激活时，会导致β-catenin蛋白在细胞质中的积累，从而引发一系列的疾病。例如，在许多类型的癌症中，都发现了Wnt信号通路的异常激活，包括结直肠癌、骨肉瘤、前列腺癌和口腔鳞状细胞癌[33-35]。越来越多的证据表明，Wnt/β-catenin在调节急性髓系白血病的发生和发展中起着重要作用，如SAKODA等[36]发现急性髓系白血病干细胞通过自分泌TIM-3/HCK/p120-catenin 信号以激活β-catenin。YE等[37]证明ACSL5基因在急性髓系白血病中通过棕榈酰化修饰调节Wnt/β-catenin信号的活性。lncKIAA0125可通过Wnt/β-catenin通路调节结直肠癌的生长和转移[21]。该研究发现敲低lncKIAA0125可以抑制U937细胞中β-catenin的蛋白水平，而过表达lncKIAA0125则增加U937细胞中β-catenin的蛋白水平，提示lncKIAA0125可能激活了Wnt信号通路。
β-catenin作为Wnt信号通路的关键分子，核内的β-catenin可结合淋巴增强子结合因子或T细胞因子家族的蛋白，进一步将T细胞因子从转录抑制因子转化为转录激活因子[38]。TCF4是T细胞因子家族成员之一，其酪氨酸及丝氨酸结构能与β-catenin相结合形成TCF4/β-catenin复合物，可增加一系列下游癌基因的表达水平，如c-Myc、CyclinD1、Axin2和CD44[39]。c-Myc是Wnt靶基因之一，是一种基本的螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH/LZ)转录因子，控制基因组中高达15%基因的表达，并调节各种细胞过程，如增殖、分化和凋亡[40-42]。c-Myc在造血干细胞中表达最高，在髓系分化过程中表达降低[43]。CyclinD1作为细胞周期进程的正调节因子，可诱导细胞过度生长，是恶性癌症的重要标志物[44]。该研究结果表明，在U937细胞中敲低lncKIAA0125可以抑制与β-catenin相结合的TCF4蛋白表达水平，从而抑制下游靶基因c-Myc和CyclinD1的蛋白及mRNA水平；而过表达lncKIAA0125则增加TCF4蛋白表达水平，激活Wnt下游靶基因c-Myc和CyclinD1的蛋白及mRNA水平。这些结果提示，在U937细胞中高表达的lncKIAA0125激活了Wnt/β-catenin信号通路，使通路中的关键蛋白β-catenin增加，与β-catenin相结合的蛋白TCF4水平增加，从而促进下游基因c-Myc、Cyclin D1的转录，可能进一步促进了U937细胞的增殖(图6)。

综上所述，该研究验证了lncKIAA0125在急性髓系白血病患者骨髓及外周血中呈高表达，并分析了lncKIAA0125高表达与临床特征的关系，创新性地使用慢病毒技术及CRISPR/Cas9-SAM系统构建敲低/过表达lncKIAA0125的U937细胞系，证明敲低lncKIAA0125能够抑制U937细胞增殖，促进细胞凋亡，过表达lncKIAA0125则促进细胞增殖，其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路影响U937细胞增殖及凋亡，为急性髓系白血病诊疗标志物开发及预后分层因素挖掘提供新的方向。但该研究也存在一些局限：第一，lncKIAA0125在急性髓系白血病中的细胞功能学实验只在U937细胞中进行了验证；第二，lnRNA发挥功能与其亚细胞定位相关，需要更多的实验验证lncKIAA0125具体通过什么机制影响Wnt/β-catenin信号通路。在未来的研究中，将在其他急性髓系白血病细胞系如Kasumi-1、THP-1细胞中进一步验证lncKIAA0125的生物学功能；通过核质分离实验验证lncKIAA0125的亚细胞定位，根据定位情况选择RNA免疫沉淀实验、双荧光素酶实验等找到与之相互作用的靶分子或靶蛋白，进一步阐明lncKIAA0125通过靶分子或靶蛋白调节信号通路影响细胞增殖、凋亡的具体机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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长链非编码RNA KIAA0125对急性髓系白血病U937细胞增殖和凋亡的影响

Effects of long non-coding RNA KIAA0125 on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia U937 cells

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