氧化苦参碱对牙周膜干细胞干性标志物表达和成骨分化的作用

doi:10.12307/2025.056

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 3992-3999.doi: 10.12307/2025.056

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

氧化苦参碱对牙周膜干细胞干性标志物表达和成骨分化的作用

罗晶1，2，雍敏3，陈琦3，杨长怡4，赵恬3，马静3，梅冬兰3，虎金鹏1，杨昭君1，王钰然1，刘博1

1宁夏医科大学口腔医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；2宁夏回族自治区干细胞与再生医学重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏医科大学总医院，3口腔正畸科，4牙周病科，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2024-01-13 接受日期:2024-04-03 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-12
通讯作者: 雍敏，硕士，副教授，主任医师，宁夏医科大学总医院口腔正畸科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:罗晶，女，1996年生，宁夏回族自治区中卫市人，回族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事口腔正畸学方面的研究。
基金资助:
宁夏医科大学2021年一流学科建设专项：颅颌面畸形诊疗的基础与临床应用方向(0019110104)，项目参与人：雍敏；宁夏回族自治区科技惠民专项(2022CMG03029)，项目负责人：雍敏

Effect of oxymatrine on expression of stem markers and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells

Luo Jing1, 2, Yong Min3, Chen Qi3, Yang Changyi4, Zhao Tian3, Ma Jing3, Mei Donglan3, Hu Jinpeng1, Yang Zhaojun1, Wang Yuran1, Liu Bo1

1School of Stomatology, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Department of Orthodontics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 4Department of Periodontology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2024-01-13 Accepted:2024-04-03 Online:2025-07-08 Published:2024-09-12
Contact: Yong Min, Master, Associate professor, Chief physician, Department of Orthodontics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Luo Jing, Master candidate, School of Stomatology, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
2021 First-Class Discipline Construction Project of Ningxia Medical University, No. 0019110104 (to YM); Science and Technology Benefit People Special Project of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2022CMG03029 (to YM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

牙周膜干细胞：是一种牙齿来源的间充质干细胞，具有增殖、迁移、成骨分化等作用，在牙和牙周组织再生中具有很大的应用前景，因此探究牙周膜干细胞相关生物学特性具有十分重要的意义。
氧化苦参碱：是苦参碱类生物碱的一种，具有抗炎、抗病毒、抗癌等多种药理活性，对多种组织和器官如肝脏、肾脏可以发挥保护作用。

摘要
背景：人牙周膜干细胞是牙周再生组织工程潜在的功能细胞，然而长期体外培养会导致牙周膜干细胞干性减低并发生复制性衰老，从而影响其治疗效果。
目的：探讨氧化苦参碱在体外对牙周膜干细胞干性维持和骨向分化的影响，并寻找潜在的影响机制。
方法：采用组织块酶消化法从人牙周膜组织中分离、培养得到牙周膜干细胞，并使用流式细胞仪进行间充质细胞表面标志物鉴定。用0，2.5，5，10 μg/mL氧化苦参碱孵育牙周膜干细胞，通过CCK8实验检测氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖活性的影响，筛选后续实验合适的药物质量浓度，采用Western blot检测牙周膜干细胞中干细胞非特异性蛋白SOX2和OCT4的表达，采用qRT-PCR、Western blot检测牙周膜干细胞中成骨相关基因和蛋白表达水平。

结果与结论：①CCK8实验结果显示2.5 μg/mL氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖活性有显著增强作用，后续实验选用2.5 μg/mL氧化苦参碱进行干预；②与空白对照组相比，氧化苦参碱组牙周膜干细胞的干性标志物SOX2蛋白表达水平变化不明显(P > 0.05)，OCT4蛋白表达明显上调(P < 0.05)；③与成骨诱导组相比，氧化苦参碱+成骨诱导组牙周膜干细胞成骨相关基因ALP、RUNX2 mRNA表达及成骨相关蛋白ALP蛋白表达明显下调(P < 0.05)；④氧化苦参碱上调牙周膜干细胞干性标志物表达，抑制牙周膜干细胞骨向分化，高通量测序结果表明可能与WNT2、WNT16、COMP、BMP6有关。

https://orcid.org/0009-0008-5429-7651 (罗晶)；https://orcid.org/0009-0001-7694-3107 (雍敏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 牙周膜干细胞, 苦参碱类生物碱, 成骨, 细胞增殖, 氧化苦参碱, 干性维持, 高通量测序

