氧化铈纳米酶对大肠杆菌的抗菌性能

doi:10.12307/2024.485

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (22): 3496-3501.doi: 10.12307/2024.485

• 纳米生物材料 nanobiomaterials • 上一篇下一篇

氧化铈纳米酶对大肠杆菌的抗菌性能

郑黑姝1，2，张映娟1，2，韦艳华1，2，黄辉3，马翔宇1，2，廖红兵1，2

1广西医科大学口腔医学院/附属口腔医院，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021；3广西大学化学化工学院结构热力学与微纳化工实验室，广西壮族自治区南宁市 530004

收稿日期:2023-05-23 接受日期:2023-09-22 出版日期:2024-08-08 发布日期:2024-01-20
通讯作者: 廖红兵，教授，博士，博士生导师，广西医科大学口腔医学院/附属口腔医院，广西壮族自治区南宁市 530021；广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:郑黑姝，女，1998年生，汉族，广西壮族自治区桂林市人，广西医科大学在读硕士，主要从事纳米材料与口腔种植修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82160192，81860201)，项目负责人：廖红兵

Antibacterial performance of cerium oxide nanoenzyme against Escherichia coli

Zheng Heishu1, 2, Zhang Yingjuan1, 2, Wei Yanhua1, 2, Huang Hui3, Ma Xiangyu1, 2, Liao Hongbing1, 2

1College of Stomatology, Guangxi Medical University/Affiliated Stomatological Hospital, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Nanostructured Thermodynamics and Micro-nano Chemical Engineering Laboratory, College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-05-23 Accepted:2023-09-22 Online:2024-08-08 Published:2024-01-20
Contact: Liao Hongbing, Professor, MD, Doctoral supervisor, College of Stomatology, Guangxi Medical University/Affiliated Stomatological Hospital, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zheng Heishu, Master candidate, College of Stomatology, Guangxi Medical University/Affiliated Stomatological Hospital, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82160192, 81860201 (to LHB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

纳米酶：是一类具有类酶催化活性的纳米材料，兼具催化活性和纳米材料独特的理化性质，与天然酶相比具有成本低、制备简单、环境耐受性好、性能稳定、可按需设计和酶活性可调节等优势。
氧化铈：是应用最广泛的稀土金属氧化物之一，具有立方萤石型结构，其中Ce元素存在Ce3+与Ce4+的价态变化，具有良好的储存和释放氧的能力，常用作催化剂或催化剂的非惰性载体。

背景：由于细菌对抗生素耐药性的发展，多重耐药菌感染的增加已成为现代医疗保健中的主要问题，研发新的抗菌替代药物材料具有重要意义。

目的：合成一种CeO2纳米酶并进行一系列表征，研究其生物相容性以及对大肠杆菌的抗菌性能。
方法：采用水热法合成CeO2纳米酶，通过X射线衍射、X射线光电子能谱、傅里叶红外分析、拉曼光谱、扫描电镜、透射电镜等表征方法对其形貌、产物成分和化学组成进行分析，利用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)显色实验对CeO2纳米酶的过氧化物模拟酶活性进行表征。使用CCK-8法评价不同质量浓度(10，25，50 μg/mL)CeO2纳米酶对小鼠成纤维细胞L929的毒性作用。使用平板计数法评价CeO2纳米酶在不同条件下对大肠杆菌的抗菌性能，使用活性氧检测试剂盒检测不同条件处理后的细菌内活性氧水平变化。

结果与结论：①CeO2纳米酶的形貌为棒状，其中Ce3+占Ce3+和Ce4+总和的29.87%，平均晶粒尺寸为7.4 nm；在pH=5.5、含底物TMB的微酸性环境下，CeO2纳米酶和H2O2混合后表现出优异的过氧化物酶活性，但在pH=7.4的情况下未表现出过氧化物酶模拟活性。②不同质量浓度的CeO2纳米酶对小鼠成纤维细胞L929均无明显的细胞毒性。③在pH=5.5的微酸性环境中，单独存在CeO2纳米酶(10 μg/mL)时，大肠杆菌受到一定程度的抑制，CFU结果下降约0.5个log(P < 0.01)；在含H2O2(50 μmol/L)的微酸性环境中，CeO2纳米酶对大肠杆菌表现出优异的抗菌效果，CFU结果下降约1.5个log(P < 0.001)。当CeO2纳米酶单独存在时，大肠杆菌中活性氧水平升高(P < 0.05)；当CeO2纳米酶与H2O2共同存在时，大肠杆菌中活性氧水平显著升高(P < 0.001)。④结果表明，CeO2纳米酶具有良好的生物相容性与一定的抗菌能力，可在含低浓度H2O2的微酸性环境下表现出过氧化物酶活性，产生活性氧杀灭细菌，进而表现出更优异的抗菌效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 氧化铈, 纳米酶, 纳米材料, 抗菌性能, 生物相容性, 大肠杆菌

