电针干预大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注模型丝裂原活化蛋白激酶通路的变化

doi:10.12307/2022.037

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (2): 225-231.doi: 10.12307/2022.037

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

电针干预大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注模型丝裂原活化蛋白激酶通路的变化

赖涵1，王娇1，董苗苗1，罗梦1，王文豪1，周国平1，2

1南方医科大学中西医结合医院，广东省广州市 510315；2南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515

收稿日期:2020-09-17 修回日期:2020-09-17 接受日期:2020-10-30 出版日期:2022-01-18 发布日期:2021-10-27
通讯作者: 周国平，主任医师，博士生导师，南方医科大学中西医结合医院，广东省广州市 510315；南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515
作者简介:赖涵，女，1994年生，南方医科大学在读硕士，主要从事中风病的机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81674048)，项目负责人：周国平

Electroacupuncture intervenes with changes of mitogen-activated protein kinase pathway in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion due to middle cerebral artery occlusion

Lai Han1, Wang Jiao1, Dong Miaomiao1, Luo Meng1, Wang Wenhao1, Zhou Guoping1, 2

1Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510315, Guangdong Province, China; 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2020-09-17 Revised:2020-09-17 Accepted:2020-10-30 Online:2022-01-18 Published:2021-10-27
Contact: Zhou Guoping, Chief physician, Doctoral supervisor, Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510315, Guangdong Province, China; School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong province, China
About author:Lai Han, Master candidate, Hospital of Integrated Tranditonal Chinese Medicine and Western Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510315, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81674048 (to ZGP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen acti-vatedprotrinkinase，MAPK)家族：MAPK在神经细胞的生长和增殖中起作用，MAPK信号通路在神经系统中广泛表达，并调节脑缺血再灌注损伤后神经细胞的修复或凋亡。MAPK的3个主要亚家族；细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38激酶参与调节脑缺血再灌注损伤后神经元细胞的功能障碍。
脑缺血再灌注损伤：脑缺血再灌注会导致炎症、氧化损伤和程序性细胞死亡，从而加剧脑组织损伤并严重影响中风患者的日常生活，当脑缺血再灌注发生时，MAPK家族开始发生调控作用。
背景：既往电针对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用及时效性的机制研究较少。
目的：观察不同时间电针对脑缺血再灌注大鼠MAPK家族3条信号通路中p-ERK、p-JNK及p-p38MAPK蛋白表达的影响，探索电针发挥脑保护作用的具体机制。
方法：150只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组(后2组线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞缺血模型)，每组50只，每组再设脑缺血1.5 h后再灌注2 h、6 h、1 d、3 d、7 d共5个时间亚组，每亚组10只。电针各亚组在规定时间点行单次电针治疗，选取“合谷”“尺泽”“足三里”“三阴交”，予疏密波，频率2 Hz，强度1 mA，治疗20 min；电针的同一时间抓取模型组和假手术组的大鼠进行固定，但不进行电针干预。在相应时间点进行神经功能缺损评分，之后大鼠麻醉后取脑，TTC染色法观察脑梗死面积，免疫荧光双标法结合检测p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK的表达。
结果与结论：①与假手术组相比，模型组同时段各亚组神经功能缺损评分升高、脑梗死体积增大(P < 0.05)；与模型组相比，电针组再灌注6 h、1 d、3 d亚组神经功能缺损评分显著降低、脑梗死体积明显减少(P < 0.05)；②与模型组比较，电针组再灌注1，3 d出现p-ERK表达的明显上调(P < 0.05)及p-JNK的表达显著下降(P < 0.05)，p-p38MAPK在再灌注6 h、3 d时下降明显再灌注；③结果说明电针可减少脑梗死体积，减轻神经功能缺损，并上调p-ERK同时下调p-JNK、p-p38MAPK的表达，且电针在再灌注6 h-3 d内效果最佳；电针促进缺血再灌注引起的脑组织损伤修复，通过调控MAPK家族信号通路发挥脑保护作用。