Abstract: BACKGROUND: Human periodontal ligament stem cells are potential functional cells for periodontal tissue engineering. However, long-term in vitro culture may lead to reduced stemness and replicative senescence of periodontal ligament stem cells, which may impair the therapeutic effect of human periodontal ligament stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of oxymatrine on the stemness maintenance and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells in vitro, and to explore the potential mechanism.
METHODS: Periodontal ligament stem cells were isolated from human periodontal ligament tissues by tissue explant enzyme digestion and cultured. The surface markers of mesenchymal cells were identified by flow cytometry. Periodontal ligament stem cells were incubated with 0, 2.5, 5, and 10 μg/mL oxymatrine. The effect of oxymatrine on the proliferation activity of periodontal ligament stem cells was detected by CCK8 assay. The appropriate drug concentration for subsequent experiments was screened. Western blot assay was used to detect the expression of stem cell non-specific proteins SOX2 and OCT4 in periodontal ligament stem cells. qRT-PCR and western blot assay were used to detect the expression levels of related osteogenic genes and proteins in periodontal ligament stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of CCK8 assay showed that 2.5 μg/mL oxymatrine significantly enhanced the proliferative activity of periodontal stem cells, and the subsequent experiment selected 2.5 μg/mL oxymatrine to intervene. (2) Compared with the blank control group, the protein expression level of SOX2, a stem marker of periodontal ligament stem cells in the oxymatrine group did not change significantly (P > 0.05), and the expression of OCT4 was significantly up-regulated (P < 0.05). (3) Compared with the osteogenic induction group, the osteogenic genes ALP, RUNX2 mRNA expression and their osteogenic associated protein ALP protein expression of periodontal ligament stem cells were significantly down-regulated in the oxymatrine + osteogenic induction group (P < 0.05). (4) The oxymatrine up-regulated the expression of stemness markers of periodontal ligament stem cells and inhibited the bone differentiation of periodontal ligament stem cells, and the results of high-throughput sequencing showed that it may be associated with WNT2, WNT16, COMP, and BMP6.

Key words: periodontal ligament stem cell, matrine alkaloids, osteogenesis, cell proliferation, oxymatrine, stemness maintenance, high-throughput sequencing

中图分类号:

罗晶, 雍敏, 陈琦, 杨长怡, 赵恬, 马静, 梅冬兰, 虎金鹏, 杨昭君, 王钰然, 刘博. 氧化苦参碱对牙周膜干细胞干性标志物表达和成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 3992-3999.

Luo Jing, Yong Min, Chen Qi, Yang Changyi, Zhao Tian, Ma Jing, Mei Donglan, Hu Jinpeng, Yang Zhaojun, Wang Yuran, Liu Bo. Effect of oxymatrine on expression of stem markers and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 3992-3999.