Abstract: BACKGROUND: The increase in multi-drug resistant bacterial infections has become a major problem in modern healthcare due to the development of bacterial resistance to antibiotics and the development of new antibacterial alternative drug materials is of great importance.
OBJECTIVE: To synthesize and perform a series of characterization of a CeO2 nanoenzyme to investigate its biocompatibility and antibacterial properties against Escherichia coli.
METHODS: CeO2 nanoenzymes were synthesized using a hydrothermal method. The morphology, product composition, and chemical composition were analyzed using characterization methods such as X-ray diffraction, X-ray photoelectron spectroscopy, Fourier infrared analysis, Raman spectroscopy, scanning electron microscopy, and transmission electron microscopy. The peroxide-mimetic enzyme activity of CeO2 nanoenzymes was characterized using TMB color development assay. The toxic effect of CeO2 nanoenzymes at different concentrations (10, 25, and 50 μg/mL) on mouse fibroblast L929 cells was evaluated using the CCK-8 assay. The antibacterial properties of CeO2 nanoenzymes against Escherichia coli under different conditions were evaluated using the plate coating method. Changes in intra-bacterial reactive oxygen species after treatment with different conditions were detected using a reactive oxygen species detection kit.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The morphology of the synthesized CeO2 nanoparticles was rod-shaped, with Ce3+ accounting for 29.87% of the total Ce3+/Ce4+ and an average grain size of 7.4 nm. In a slightly acidic environment containing TMB and pH=5.5, CeO2 nanoenzymes mixed with H2O2 showed excellent peroxidase activity, but did not show peroxidase simulated activity at pH=7.4. (2) There was no statistically significant difference in the toxic effects of CeO2 nanoparticles at various mass concentrations on mouse fibroblast L929 cells. (3) In a slightly acidic environment at pH 5.5, Escherichia coli was inhibited to a certain extent in the presence of CeO2 nanoenzyme alone at a concentration of 10 μg/mL, with a decrease in CFU results of about 0.5 log (P < 0.01); in a slightly acidic environment containing 50 μmol/L H2O2, CeO2 nanoenzyme showed excellent antibacterial effects against Escherichia coli, with a decrease in Escherichia coli CFU results of by about 1.5 log (P < 0.001). After CeO2 nanoenzymes interacted with Escherichia coli, the level of reactive oxygen species in Escherichia coli increased (P < 0.05); after CeO2 nanoenzymes interacted with Escherichia coli together with H2O2, the level of reactive oxygen species in Escherichia coli increased significantly (P < 0.001). (4) The results show that the CeO2 nanoenzymes have good biocompatibility, are inherently antibacterial, and can exhibit peroxidase activity in a slightly acidic environment containing low concentrations of H2O2, and generate reactive oxygen species to kill bacteria, thus showing excellent antibacterial effects.

Key words: cerium oxide, nanoenzyme, nanomaterial, antibacterial property, biocompatibility, Escherichia coli

中图分类号:

郑黑姝, 张映娟, 韦艳华, 黄辉, 马翔宇, 廖红兵. 氧化铈纳米酶对大肠杆菌的抗菌性能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3496-3501.

Zheng Heishu, Zhang Yingjuan, Wei Yanhua, Huang Hui, Ma Xiangyu, Liao Hongbing. Antibacterial performance of cerium oxide nanoenzyme against Escherichia coli[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(22): 3496-3501.

图/表（结果） 10

2.1 CeO2纳米酶的理化性质表征结果
X射线光电子能谱分析：分析了CeO2纳米酶的元素和化学价态。图1显示了CeO2纳米酶的Ce3d X射线光电子能谱图谱。根据计算公式得出，Ce3+在Ce3+和Ce4+中的比例为29.87%。CeO2纳米酶晶体表面上高浓度的Ce3+反映了表面存在高浓度的氧空位，有利于其催化性能的提高。

X射线衍射分析：检测CeO2纳米酶的晶体结构。图2显示出一系列可以分别归属于CeO2 (PDF# 43-1002)的特征衍射峰。在2θ=28.5o，33.1o，47.5o，56.3o，59.1o，69.4o，76.7o，79.1o和88.4o等附近的衍射峰分别对应CeO2的(111)(200)(220)(311)(222)(400)(331)(420)和(422)晶面。此外，样品中未观察到其他杂峰，说明得到了较纯净的CeO2。同时，使用Scherrer公式d=Kλ/(βcosθ)可以计算样品的平均晶粒尺寸，公式中d是平均晶粒尺寸， K是Scherrer常数(0.9)，λ是X射线波长(0.154 06 nm)，β是衍射峰主峰的半高宽，θ是衍射角。样品中最强衍射峰(2θ=28.513o)的半高宽为1.114o，计算出样品的平均晶粒尺寸为7.4 nm。