https://orcid.org/0000-0002-4613-4384 (周国平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 电针, 脑缺血再灌注, MAPK通路, 脑梗死, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: The mechanisms underlying the protection of electroacupuncture against cerebral ischemia/reperfusion injury in rats and its temporal efficacy have been less studied in the past.
OBJECTIVE: To observe the effect of electroacupuncture on the expression of p-ERK, p-JNK and p-p38MAPK proteins in three signaling pathways of the MAPK family in rats with cerebral ischemia/reperfusion at different times, and to explore the specific mechanism underlying the cerebral protection of electroacupuncture.
METHODS: 150 Sprague-Dawley male rats were randomly divided into sham-operated group, model group, and electroacupuncture group, with 50 rats in each group. Each group was then set up for ischemia 1.5 hours followed by reperfusion for 2 hours, 6 hours, 1 day, 3 days, and 7 days, with 10 rats in each subgroup. Single electroacupuncture treatment at Hegu, Shakuze, Zusanli, and Sanyinjiao was conducted at the given time, giving sparse waves at a frequency of 2 Hz, intensity of 1 mA, 20 minutes for one session. Rats in the model and sham-operated groups were grasped simultaneously for fixation at the same time of electroacupuncture, but no electroacupuncture intervention was performed. After anesthesia, the brains were decapitated at the corresponding time points, and neurological deficit scoring was used to observe the infarct area by TTC staining. The expression of p-ERK, p-JNK, and p-p38MAPK was detected by double immunofluorescence labeling method.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham-operated group, the model group had higher neurological deficit scores and larger infarct size in each subgroup in the same period (P < 0.05). Compared with the model group, there were significantly lower neurobehavioral scores and smaller infarct size in the electroacupuncture subgroups of 6 hours, 1 day and 3 days (P < 0.05). Compared with the model group, the electroacupuncture group had significant up-regulation of p-ERK expression at 1 and 3 days of reperfusion (P < 0.05), downregulation of p-JNK expression at 1 and 3 days of reperfusion (P < 0.05), and significant downregulation of p-p38MAPK expression at 6 hours and 3 days of reperfusion (P < 0.05). To conclude, electroacupuncture can reduce infarct size, alleviate neurological deficits, up-regulate p-ERK expression and down-regulate the expression of p-JNK and p-p38MAPK at the same time. The best effect of electroacupuncture is within 6 hours-3 days. Electroacupuncture promotes the repair of brain tissue damage caused by cerebral ischemia/reperfusion and exerts cerebral protection through the regulation of MAPK family signaling pathway.

Key words: electroacupuncture, cerebral ischemia/reperfusion, MAPK signaling pathway, cerebral infarction, rat

中图分类号:

赖涵, 王娇, 董苗苗, 罗梦, 王文豪, 周国平. 电针干预大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注模型丝裂原活化蛋白激酶通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 225-231.

Lai Han, Wang Jiao, Dong Miaomiao, Luo Meng, Wang Wenhao, Zhou Guoping. Electroacupuncture intervenes with changes of mitogen-activated protein kinase pathway in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion due to middle cerebral artery occlusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(2): 225-231.

图/表（结果） 17

2.1 实验动物数量分析选用150只SD大鼠，实验过程中若有大鼠死亡，及时补充大鼠造模及干预，最终进入分析大鼠数量为150只。
2.2 各组及不同时间点大鼠神经功能缺损评分的比较从各组来看，电针组大鼠神经功能缺损评分在再灌注6 h、1 d、 3 d、7 d时明显低于模型组(P < 0.05)；从不同时间点来看，模型组各亚组间差异无显著性意义(P > 0.05)，而电针组各亚组间差异有显著性意义(P < 0.05)。见表1、图1。

2.3 各组及不同时间点大鼠梗死脑组织百分比的比较模型组和电针组大鼠脑组织在不同时间段出现不同程度的梗死灶。与模型组比较，电针组6 h、1 d、3 d、7 d亚组脑梗体积显著减少(P < 0.05)，见表2，图2，3。