图/表（结果） 2

2.1 牙周膜干细胞形态、表面标志物表达及骨向分化能力鉴定 人牙周组织块在T25培养瓶内培养，5-7 d后在倒置显微镜下可见组织块周围长出纺锤形细胞，细胞排列稀疏不均匀，生长较慢，见图1A。第3代牙周膜干细胞在倒置显微镜下呈长梭形，生长较快，排列紧密，见图1B；第3代牙周膜干细胞成骨诱导21 d后进行茜素红染色，镜下可见培养板底部有橙红色结节形成，说明分离出来的细胞具有成骨分化能力，见图1C。流式细胞仪检测牙周膜干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105；阴性表达白细胞共同抗原CD45，体现了间充质干细胞的干性特点，见图1D。
2.2 氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖能力的影响 CCK8实验检测0，2.5，5，10 μg/mL氧化苦参碱孵育1，3，5，7 d后细胞增殖活性变化，用于评估氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖能力的影响。如图2所示，随着时间的延长，各组细胞数量呈增加趋势。第1天时，10 μg/mL氧化苦参碱组细胞数量低于2.5 μg/mL氧化苦参碱组(P < 0.05)；第3天时组间没有明显差异；第5天时，10 μg/mL氧化苦参碱组细胞数量低于2.5 μg/mL氧化苦参碱组(P < 0.01)；第7天时，4组细胞生长趋势减缓，2.5 μg/mL氧化苦参碱组细胞数量高于0 μg/mL氧化苦参碱组(P < 0.05)。综上，初步选择低质量浓度2.5 μg/mL氧化苦参碱进行后续实验。
2.3 氧化苦参碱作用下牙周膜干细胞中干细胞标志物的表达 培养7 d后，采用Western blot检测空白对照组和氧化苦参碱组牙周膜干细胞中干细胞标志物SOX2和OCT4 的表达。由图3所示，氧化苦参碱组SOX2蛋白表达较空白对照组无明显变化(P > 0.05)；与空白对照组相比，氧化苦参碱组OCT4蛋白表达明显上升，差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.4 氧化苦参碱作用下牙周膜干细胞成骨诱导后成骨相关基因和蛋白表达水平 与空白对照组相比，成骨诱导组早期成骨基因ALP表达明显上调，表明牙周膜干细胞成骨分化诱导成功，由于培养时间短，故成骨诱导组中RUNX2基因表达差异不明显；与成骨诱导组相比，氧化苦参碱+成骨诱导组牙周膜干细胞成骨相关基因RUNX2(P < 0.05)、ALP(P < 0.000 1)表达明显降低，以上实验结果说明氧化苦参碱可以抑制牙周膜干细胞的成骨向分化，见图4A，B。同期，Western blot实验结果表明，成骨相关蛋白ALP的表达趋势与ALP成骨基因表达的趋势一样，即：与空白对照组相比，成骨诱导组早期成骨相关蛋白ALP表达水平明显上调(P < 0.000 1)；与成骨诱导组相比，氧化苦参碱+成骨诱导组牙周膜干细胞成骨相关蛋白ALP的表达水平显著下降(P < 0.000 1)，见图4C，D。

2.5 高通量测序分析氧化苦参碱对牙周膜干细胞成骨分化抑制的潜在机制 测序结果显示成骨诱导组、氧化苦参碱+成骨诱导组共表达5 381个差异基因，其中2 583个上调基因，2 798个下调基因，见图5A。对2 798个下调基因进行筛选，筛选条件为Q值(OM/Con) ≤ 0.05，并将Log2 (OM/Con)值升序排列，得到下调前50个基因，将这些基因进行网络互作分析，见图5B；检索国内外相关文献，从上述50个基因中挑选出调节间充质干细胞成骨的相关基因，以更好地了解氧化苦参碱对牙周膜干细胞成骨分化的影响，寻找潜在的可能机制，文献显示，调节间充质干细胞骨向分化信号通路中WNT2、WNT16、COMP、BMP6基因参与其中[22-25]；利用聚类热图检测这4个基因在两组牙周膜干细胞的表达，根据两组样本的颜色对比，WNT16、COMP、BMP6在成骨诱导组和氧化苦参碱+成骨诱导组中颜色差异较WNT2大，说明在送检两组样本中WNT16、COMP、BMP6基因表达较WNT2差异更大，同时WNT2、WNT16、COMP、BMP6基因在氧化苦参碱+成骨诱导组中颜色偏蓝，表示这4个基因在该组中表达下调，见图5C。
2.6 PCR验证氧化苦参碱对牙周膜干细胞成骨分化抑制的潜在机制 图6A-D为选择WNT2、WNT16、BMP6、COMP这4个下调的mRNA进行实时荧光定量PCR验证，与空白对照组相比，成骨诱导组牙周膜干细胞中WNT2、WNT16、BMP6、COMP表达均明显增强，说明这些基因与牙周膜干细胞成骨分化呈正相关；氧化苦参碱+成骨诱导组WNT2、WNT16、BMP6、COMP表达较成骨诱导液组下调，表明氧化苦参碱负向调控牙周膜干细胞的骨向分化。