傅里叶变换红外光谱分析：CeO2纳米酶的傅里叶变换红外光谱图如图3所示。3 434 cm-1为O-H伸缩振动，可归因于物理吸附空气中的水分子所致，可证明样品有良好的亲水性；1 058 cm-1处可归因于Ce-OH表面基团的弯曲振动；1 554 cm-1和1 346 cm-1处为NO3反对称伸缩振动；850 cm-1处为NO3面外弯曲振动，可能为合成原料中的硝酸盐吸附在氧化物表面所致。

拉曼光谱分析：图4显示了CeO2纳米酶的拉曼光谱图谱。对于许多催化剂，尤其是Ce基催化剂，氧空位通常充当反应位点并影响其在氧化反应中的催化活性。270 cm-1处的信号峰与CeO2 纳米酶表面的Ce-OH物质有关，470 cm-1处的信号峰是萤石结构特征，归因于CeO2纳米酶中Ce4+(F2g)周围的O2?对称伸缩振动，与氧空位有关。约600 cm-1处的宽峰对应于缺陷诱导(D)模式的带，与Ce3+存在引起的氧空位相关。大量氧空位的存在可以增强CeO2的模拟酶活性。

扫描电镜与透射电镜观察：图5显示了CeO2纳米酶的扫描电镜和透射电镜图像，可以观察到CeO2纳米酶显示出粒径均匀的棒状结构，尺寸为纳米级。

过氧化物酶活性检测：图6显示了CeO2纳米酶在不同条件下的过氧化物酶模拟活性。单独存在H2O2时，吸收光谱未显示出吸收峰，表明底物TMB未被氧化；在pH=5.5、含底物TMB的微酸性环境下，CeO2纳米酶和H2O2混合后在652 nm处产生了吸收峰，表明TMB被表现出的过氧化物酶活性CeO2氧化生成了产物TMBox。但在pH=7.4的情况下未出现吸收峰，表明CeO2在此条件下未表现出过氧化物酶模拟活性。

2.2 CeO2纳米酶的生物相容性图7显示了CeO2纳米酶对L929细胞的毒性作用。当CeO2纳米酶质量浓度为10 μg/mL时，L929细胞活性显示出增强的效果，但与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；随着CeO2纳米酶质量浓度的升高，L929细胞活性显示出逐渐降低的趋势，但与对照组相比差异均无显著性意义(P > 0.05)，说明该CeO2纳米酶具有良好的生物相容性。

2.3 CeO2纳米酶的抗菌性能如图8，9所示，在pH=5.5的反应体系中，当单独存在低浓度H2O2时，大肠杆菌的CFU结果相比对照组而言几乎未受到抑制；当单独存在CeO2纳米酶时，大肠杆菌受到一定程度的抑制，CFU结果下降约0.5个log(P < 0.01)；当CeO2纳米酶与H2O2共同存在时，大肠杆菌CFU结果下降约1.5个log(P < 0.001)。结果表明，在微酸性环境下CeO2纳米酶本身具有一定的抗菌效果，在与低浓度H2O2混合后抗菌效果增强。

由于铈氧化物可以通过过氧化物酶模拟活性催化H2O2促使活性氧的产生，因此考虑到活性氧可能是抑制细菌生长的因素。应用DCFH检测大肠杆菌内活性氧变化后显示，单独存在CeO2纳米酶时，大肠杆菌中活性氧水平为缓冲液组的(120.6±4.0)%(P < 0.05)；CeO2纳米酶与H2O2共同存在时，大肠杆菌中活性氧水平上升到缓冲液组的(173.8±6.9)%(P < 0.001)，见图10。结果表明，CeO2纳米酶本身可一定程度上导致大肠杆菌氧化应激，与H2O2共同作用于大肠杆菌后可产生活性氧诱导细菌死亡。