2.4 各组大鼠海马CA1区p-ERK、p-p38MAPK、p-JNK累积吸光度值的比较
2.4.1 p-ERK及p-p38MAPK双染结果的比较假手术组中各时间亚组p-ERK、p38MAPK均有少量表达，组间表达水平比较无差异(P > 0.05)。模型组、电针组与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。模型组p-ERK、p-p38MAPK两种指标在脑缺血再灌注2 h时表达均有升高趋势，p-ERK在6 h迅速到达峰值后逐渐回落；p-p38MAPK在3 d时达高峰(P < 0.05)。与模型组比较，脑缺血再灌注2 h时，电针组即出现p-ERK表达的上调(P < 0.05)，1，3 d时间亚组上调明显，差异显著(P < 0.05)；电针组p-p38MAPK表达水平与模型组相比较均有所下降，在6 h、3 d时间亚组较明显(P < 0.05)。见表3及图4，5。

激光共聚焦显微镜下海马CA1区p-ERK、p-p38MAPK的累积吸光度值变化：从图6可见假手术组同一张切片同时间点同个区域绿光和红光即p-ERK和p-p38MAPK表达均不明显，模型组同张切片可见p-ERK的累积吸光强度(红光)较弱，p-p38MAPK的累积吸光强度(绿光)较强，即模型组中海马区p-ERK低表达，p-p38MAPK高表达；而电针组同张切片见海马区p-ERK的累积吸光强度(红光)较模型组稍强，p-p38MAPK的累积吸光强度(绿光)较模型组较弱。

2.4.2 p-JNK及p-p38MAPK双染结果的比较 p-JNK在假手术组大鼠脑组织中亦可见少量表达，但各时间亚组间差异无统计学意义(P > 0.05)。与假手术组比较，模型组和电针组p-JNK、p-p38MAPK阳性表达均有所升高(P < 0.05)，p-JNK、p-p38MAPK约1 d时达到峰值后出现回落。电针组各亚组间p-JNK、p-p38MAPK的表达水平较模型组均有所下降(P < 0.05)；1 d、3 d亚组下降明显(P < 0.01)。见表4及图7，8。

激光共聚焦显微镜下海马CA1区p-JNK、p-p38MAPK的累积吸光度值变化：从图9可见假手术组同一张切片同时间点同个区域绿光和红光即p-JNK和p-p38MAPK表达均不明显，模型组同张切片可见p-JNK的累积吸光强度(红光)较强，p-p38MAPK的累积吸光强度(绿光)较强，即模型组中海马区p-JNK低表达，p-p38MAPK高表达；而电针组同张切片见海马区p-JNK的累积吸光强度(红光)较模型组稍弱，p-p38MAPK的累积吸光强度(绿光)较模型组较弱。

2.4.3 p-JNK及p-ERK双染结果的比较假手术组各时间亚组p-ERK、p-JNK均有少量表达，各时间亚组间表达水平无统计学差异(P > 0.05)。模型组、电针组与假手术组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。模型组p-ERK在2 h出现上调，在6 h迅速到达峰值后逐渐回落；p-JNK约在1 d时表达量达高峰后呈下降趋势。与模型组比较，脑缺血再灌注2 h时电针组即出现p-ERK表达的上调(P < 0.05)以及p-JNK表达的下调(P < 0.05)，其中1 d、3 d时间亚组p-ERK上调明显(P < 0.05)，而p-JNK的下调1 d、3 d亚组更显著(P < 0.05)。见表5，图10， 11。

激光共聚焦显微镜下海马CA1区p-JNK、p-ERK的累积吸光度值变化：从图12可见假手术组同一张切片同时间点同个区域绿光和红光即p-JNK和p-ERK表达均不明显，模型组同张切片可见p-JNK的累积吸光强度(绿光)较强，p-ERK的累积吸光强度(红光)较弱，即模型组中海马区p-JNK高表达，p-ERK低表达；而电针组同张切片见海马区p-JNK的累积吸光强度(绿光)较模型组稍弱，p-ERK的累积吸光强度(红光)较模型组较强。