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引言

牙周膜是一种致密结缔组织，分布于牙齿根部和牙齿周围之间，具有缓冲咬合力、保持牙槽骨高度、感受刺激以及形成牙周组织的作用。牙周膜干细胞是从牙周膜中分离出来的间充质干细胞，可以分化为骨组织和牙周组织。目前在牙周再生组织工程研究方面，牙周膜干细胞与多种材料或支架结合，或者加入各种骨诱导剂和其他策略应用于牙周膜干细胞，均取得了有效的效果[1]。牙周膜干细胞表现出自我更新能力和多能性，当在体外暴露于诱导分化剂时，它们可以分化为成骨细胞、脂肪细胞及其他多种细胞[2-4]；在体内植入牙周缺损处时，可以诱导牙周再生，包括新骨、牙骨质和牙周膜的形成[5-7]。然而，牙周膜干细胞在组织工程中面临细胞数量少、培养时间过长等问题，使扩增能力受损以及细胞衰老[8]，因此，提高牙周膜干细胞体外扩增能力和临床疗效是口腔研究的重要部分。
生物碱是一类具有不同药理活性的天然化合物。近年来国内外有关苦参碱类生物碱的药理作用研究较多。氧化苦参碱是苦参碱类生物碱的一种，广泛存在于豆科植物，例如苦参、苦豆子等。研究表明，氧化苦参碱具有抗癌活性、抗病毒感染、抗肝纤维化、抗炎症等作用[9-12]，可以抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖[13]。氧化苦参碱可抑制脂多糖刺激的人牙周膜细胞中白细胞介素6和白细胞介素1β mRNA的表达[14]；应用于电离辐射小鼠可以增加造血干细胞数量，从而恢复小鼠造血重建功能[15]；还可通过增强自噬活性，抑制神经元细胞凋亡，从而发挥神经保护作用[16]。细胞自噬活性与细胞干性联系密切，研究显示自噬与成釉细胞谱系干细胞干性维持、增殖分化具有正向相关特性[17]。同时，多项研究揭示了氧化苦参碱与骨代谢的关系[18-20]，可以通过阻断RANKL诱导的NFATc1和c-fos信号通路来抑制破骨细胞生成[21]。然而，目前关于氧化苦参碱对牙周组织的影响及相关机制的研究报道很少，尤其在牙周膜干细胞方面。该研究拟初步体外探究氧化苦参碱对牙周膜干细胞生物学特性的作用，为后续牙周组织再生研究和氧化苦参碱药物在口腔医学中的应用提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。
1.2 时间及地点 实验于2021年9月至2023年11月在宁夏回族自治区干细胞与再生医学重点实验室和宁夏医科大学医学科学技术研究中心细胞生物学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验仪器 超净工作台(Thermo，美国)；生物安全柜(Thermo Fisher，美国)；二氧化碳培养箱(Thermo，美国)；全自动高压蒸汽灭菌器(SX-500 TOMY，中国)；iQ-5实时定量PCR扩增仪(Bio-Rad，美国)；培养板、培养皿、培养瓶等(Corning，美国)；微量移液枪(Eppendorf，德国)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本)；4 ℃低温高速离心机(Thermo，美国)；流式细胞仪(BD FACSCelesta，美国)；酶标仪(Thermo，美国)；多功能成像仪(PerkinElmer，美国)；Western blot电泳仪(北京君意公司，中国)；超纯水过滤机(Millipore，美国)；制冰机(Sanyo，日本)。
1.3.2 实验药材和试剂 氧化苦参碱购自上海源叶生物科技有限公司，20 mg，溶解于α-MEM培养基中制备成10 mg/mL储备溶液；胎牛血清、α-MEM培养基(BI，以色列)；PBS(HyClone，美国)；0.25%胰蛋白酶(北京赛文创新，中国)；青霉素+链霉素(北京赛文创新，中国)；Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型Dispase酶(Sigma，美国)；CD45、CD73、CD90、CD105抗体(Biolegend，美国)；抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠、IBMX、吲哚美辛、胰岛素(Sigma，美国)；茜素红(Sigma，美国)；40 g/L多聚甲醛(北京赛文创新，中国)；Trizol Reagent(Thermo Fisher Scientific，美国)；反转录试剂盒Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCRII(艾科瑞生物，中国)；qPCR试剂盒SYBRP Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(艾科瑞生物，中国)；RIPA裂解液、PMSF(Solarbio，中国)；SDS上样缓冲液(碧云天，中国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(博士德，中国)；PVDF膜(Merck millipore，美国)；脱脂奶粉(伊利，中国)；超敏ECL化学发光试剂盒(北京赛文创新，中国)；碱性磷酸酶多克隆抗体、SOX2多克隆抗体、OCT4/POu5F1多克隆抗体、β-actin抗体(Proterintech，美国)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥，北京)。
1.4 实验方法