参考文献

[1] HUEMER M, MAIRPADY SHAMBAT S, BRUGGER SD, et al. Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives. EMBO Rep. 2020;21(12):e51034.
[2] 杨启文,吴安华,胡必杰,等.临床重要耐药菌感染传播防控策略专家共识[J].中国感染控制杂志,2021,20(1):1-14.
[3] KHONG MJ, SNYDER AM, MAGNATERRA AK, et al. Antimicrobial resistance profile of Escherichia coli isolated from poultry litter. Poult Sci. 2022;102(1):102305.
[4] FURLAN JPR, RAMOS MS, ROSA RDS, et al. Occurrence and genetic characteristics of multidrug-resistant Escherichia coli isolates co-harboring antimicrobial resistance genes and metal tolerance genes in aquatic ecosystems. Int J Hyg Environ Health. 2022;244:114003.
[5] 杨小平,郦娟,虞伟明,等.肠出血性大肠埃希氏菌致病机制研究进展[J].食品安全质量检测学报,2023,14(11):140-146.
[6] MONTEIRO R, CHAFSEY I, CACCIA N, et al. Specific Proteomic Identification of Collagen-Binding Proteins in Escherichia coli O157:H7: Characterisation of OmpA as a Potent Vaccine Antigen. Cells. 2023;12(12):1634.
[7] MA W, ZHANG T, LI R, et al. Bienzymatic synergism of vanadium oxide nanodots to efficiently eradicate drug-resistant bacteria during wound healing in vivo. J Colloid Interface Sci. 2020;559:313-323.
[8] YOUGBARE S, MUTALIK C, OKORO G, et al. Emerging Trends in Nanomaterials for Antibacterial Applications. Int J Nanomedicine. 2021;16:5831-5867.
[9] ZHANG Y, MUHAMMAD F, WEI H. Inorganic Enzyme Mimics. Chembiochem. 2021; 22(9):1496-1498.
[10] 范克龙,高利增,魏辉,等.纳米酶[J].化学进展,2023,35(1):1-87.
[11] MA Y, TIAN Z, ZHAI W, et al. Insights on catalytic mechanism of CeO(2) as multiple nanozymes. Nano Res. 2022;15(12):10328-10342.
[12] ALIZADEH N, SALIMI A, SHAM TK, et al. Intrinsic Enzyme-like Activities of Cerium Oxide Nanocomposite and Its Application for Extracellular H2O2 Detection Using an Electrochemical Microfluidic Device. ACS Omega. 2020;5(21):11883-11894.
[13] NYOKA M, CHOONARA YE, KUMAR P, et al. Synthesis of Cerium Oxide Nanoparticles Using Various Methods: Implications for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 2020;10(2):242.
[14] ZHU Y, CHEN C, CHENG P, et al. Recent advances in hydrothermal synthesis of facet-controlled CeO(2)-based nanomaterials. Dalton Trans. 2022;51(17): 6506-6518.
[15] MA H, LIU Z, KOSHY P, et al. Density Functional Theory Investigation of the Biocatalytic Mechanisms of pH-Driven Biomimetic Behavior in CeO2. ACS Appl Mater Interfaces. 2022;14(9):11937-11949.
[16] MAI HX, SUN LD, ZHANG YW, et al. Shape-selective synthesis and oxygen storage behavior of ceria nanopolyhedra, nanorods, and nanocubes. J Phys Chem B. 2005;109(51):24380-24385.
[17] POOLMAN JT. Escherichia coli//QUAH SR. International Encyclopedia of Public Health (Second Edition). Oxford:Academic Press. 2017:585-593.
[18] GAMBUSHE SM, ZISHIRI OT, EL ZOWALATY ME. Review of Escherichia coli O157:H7 Prevalence, Pathogenicity, Heavy Metal and Antimicrobial Resistance, African Perspective. Infect Drug Resist. 2022;15:4645-4673.
[19] POKHAREL P, DHAKAL S, DOZOIS CM. The Diversity of Escherichia coli Pathotypes and Vaccination Strategies against This Versatile Bacterial Pathogen. Microorganisms. 2023;11(2):344.
[20] SABOURI S, SEPEHRIZADEH Z, AMIRPOUR-ROSTAMI S, et al. A minireview on the in vitro and in vivo experiments with anti-Escherichia coli O157:H7 phages as potential biocontrol and phage therapy agents. Int J Food Microbiol. 2017;243: 52-57.
[21] RAMSTAD SN, TAXT AM, NASEER U, et al. Effects of antimicrobials on Shiga toxin production in high-virulent Shiga toxin-producing Escherichia coli. Microb Pathog. 2021;152:104636.
[22] PUNO-SARMIENTO J, ANDERSON EM, PARK AJ, et al. Potentiation of Antibiotics by a Novel Antimicrobial Peptide against Shiga Toxin Producing E. coli O157:H7. Sci Rep. 2020;10(1):10029.
[23] 甘露,李耘,桥本重阳,等.大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制研究[J].中国临床药理学杂志,2020,36(18):2896-2900.
[24] CAO W, JIN M, YANG K, et al. Fenton/Fenton-like metal-based nanomaterials combine with oxidase for synergistic tumor therapy. J Nanobiotechnology. 2021; 19(1):325.
[25] 李锋,李雪,柏娜,等.氧化铈纳米颗粒促成骨分化及其对相关致病菌抗菌作用的研究进展 [J]. 吉林大学学报(医学版),2022,48(5):1348-1353.
[26] WEI X, LI X, FENG Y, et al. Morphology-and pH-dependent peroxidase mimetic activity of nanoceria. RSC Adv. 2018;8(21):11764-11770.
[27] SADIDI H, HOOSHMAND S, AHMADABADI A, et al. Cerium Oxide Nanoparticles (Nanoceria): Hopes in Soft Tissue Engineering. Molecules. 2020;25(19):4559.
[28] ZHANG M, ZHANG C, ZHAI X, et al. Antibacterial mechanism and activity of cerium oxide nanoparticles. Sci Chin Mater. 2019;62(11):1727-1739.
[29] MATUSSIN SN, HARUNSANI MH, KHAN MM. CeO2 and CeO2-based nanomaterials for photocatalytic, antioxidant and antimicrobial activities. J Rare Earths. 2023; 41(2):167-181.
[30] NADEEM M, KHAN R, AFRIDI K, et al. Green Synthesis of Cerium Oxide Nanoparticles (CeO(2) NPs) and Their Antimicrobial Applications: A Review. Int J Nanomedicine. 2020;15:5951-5961.
[31] JIA C, GUO Y, WU FG. Chemodynamic Therapy via Fenton and Fenton-Like Nanomaterials: Strategies and Recent Advances. Small. 2022;18(6):e2103868.
[32] LUO Q, LI Y, HUO X, et al. Stabilizing Ultrasmall Ceria-Cluster Nanozyme for Antibacterial and Antibiofouling Applications. Small. 2022;18(16):e2107401.
[33] 姚叔辰,朱雪琦,韩汀兰,等.银掺杂二氧化铈的制备及其抗菌性能探究[J].稀土信息,2021(10):24-29.