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引言

脑缺血再灌注损伤是指脑血流的突然中断导致不可逆的损害，而经过一段时间的缺血后，大脑的血液供应逐渐恢复，但是大量的神经细胞未能及时恢复正常功能，导致更严重的神经损伤[1]。虽然现已确立了药物溶栓与手术介入的有效性，但这些治疗有严格的时间窗限制，且极易造成脑缺血再灌注损伤的发生[2]。临床报道和实验研究已证实，电针对缺血性脑卒中具有独特疗效，具有减少脑缺血再灌注后脑梗死的面积、减轻炎症反应、改善神经功能损伤及减少神经凋亡等作用[3-4]。课题组前期通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法研究电针对脑缺血再灌注损伤大鼠细胞凋亡的影响，结果显示再灌注后TUNEL免疫反应性细胞的数量显着增加，电针干预后凋亡细胞明显减少，提示电针干预能够减少细胞凋亡[5]。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen acti-vatedprotrinkinase，MAPK)信号转导通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，在细胞凋亡的信号传导方面起着关键性的作用，参与脑缺血再灌注时神经细胞的损伤或修复[6]。作者推测电针干预脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡可能与MAPK家族信号通路有关。
有学者发现在脑缺血再灌注后12-24 h给予电针干预能发挥脑保护作用[7]，但亦有研究表明电针在缺血超早期3 h介入能较好地挽救缺血脑组织[8]。由于不同时间点电针处理对脑保护效应的差异及其具体机制尚未明确，此次研究拟初步明确电针处理保护脑缺血再灌注损伤的最佳时间窗，并从MAPK家族通路探讨其可能机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2018年6月至2019年5月在南方医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠150只，体质量260-320 g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号 SCXK(粤)2011-0015。大鼠饲喂以标准育成饲料，自由饮水。动物于实验前适应环境1周，控制室温20-22 ℃，相对湿度65%-70%。实验前大鼠在安静环境下饲养24 h以上，术前禁食12 h，不禁水。实验动物条件符合《国务院关于修改和废止部分行政法规的决定》第3次修正的《实验动物管理条例》要求，且实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。该实验经南方医科大学实验动物伦理委员会批准。
1.3.2 主要试剂及仪器 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC，北京索莱宝科技有限公司)，Zoletil 50麻醉剂(Virbac，法国)，40 g/L多聚甲醛、PBS缓冲液、EDTA(pH 8.0)抗原修复液及抗荧光淬灭封片剂(Servicebio)，一抗：P-JNK(抗大鼠，1∶100)、P-ERK(抗兔，1∶100)、P-P38(抗兔，1∶100)，二抗(CY3山羊抗大鼠GB21302 1∶100、FITC山羊抗兔GB22303 1∶100、AP山羊抗兔GB24303 1∶100)。
英迪牌kwd-808i脉冲针灸治疗仪(苏州天协针灸器械有限公司)，华佗牌针灸针(苏州天协针灸器械有限公司)，冰冻切片机(Thermo)，GZX-90238电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)，脱色摇床(Servicebio)，倒置荧光显微镜(日本尼康)，激光共聚焦扫描显微镜(德国ZEISS)，徕卡图像分析系统(徕卡显微系统有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 分组方法 SD大鼠150只按照随机数字表法分为假手术组、模型组、电针组，每组50只，各组按照各时间点又分为2 h、6 h、1 d、3 d、7 d共5个时间亚组，每亚组10只。
1.4.2 造模方法根据Zea Longa线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞缺血(MCAO)大鼠模型[9]。大鼠以Zoletil 50(50 mL/kg)肌肉注射麻醉，于颈正中线右侧切口，结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，于颈内、外动脉分叉下方约5 mm处剪一V型切口，将尼龙线栓(长4 cm，直径0.25 mm)从切口处插入，置于颈内动脉17-18 mm，到有轻微阻力感为止，结扎颈内和颈总动脉远心端以固定线栓，逐层消毒缝合皮肤。大鼠缺血1.5 h后，拔出线栓使血液再灌注2 h、6 h、1 d、3 d、7 d。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分支，不闭塞大脑中动脉，其他操作相同。术中、术后室温严格控制在24-25 ℃，大鼠体温维持在36.5-37.5 ℃。