1.4.1 人牙周膜干细胞的分离、培养 课题研究前经宁夏医科大学总医院医学伦理审查委员会伦理审核(编号KYLL-2024-0128)。采集12-18岁患者(征得患者及家属同意并签署知情同意书 )因正畸减数无菌操作下新鲜拔除的健康第一前磨牙，牙齿拔出后立即放入含体积分数15%胎牛血清的α-MEM培养基中，用PBS冲洗牙根3 遍，用无菌锐利刀片刮取根中1/3区域的牙周结缔组织，剪成1.5 mm³大小的组织块，在15 mm培养皿中用PBS冲洗4-6次，1 000 r/min离心5 min，将样本转移至含有Dispase酶(4 mg/mL)和Ⅰ型胶原酶(3 mg/mL)的α-MEM培养基中，置于CO2培养箱内消化40 min，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，转移至T25培养瓶中在CO2培养箱内培养，待组织块边缘有细胞爬出时每隔3 d更换1次培养液，待生长汇合达80% 时，用0.25%胰酶进行消化，按1 ∶2或1 ∶3比例传代，实验选用3-6代细胞。
1.4.2 牙周膜干细胞的形态观察 将第2代牙周膜干细胞用PBS冲洗2遍后经0.25%胰蛋白酶消化为细胞悬液，加入2 mL含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化，在T75培养瓶中加入9 mL含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基和1 mL细胞悬液，轻轻振荡，使细胞均匀铺满瓶底，于CO2培养箱内培养72 h，倒置显微镜下观察细胞生长状态。
1.4.3 牙周膜干细胞表面标志物检测 将第3代牙周膜干细胞用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化，用预冷的PBS洗涤3次，调整细胞浓度为1.5×109 L-1，将细胞分为5组，每组细胞悬液200 μL，在避光条件下分别加入5 μL细胞表面标志物抗体(间充质干细胞表面标志分子CD45、CD73、CD90、CD105及IgGK对照)，移液枪吹打混匀后放置于4 ℃冰箱避光孵育45 min；静置结束后，用预冷PBS洗涤2次，离心去上清，加入200 μL预冷的PBS制成悬液，立即上流式细胞仪检测。
1.4.4 牙周膜干细胞成骨分化能力检测 取第3代牙周膜干细胞，以3×105/孔接种至6孔板内，待细胞长到60%-70%时加入成骨诱导液(10 mmol/L β-甘油磷酸钠+100 μmol/L抗坏血酸+10 nmol/L 地塞米松+体积分数10%胎牛血清+1%双抗+α-MEM培养基)，每3 d换液1次，成骨诱导培养21 d时进行茜素红染色：弃上层培养液，PBS反复冲洗3次，每孔加入2 mL多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3遍，每孔加入
2 mL茜素红染液染色30 min，PBS冲洗多次，镜下观测钙结节的染色效果。
1.4.5 氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖活性的影响 将第3代牙周膜干细胞用PBS冲洗2遍后经0.25%胰蛋白酶消化为细胞悬液，以5×103个/孔的密度铺板至96孔板，用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养24 h使细胞贴壁，弃去旧培养液，分别加入含质量浓度为0，2.5，5，10 μg/mL氧化苦参碱的α-MEM培养基，培养1，3，5，7 d时，弃去旧液，每孔加入10 μL CCK8溶液和90 μL含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基，并设置空白对照组(含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基)，每组5个复孔，放入CO2培养箱孵育1-4 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度值。
1.4.6 氧化苦参碱对牙周膜干细胞干性标志物蛋白表达的影响 取第3代生长状态良好的牙周膜干细胞制备单细胞悬液，以3×105/孔接种于6孔板中，分为空白对照组和氧化苦参碱组，每组3个复孔，空白对照组加入含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基，氧化苦参碱组加入含2.5 μg/mL氧化苦参碱的α-MEM培养基。培养7 d后提取6孔板内细胞总蛋白，Western blot检测牙周膜干细胞中干细胞标志物蛋白SOX2和OCT4的表达。具体方法：向6孔板加入RIPA裂解液(含1%PMSF蛋白酶抑制剂)于冰上裂解，离心，采用BCA试剂盒检测上清液蛋白浓度，运用金属浴将蛋白变性，样本冷却后进行蛋白印迹检测。配8%SDS-PAGE凝胶，电泳后转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，孵育一抗SOX(稀释比例：1∶700)、OCT4抗体(稀释比例：1∶2 000)于4 ℃冰箱过夜，TBST洗膜4次，每次15 min，加入二抗辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG二抗(稀释比例：1∶20 000)孵育1 h，TBST清洗4次，每次15 min，加ECL化学发光液，曝光图片，以β-actin(稀释比例：1∶5 000)为内参，采用Image J软件进行条带灰度值分析，结果以目的条带灰度值/内参条带灰度值表示。