引言

由于抗生素的长期滥用，抗菌药物耐药病原菌已成为威胁人类健康的一项重大公共卫生问题[1-2]。大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)作为食源性致病菌之一常存在于动物和人类肠道中，能够在各种肠外环境中生存和适应，对环境中存在的多种抗生素表现出耐药并携带耐药基因[3-4]。O157:H7是典型的肠道致病性大肠杆菌之一，感染此类病原菌可导致出血性腹泻、菌血症、溶血性尿毒综合征等并发症，严重时可能导致死亡[5]。大肠杆菌O157:H7感染具有高发病率和病死率，且抗生素治疗会加剧病情，迄今为止仍缺乏有效的防治方法[6]。H2O2是一种广泛使用的抗菌剂，但高剂量的H2O2可能引起皮肤和黏膜刺激性灼伤、阻碍伤口愈合等问题[7]。因此，需要一种简单且成本低的方法开发高效低毒抗菌剂。
纳米材料具有传统抗菌材料不具备的独特物理化学性质，它们能够通过损伤细菌细胞膜、破坏营养物质运输等非特异性的抗菌机制克服传统药物容易产生细菌耐药性的缺陷，被视为抗生素的可行替代品[8]。迄今为止，已经开发出许多抗菌纳米材料用于治疗细菌感染。纳米酶是一类纳米材料，由于其低成本和高稳定性备受关注，被认为是各种生物和化学应用中天然酶的可能替代品[9-10]。纳米酶具有类似酶的内在活性，可以催化H2O2转化为破坏蛋白质、脂质和DNA的高氧化毒性活性氧，如羟基自由基(·OH)，因此在H2O2相对较低的浓度下也可以产生显著抗菌效果[11]。
氧化铈(CeO2)纳米粒子由于其潜在的纳米酶活性及抗菌性能受到特别关注。由于Ce3+与Ce4+之间的氧化还原循环，许多基于CeO2的纳米材料被发现具有过氧化物酶或其他酶模拟活性[12]。CeO2纳米粒子的合成方法包括水热法、溶剂热法、共沉淀法、溶胶-凝胶法、溶液燃烧法和声化学法等[13]，其中水热法由于简单经济、无添加剂、纳米形貌可控等优点，在纳米粒子合成中得到广泛应用[14]。
研究表明CeO2纳米粒子在生物医学中表现出pH依赖性，在基本生理 pH值下表现出超氧化物歧化酶和过氧化氢酶模拟活性，可清除活性氧并表现出有益的抗氧化活性；但在炎症导致的微酸性pH值下，则表现出过氧化物酶模拟活性，发生类芬顿反应，产生可杀死细菌的·OH[15]。基于CeO2纳米粒子的pH值依赖性，此次实验拟通过水热法合成一种CeO2纳米酶，表征其理化性质，探究CeO2纳米酶在不同条件下的过氧化物酶活性，并对其生物相容性及体外抗菌性能进行评价，以期为抗菌治疗提供新的思路和参考依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备及表征，体外抗菌实验，体外细胞学实验，组间比较进行单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年3月至2023年4月在广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室及广西大学化学化工学院结构热力学与微纳化工实验室完成。
1.3 材料硝酸铈六水合物、氢氧化钠、无水乙醇、一水柠檬酸、十二水合磷酸氢二钠、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(中国阿拉丁公司)；小鼠成纤维细胞L929(美国ATCC公司)；大肠杆菌(E.coli，O157:H7，广西医科大学基础医学院崔兰玉课题组赠送)；高糖DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；CCK-8试剂盒(美国MCE公司)；PBS(美国Gibco公司)；体积分数3%H2O2溶液(美国Sigma公司)；活性氧检测试剂盒(中国Biosharp公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；X射线衍射仪(德国BRUKER公司)；扫描电子显微镜(德国Zeiss公司)；透射电子显微镜(日本Hitachi公司)；X射线光电子能谱分析仪、傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；拉曼光谱仪(英国雷尼绍公司)；pH计(美国Mettler Toledo公司)；紫外-可见光分光光度计(上海元析公司)；Infinite F50酶标仪(美国Tecan公司)。
1.4 方法
1.4.1 CeO2纳米酶的制备采用高温水热法合成CeO2纳米酶[16]。将0.868 g Ce(NO3)3·6H2O和12.6 g NaOH分别溶于5 mL和35 mL去离子水中，混合搅拌30 min后形成乳状悬浊液。将所得悬浊液转移至200 mL含聚四氟乙烯内胆的高压水热反应釜中，在100 ℃下水热处理24 h。通过离心分离出新鲜的沉淀物，用去离子水和无水乙醇分别反复洗涤3次，直至清液pH值达到中性。在60 ℃干燥箱中烘干24 h，充分研磨后，得到黄色粉末状的CeO2纳米酶。
1.4.2 CeO2纳米酶理化性质的表征
X射线粉末衍射分析：取适量已经研磨充分的CeO2纳米酶，置于玻璃片中心的粗糙凹陷区域，压实抹平表面后放入X射线衍射仪的样品台卡口，对样品的晶体结构进行分析。仪器参数如下：Cu Ka射线 λ=0.154 nm，扫描速率10 (°)/min，测角精度≤0.02°，扫描范围2θ区间为10°-80°。