1.4.3 电针方法腧穴定位参考《实验针灸学》，合谷：前肢第一、第二掌骨之间，直刺1 mm；尺泽：屈肘位于横纹外侧的凹陷处，直刺3 mm；足三里：膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处，直刺7 mm；三阴交：后肢内踝尖直上10 mm，直刺5 mm。Zoletil 50(50 mg/kg)肌肉注射麻醉大鼠后，用0.35 mm×25 mm一次性无菌针灸针进行针刺，接通电针仪，疏密波，频率2 Hz/15 Hz，电流强度1 mA，电针组在缺血1.5 h后再灌注2 h、6 h、1 d、3 d、7 d 5个时间点进行针刺干预，20 min一次，每个亚组在对应时间点只作一次治疗。在电针的同一时间同时抓取模型组和假手术组大鼠进行固定，但不进行电针干预。
1.5 主要观察指标
1.5.1 神经功能缺损评分在再灌注2 h、6 h、1 d、3 d、7 d后以及电针治疗后，参照Zea Longa 5分评定法对所有大鼠进行神经功能缺损评分：0分为神经功能无障碍；1分为提尾时向对侧前肢屈曲；2分为不能直行，大鼠向左侧旋转；3分为行走困难，行走时向对侧倾倒；4分为严重意识障碍，无自发活动或意识不清。神经功能缺损评分在1-3分的大鼠为造模成功，纳入下一步实验，评分为0或4分的大鼠予以剔除。
1.5.2 TTC染色法计算脑梗死体积各组大鼠进行神经功能缺损评分后，每组随机选取6只，经肌肉注射Zoletil 50 (50 mL/kg)麻醉，取大脑冷冻切片，后置于0.2%的TTC染色液中，37 ℃避光孵育30 min，后置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定过夜，取出切片拍照。采用徕卡图像信号采集与分析系统计算分析梗死体积，梗死体积百分比=梗死体积/正常脑组织体积×100%。
1.5.3 免疫荧光双染检测p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK 各组大鼠进行神经功能缺损评分后，每组随机选取6只，经麻醉后取脑，冰冻切片固定，抗原修复，分别滴加相对应的一抗、二抗，后用抗荧光淬灭封片剂封固，在连续3张切片上，对p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK分别两两进行标记，在激光共聚焦扫描显微镜下观察，计算机数据采集，数字成像及拍片。用Image pro-plus 6.0软件分析照片中p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK的累积吸光度值，累积吸光度值=免疫荧光图像中的阳性面积×光学密度，累积吸光度值越高表明p-ERK、p-JNK或p-p38的表达越高。
1.6 统计学分析采用R语言进行数据整理及制图，用SPSS 20.0统计软件包进行数据处理。数据均采用x±s形式表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)、进一步两两比较采用LSD检验。当P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