1.4.7 氧化苦参碱对牙周膜干细胞成骨基因表达的影响 取生长对数期的第3代牙周膜干细胞以1×106/孔接种于12孔板中，共分为3组，空白对照组加入含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基，成骨诱导组加入成骨诱导液，氧化苦参碱+成骨诱导组加入含2.5 μg/mL氧化苦参碱的成骨诱导液，每隔2 d换液1次，培养7 d后，用Trizol试剂提取牙周膜干细胞内总RNA，用反转录试剂盒反转成cDNA，用qPCR试剂盒对cDNA扩增并检测荧光标记的目标基因RUNX2、ALP、WNT2、WNT16、BMP6、COMP的表达，引物见表1，由上海生工合成。通过2-(ΔCt)方法计算mRNA相对表达量。

1.4.8 氧化苦参碱对牙周膜干细胞成骨蛋白表达的影响 将第3代牙周膜干细胞按1.4.7分组方法处理7 d后，采用1.4.6的方法收集12孔板内的蛋白。配制8%SDS-PAGE凝胶，电泳后转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，孵育一抗ALP抗体(稀释比例：1∶1 000)于4 ℃冰箱过夜，TBST洗膜4次，每次15 min，加入二抗辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG(稀释比例：1∶20 000)孵育1 h，TBST清洗4次，每次15 min，加ECL化学发光液，曝光图片，以β-actin(稀释比例：1∶5 000)为内参，采用Image J软件进行条带灰度值分析，结果以目的条带灰度值/内参条带灰度值表示。
1.4.9 高通量测序预测氧化苦参碱影响牙周膜干细胞成骨分化可能的机制 取第3代牙周膜干细胞分为2组，成骨诱导组加入成骨诱导液，氧化苦参碱+成骨诱导组加入含2.5 μg/mL氧化苦参碱的成骨诱导液，每隔2 d换液1次，培养7 d后，用Trizol试剂提取牙周膜干细胞内总RNA，采用RNA测序技术分析两组牙周膜干细胞的基因表达谱。总RNA提取和测序工作由华大基因科技服务有限公司(中国武汉)完成。数据过滤、测序得到原始数据，后续使用Dr. Tom多组学数据挖掘系统(https://biosys.bgi.comopen in new window)进行数据分析、绘图及挖掘。
1.5 主要观察指标 ①牙周膜干细胞表面标志物的表达及成骨分化能力；②氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖活性的影响；③从蛋白水平检测氧化苦参碱对牙周膜干细胞干性标志物如SOX2、OCT4表达的影响；④成骨诱导后，qRT-PCR检测氧化苦参碱对RUNX2和ALP mRNA表达的影响，同时验证成骨蛋白ALP表达的改变；⑤利用高通量测序法筛选出有关多向分化方面表达差异显著的mRNA，结合qRT-PCR验证。

1.6 统计学分析 实验数据通过3次及以上独立重复实验得到，结果以x±s表示，通过GraphPad Prism 9.5软件进行统计分析，t检验用于两组样本数据的比较，方差分析用于多组样本数据的分析，P < 0.05为差异有显著性意义。数据统计方法均通过宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