X射线光电子能谱分析：将粉末状CeO2纳米酶置于称量纸上，剪取导电胶粘足量的样品，轻敲均匀后装入密封的称量纸槽中待测。之后通过X射线光电子能谱仪对样品中元素的结合能进行测试，采用C 1s:284.6 eV 对金属元素的峰位进行校正。
傅里叶变换红外光谱分析：将少量的CeO2纳米酶粉末和KBr粉末进行均匀的研磨，比例约为1∶200，然后将混合粉末进行压片，置入傅里叶变换红外光谱仪中对样品中所含基团进行测试，测试范围为中红外区(4 000-400 cm-1)。
扫描电镜观察：先剪取导电胶带粘在样品台上，然后将彻底干燥后的CeO2纳米酶少量均匀地撒在导电胶上，随后用压缩空气吹去没有粘住的样品，放入扫描电镜中抽真空后观察。
透射电镜观察：将少量的CeO2纳米酶分散于无水乙醇中，待其在超声作用下分散均匀以后将其喷洒至由碳膜支撑的铜网上，等待乙醇蒸发后置于透射电镜中观察粒子形貌。
拉曼光谱分析：运用拉曼光谱仪在R.T.条件下对CeO2纳米酶表面氧空位进行表征，以532 nm氩离子激光器作为激发光源，进行普通扫点测试，测试范围为300-1 800 cm-1。
过氧化物酶活性测定：在H2O2存在的情况下，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)可被过氧化物酶氧化为蓝色底物，并在652 nm处显示出吸收峰。分别配置pH=5.5和7.4的Na2HPO4/柠檬酸缓冲液，将CeO2纳米酶溶于该缓冲液中并充分超声均匀，得到1 mg/mL的CeO2纳米酶胶体溶液。将20 μL CeO2纳米酶胶体溶液、10 μL H2O2溶液(0.8 mol/L)、20 μLTMB溶液(50 μmol/L)、1 950 μL Na2HPO4/柠檬酸缓冲液混合于24孔板中，设置不含CeO2纳米酶的混合样品为对照组，37 ℃孵育2 h，测定其652 nm处的吸光度值。
1.4.3 CeO2纳米酶的生物相容性采用CCK-8法测定CeO2纳米酶对L929细胞增殖的影响。将CeO2纳米酶置于紫外线灯下照射消毒12 h后，使用完全培养基(含体积分数 10%胎牛血清的DMEM培养基)分别配置质量浓度10，25，50 μg/mL的灭菌CeO2纳米酶胶体溶液，超声分散均匀。将传代至第2-3代的L929细胞悬液浓度稀释至5×107 L-1，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁。24 h后弃去原培养基，分别加入10，25，50 μg/mL的CeO2纳米酶胶体溶液100 μL，设置加入等体积完全培养基、不含CeO2纳米酶的孔为空白对照组。每组设置3个平行样。培养24 h后弃去原培养基，用PBS漂洗3次，每孔加入100 μL含体积分数10%CCK-8的培养基孵育2 h，使用酶标仪在450 nm 波长处测得吸光度值。
1.4.4 CeO2纳米酶的抗菌性能反应体系在pH=5.5的Na2HPO4/柠檬酸缓冲液中进行。取10 mg CeO2纳米酶置于10 mL缓冲液中，配置质量浓度为1 mg/mL的CeO2 纳米酶胶体液，超声10 min使其均匀分散。另配置25 mmol/L的H2O2溶液。提前1 d挑取单菌种的E.coli，置于胰酪大豆胨液体培养基(TSB)中37 ℃过夜培养，将菌液浓度稀释至108 CFU/mL，备用。
将菌悬液置于24孔板中，设置缓冲液组、缓冲液+H2O2组、缓冲液+CeO2组、缓冲液+H2O2+CeO2组。取各液体加入24孔板中，反应总体系为2 mL，其中菌悬液终浓度为105 CFU/mL，H2O2终浓度为50 μmol/L，CeO2纳米酶悬液终质量浓度为10 μg/mL，每组设置3个平行样。将24孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h后，菌液浓度稀释105倍，取100 μL接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)板上于37 ℃培养24 h，结果拍照记录。
抗菌机制：使用活性氧检测试剂盒中的2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为荧光探针，检测各组样品处理前后大肠杆菌体内活性氧水平。将上述分组的24孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h后，离心收集各组大肠杆菌，加入10 μmol/L的荧光探针，使大肠杆菌菌悬液浓度为106 CFU/mL，置于37 ℃培养箱中避光孵育30 min，通过酶标仪检测各组细菌荧光强弱，参数设置为488 nm激发波长，525 nm发射波长。
1.5 主要观察指标 CeO2纳米酶的生物相容性与抗菌性能。
1.6 统计学分析计量资料采用x±s表示，两组间连续变量采用独立t检验，3组以上的组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。应用 GraphPad Prism 9进行统计学分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。该文统计学方法已经由广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