脑缺血再灌注损伤后的病理生理机制十分复杂，例如炎症反应、缺血缺氧、神经细胞凋亡等，导致脑损伤以及各种功能障碍，再灌注将引起进一步的脑损伤[10]。此次研究通过大脑中动脉闭塞构建脑缺血再灌注损伤大鼠模型，神经行为学评分及TTC染色结果均已提示造模成功，实验中观察到的神经功能缺损症状表明脑缺血再灌注损伤后存在神经功能障碍和脑损伤。电针组6 h、1 d、3 d、7 d亚组的神经功能缺损评分明显低于模型组，神经功能缺损评分是评估脑缺血再灌注损伤的重要指标[11]，提示电针干预能够有效改善脑缺血再灌注损伤后引起的症状并促进了神经恢复。其他研究也表明，电针可以提供针对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用从而改善脑损伤后功能障碍[12-13]。
电针对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用的潜在机制可能与MAPK家族的调节有关。MAPK家族在介导脑缺血再灌注损伤中发挥着关键作用，通过介导与细胞凋亡有关的信号通路调节神经细胞死亡和生存[14-15]，该家族主要包括ERK通路、JNK通路和P38MAPK通路。海马、纹状体和皮质神经元对局部缺血和缺氧最敏感[16]，此次实验采取免疫荧光双染法，对p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK进行标记，观察海马CA1区的蛋白变化。脑缺血后的早期电针干预可以增加脑血流量，减少脑缺血再灌注损伤的程度，并扩大治疗时间窗[17]。此次实验选择脑缺血1.5 h再灌注损伤不同时间点进行电针治疗，经电针治疗各时间亚组 p-ERK 表达水平较模型组均有不同程度的上调，其中再灌注1，3 d时上调最为明显；电针组各时间段p-JNK、p-p38MAPK的表达水平均有所下降，再灌注1，3 d亚组下降显著，而该时间点大鼠神经功能缺损症状也有明显改善。这些结果表明，电针可以通过激活p-ERK的表达并抑制p-p38MAPK、p-JNK的表达来改善神经功能缺损症状，且在3 d内干预效果较佳。相关研究也证明细胞是存活还是凋亡取决于生长活化因子的ERK信号通路和应激活化的JNK、p38MAPK信号通路之间的动态平衡[18-19]。它证实了先前的假设，即电针治疗对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，可能需要同时调节多个MAPK信号通路，即ERK信号通路和JNK、p38MAPK信号通路。
ERK通路主要参与调节细胞增殖、迁移、分化和减少细胞凋亡[20]。在此次研究中，观察到模型组p-ERK的表达出现先升高后下降的趋势，在再灌注2 h出现表达水平升高，这可能正是机体自身的一种保护性应激反应，脑缺血再灌注损伤导致大脑内神经细胞缺血缺氧，机体会启动自我保护程序。实验中发现模型组p-ERK的表达并未持续增多，而是在再灌注6 h后随即回落，提示ERK信号通路可能是机体自我修复的一个重要因素，而这种能力存在时限性。而电针组p-ERK水平再灌注2 h开始上升，3 d到达高峰后稍有回落，这提示在缺血再灌注后6 h至3 d内电针干预能上调ERK，可能会起到延缓神经元死亡、促进脑组织损伤修复的作用。有学者发现ERK信号传导通路参与了脑缺血后神经细胞的修复和保护，在脑缺血再灌注中发挥一定的抗调亡作用[21]。作者所在课题组先前的研究表明电针可以通过激活ERK信号通路来抑制I/R损伤期间的神经细胞凋亡从而改善脑损伤[5]，与此次实验结论一致。
p38MAPK、JNK是脑缺血再灌注损伤中细胞应激损伤应答的关键蛋白，参与脑缺血再灌注损伤中神经元凋亡的发生[22-23]。此次实验中电针组、模型组在再灌注2 h开始出现p-p38MAPK、p-JNK表达上升，约1 d时达到峰值后回落，提示机体在受到不利因素刺激后，同时也会有损伤性的应激，如JNK、P38MAPK通路等的激活表达。p38MAPK、JNK信号的激活常伴随着神经细胞的凋亡，凋亡增加期间电针和自我修复机制的后效应将抑制p38MAPK、JNK促凋亡途径[17]，所以发现两组的p-JNK、p-p38MAPK在1 d后出现回落，也提示电针在再灌注1 d前干预可能会降低JNK、p38MAPK上调造成的损伤。
结合以上实验结果发现，电针调控ERK、JNK和p38MAPK信号通路的表达呈现出不同的时程变化，发挥的作用也不尽相同。ERK信号通路的激活可抑制细胞凋亡，发挥保护作用，调控p-ERK表达的最佳时间窗为再灌注6 h至3 d；JNK和p38MAPK信号通路的活化可促进细胞凋亡、加重损伤，抑制p-JNK、p-p38MAPK 表达的最佳时间为再灌注1 d内。总的来说，治疗脑缺血再灌注损伤，电针在再灌注6 h至3 d的时间段内改善情况最佳。作者大胆猜测，电针可上调脑缺血再灌注后p-ERK的表达水平，同步抑制p-JNK与p-P38MAPK的表达，进而改善神经功能缺损症状评分，缩小脑梗死体积，促进缺血再灌注后受损脑组织的修复。此次实验的研究结果也进一步验证了“针刺刺激-调节MAPK家族信号通路相关蛋白表达-拮抗细胞凋亡-发挥脑保护作用”假说的科学性。
由于检测手段的局限性，此次实验使用双标记免疫荧光检测p-ERK和p-p38、p-JNK的表达，抗体之间的串扰可能在某种程度上影响靶标途径的表达，且未能对相关凋亡因子作定量检测，因此在将来的研究中，需要一种干扰更少的综合方法来同时测量p-ERK和p-p38、p-JNK的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

电针干预大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注模型丝裂原活化蛋白激酶通路的变化

Electroacupuncture intervenes with changes of mitogen-activated protein kinase pathway in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion due to middle cerebral artery occlusion

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