牙周膜干细胞被认为是牙周再生十分有潜力的候选细胞，然而，间充质干细胞在长时间培养过程中易衰老和干性丧失，这是限制其大规模临床应用的重要原因之一。因此，在进入临床应用前，维持细胞干性具有十分重要的意义。有研究表明可通过缺氧、热休克、热量限制等手段预处理来提高间充质干细胞的自我更新、修复和干性潜能[26-27]。缺氧模拟剂氯化钴增强了人脱落乳牙干细胞干性标志物(OCT4、NANOG、SOX2、c-Myc)的表达[28]。天然植物化学物质人参皂苷Rg2可以促进猪间充质干细胞的增殖，抑制培养时间过长导致的复制性衰老，并维持了细胞的干性[29-30]。
氧化苦参碱是一种具有广泛药理活性的中药成分，它通过调节炎症、氧化应激、细胞凋亡和纤维化发挥对器官和组织的保护作用[31]。与此同时，多项研究显示氧化苦参碱对具有自我更新、多向分化潜能的细胞也有一定的作用。例如，氧化苦参碱可协同间充质干细胞治疗四氯化碳引起的肝纤维化[32]。SONG等[33]研究发现，结合氧化苦参碱的复合支架能促进神经干细胞分化为神经元，阻止其分化为星形胶质细胞。氧化苦参碱在体外能减轻醛固酮诱导的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，可以预防心肌的纤维化[34]。
陈凌等[35]使用0，1，10，25 μg/mL氧化苦参碱作用于脂多糖诱导的牙周膜干细胞，发现氧化苦参碱可以减轻脂多糖对牙周膜干细胞生物学功能的破坏作用，故该研究选择0，2.5，5，10 μg/mL作为实验的药物干预质量浓度。该研究首先设计了CCK8实验检测氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖能力的影响，结果显示2.5 μg/mL氧化苦参碱对细胞的增殖活性在第7天时有明显增强作用，故选择此质量浓度氧化苦参碱进行后续实验。研究氧化苦参碱对牙周膜干细胞干性标志物表达的影响，选用了SOX2和OCT4干性标志蛋白。SOX2在成体干细胞和胚胎干细胞中表达，并且在间充质细胞的增殖活性和多分化潜能中可能发挥重要作用[36]。OCT4是干细胞多能性的重要转录调控因子，与其他转录因子或调节因子相互协作来维持细胞干性潜能[37-38]。通过蛋白水平验证了氧化苦参碱刺激对牙周膜干细胞干性维持的影响，与空白对照组相比，氧化苦参碱组SOX2的表达无明显差异，而OCT4表达上调并具有统计学差异，说明该药物上调牙周膜干细胞的干性潜能。在增殖和骨向分化实验中，发现2.5 μg/mL氧化苦参碱提高了牙周膜干细胞的增殖活性，而抑制了牙周膜干细胞骨向分化能力，这与陈凌等[35]的研究结果不同，在该研究中，氧化苦参碱直接作用于正常牙周膜干细胞，可能与氧化苦参碱在病理状态下的组织或器官中发挥的药理作用有所不同。