大肠杆菌是医院和社区获得性细菌感染的最常见原因之一，可引起人类的尿路感染、肠道感染和全身感染[17]，其中O157:H7是常见引起腹泻的大肠杆菌血清型，具有极强的感染率、致病性和病死率，已被世界卫生组织归类为对人类健康构成最大威胁的细菌之一 [18-19]。由于某些抗生素杀伤大肠杆菌O157:H7后会导致志贺毒素的释放，因此临床上对使用抗生素治疗大肠杆菌O157:H7感染还存在争议[20]。有研究表明，某些抗生素治疗大肠杆菌O157:H7感染引起的疾病会增加溶血性尿毒综合征发生的风险[21-22]；此外，大肠杆菌O157:H7可通过细菌膜的外排泵将抗生素排出，从而导致药物对细菌的作用减弱[23]。大肠杆菌O157:H7可以通过质粒、整合子等可移动遗传元件的水平传播获得耐药基因，耐药性可通过这些可移动遗传元件在各种环境中发生转移，从而增强对抗生素的抵抗性。研发用于杀灭大肠杆菌的新型抗生素受到药物研发成本和复杂性的限制，而纳米酶易制备、低成本和高稳定性的优点在抗菌治疗中表现出了广阔的应用前景。
此次实验采用简便的水热法合成了一种CeO2纳米酶，使用X射线衍射分析了其纯度和平均粒径，约为7.4 nm。经X射线光电子能谱和拉曼光谱分析可知该纳米酶含有丰富的Ce3+和氧空位含量，扫描电镜和透射电镜显示其形貌为棒状。在pH=5.5、含低浓度H2O2的微酸性环境中，CeO2纳米酶表现出优异的过氧化物酶活性，在pH=7.4的模拟生理环境中则未表现过氧化物酶活性。一般来说在碱性条件下，纳米CeO2主要表现出模拟超氧化物歧化酶和过氧化氢酶模拟活性，可充当抗氧化剂，将对细胞有害的活性氧分解为H2O和O2[15]。而在酸性环境下，CeO2则倾向于发生类芬顿反应并表现出过氧化物酶模拟活性，在H2O2存在下产生破坏性的·OH[24]。纳米CeO2的过氧化物酶模拟特性源于Ce3+和Ce4+之间的氧化还原循环[25]，通常Ce3+和Ce4+之间的氧化还原循环越容易，纳米二氧化铈的过氧化物酶模拟活性就越强。WEI等[26]的研究比较了棒状和立方体状纳米CeO2的过氧化物酶活性，结果显示棒状纳米CeO2拥有更丰富的Ce3+和氧空位，从而表现出更高的过氧化物酶活性。此次实验合成的棒状CeO2纳米酶具有丰富的Ce3+和氧空位，从而表现出优异的过氧化物酶活性。
在模拟生理环境下的细胞培养基中，CeO2纳米酶表现出良好的生物相容性；在模拟炎症环境pH=5.5的细菌培养基中，CeO2纳米酶与H2O2混合后对E.coli表现出优异的抗菌效果。基于CeO2纳米酶过氧化物酶模拟活性分析和细菌中活性氧水平检测结果，CeO2纳米酶的抗菌机制可推测为：在酸性环境下催化H2O2产生了可攻击细菌核酸、蛋白质、多糖等生物分子的活性氧风暴，最终引起细菌的分解和杀灭。此外，单独存在CeO2纳米酶时，E.coli的活性也受到一定抑制，说明CeO2本身具有一定抗菌作用。CeO2本身的抗菌机制可能归因于影响细菌的氧化应激，Ce3+和Ce4+在细菌膜上可能发生可逆转化，生成活性氧杀灭细菌。此外有报道称，CeO2与细菌直接接触后会干扰细菌生长，且CeO2释放的铈离子可能与细菌膜上的-SH基团反应，改变细菌的电子流、阻碍营养物质的运输[27-28]。目前大多数观点认为影响CeO2抗菌效果的重要因素之一是氧空位和Ce3+的含量高低[29-31]，因此可通过调节CeO2纳米酶的Ce3+含量和氧空位活性位点提高其催化活性和抗菌效果。LUO等[32]在研究中合成了一种含有丰富Ce3+位点的CeO2，可在含H2O2的酸性环境中通过氧化还原反应产生次溴酸，从而杀灭耐药性细菌；此外，该研究还合成了一种异质接枝纳米酶，将0.8 nm的CeO2接枝在ZrO2底物上，表现出了更优异的氧化还原性能和更强的杀菌效果。无独有偶，姚叔辰等[33]将纳米银颗粒负载在CeO2上，当银的负载质量浓度为40 μg/mL时，CeO2-Ag复合材料对大肠杆菌产生了显著的抑制效果。由此可见，CeO2的氧化还原性能和抗菌性能可通过掺入杂原子粒子、调整暴露在晶体表面的晶面数量或减小粒径的方式来增强。
综上所述，此次研究制备的CeO2纳米酶成本低廉，具有丰富的Ce3+含量和氧空位，具有良好的生物相容性，本身具有一定的抗菌能力，并且可在含低浓度H2O2的微酸性环境下表现出过氧化物酶活性，从而表现出优异的抗菌效果，可为感染部位的抗菌治疗提供一种新的治疗思路。铈基纳米材料在抗菌领域有无限的潜力与前景，未来可通过对CeO2进行合成改进与表面改性进一步增加其Ce3+和氧空位的形成，从而实现更加有效的抗菌应用效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