然而，关于氧化苦参碱如何影响牙周膜干细胞成骨分化的作用机制目前尚不明确。由此结合高通量测序，通过基因水平寻找氧化苦参碱抑制牙周膜干细胞骨向分化能力的潜在机制。通过差异基因表达分析，筛选得到成骨诱导组和氧化苦参碱+成骨诱导组下调的前50个基因，结合国内外文献检索，从这50个基因中挑选出了有关间充质干细胞成骨分化相关的信号通路包括WNT2、WNT16、BMP6以及COMP，利用聚类热图发现这4个基因在成骨诱导组和氧化苦参碱+成骨诱导组差异表达。WNT2是frizzled家族7个跨膜受体的配体，在经典WNT信号通路中发挥功能，而WNT信号通路参与细胞的成骨分化。WNT2通过WNT信号通路调控间充质干细胞的成骨分化[22]。ZHU等[39]研究显示α-Klotho (KL)是一种在肾脏高表达的衰老抑制蛋白，通过结合WNT2来调节人肾间质成纤维细胞的成骨分化。该研究中，WNT2基因在氧化苦参碱+成骨诱导组明显降低。与此同时，测序基因发现氧化苦参碱+成骨诱导组WNT16表达明显下调。研究报道用敲除WNT16基因的斑马鱼作为研究模型，在镜下和micro CT下发现斑马鱼身体多个部位的骨密度和骨小梁减低[40]。在小鼠的骨膜衍生细胞中通过敲低和过表达WNT16基因，发现WNT16可以正向调控细胞成骨[41]。根据上述研究进一步表明氧化苦参碱抑制牙周膜干细胞成骨向分化受到经典WNT信号通路的调控。WNT信号通路和牙周膜干细胞成骨分化密切相关[42]。另外，氧化苦参碱+成骨诱导组成骨相关基因BMP6和COMP与成骨诱导组相比明显降低，BMP6属于转化生长因子β家族，在骨骼发育和骨稳态中起着十分重要的作用。根尖牙乳头干细胞通过敲低BMP的拮抗GREM1基因，可以促进细胞成骨分化，表明BMP在根尖牙乳头干细胞成骨分化中起着正向调控的作用[43]。携带BMP6的金属有机支架可以促进大鼠骨缺损的骨再生[44]。COMP是软骨细胞外非胶原类基质，有研究显示COMP可能是长链非编码RNA CASC2调节骨髓间充质干细胞晚期成骨的下游靶点[45]。综上，该研究作者试图通过检测分子基因WNT2、WNT16、COMP、BMP6来评估氧化苦参碱对牙周膜干细胞的影响，涉及WNT经典信号通路、转化生长因子β等通路，表明氧化苦参碱负向调控牙周膜干细胞成骨分化可能有多种通路共同参与，但需要进行更多的研究来支持这个假设。
该研究成功分离并培养出了具有间充质干性潜能的牙周膜干细胞，运用CCK8技术筛选氧化苦参碱作用于牙周膜干细胞的药物质量浓度；氧化苦参碱干预牙周膜干细胞后，发现干性标志物表达增强，而骨向分化能力明显减弱，表明氧化苦参碱具有维持牙周膜干细胞干性特征且负向调控其成骨的潜能，这为氧化苦参碱的临床应用提供参考，同时也为牙周膜干细胞保持干性阻挡细胞自发分化提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

氧化苦参碱对牙周膜干细胞干性标志物表达和成骨分化的作用

Effect of oxymatrine on expression of stem markers and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells

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