氧化铈纳米酶对大肠杆菌的抗菌性能

Antibacterial performance of cerium oxide nanoenzyme against Escherichia coli

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 10

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	刘安宏, 蔡萌萌, 韩笑, 王战会. 医用镁合金元素选择的研究现状[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 777-782.
[2]	朱礼威, 王江玥, 白丁. 纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶在不同骨缺损环境中应用的价值[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 753-758.
[3]	陈明学, 牛建华, 林海燕, 吴刚, 万奔. 纳米晶仿生钙磷颗粒的理化性质及细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3502-3508.
[4]	唐子牛, 褚凤成, 吴康, 张林, 白艳洁, 林潇, 杨惠林, 周欢, 刘慧玲, 杨磊. 兼具显影与成骨功能多聚磷酸锶在磷酸钙骨水泥中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3539-3547.
[5]	王新冬, 梁承志, 张永先. 创面愈合中MXene纳米粒子的功能特性与临床应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(17): 2739-2746.
[6]	何唯, 周政, 吴玲玲, 王凯, 沐彩云. 艾灸与还原氧化石墨烯/二氧化铈纳米复合材料修复感染性创面[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2307-2314.
[7]	翟耘浩, 钱运. 碳纳米材料在周围神经再生领域的研究与应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2423-2429.
[8]	张滨婧, 王剑. 铈及铈基材料在口腔疾病领域中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2445-2451.
[9]	吕尚毅, 何惠宇, 吾凡别克·巴合提, 杨泉, 马丽莎, 韩祥祯. 氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层材料的理化性质及生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(10): 1477-1483.
[10]	于德浩, 宁凤婷, 杜易朗, 王业元, 白冰. 微弧氧化对金属植入物抗菌和抗炎能力的调节效应[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(10): 1613-1619.
[11]	徐星星, 文超举, 孟茂花, 王勤英, 陈镜桥, 董强. 口腔种植中的碳纳米材料[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1062-1070.
[12]	薛婷, 张新日, 孔晓梅. 纳米材料多模态显像示踪技术在间充质干细胞治疗尘肺中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1133-1140.
[13]	田沁玉, 田兴贵, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 鲁晓波, 郭全义. 四氧化三锰纳米颗粒抗氧化损伤保护骨髓间充质干细胞的伸展功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 821-826.
[14]	周杰, 叶鹏, 张天喜, 李兴屿, 李沙沙, 喻安永, 邓江. 载神经生长因子软骨及软骨下骨双层仿生支架修复兔软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5421-5429.
[15]	颜南, 吴宣京, 王子琪, 伍静, 赵彤彤, 薛妍, 赵伟洁, 王丽杰, 武子媚, 张文清, 李静. 手性介孔二氧化硅纳米粒的合成及在载药递药中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4890-4895.