联合培养血管内皮细胞和脂肪干细胞与部分脱蛋白生物骨构建组织工程骨修复颌骨缺损

doi:10.12307/2022.328

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 2027-2033.doi: 10.12307/2022.328

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联合培养血管内皮细胞和脂肪干细胞与部分脱蛋白生物骨构建组织工程骨修复颌骨缺损

廖欣宇，王福科，李彦林，王国梁，杨桂然，侯建飞，杨腾云，钟瑞颖

昆明医科大学第一附属医院运动医学科，云南省昆明市 650032

收稿日期:2021-03-10 修回日期:2021-03-15 接受日期:2021-04-23 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-20
通讯作者: 王福科，博士，教授，主任医师，昆明医科大学第一附属医院运动医学科，云南省昆明市 650032
作者简介:廖欣宇，男，1996年生，湖南省长沙市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金面上项目(201701UH00095)，项目负责人：王福科

Tissue-engineered bone constructed by co-culture of vascular endothelial cells, adipose derived stem cells, and partially deproteinized biological bone to repair jaw defects

Liao Xinyu, Wang Fuke, Li Yanlin, Wang Guoliang, Yang Guiran, Hou Jianfei, Yang Tengyun, Zhong Ruiying

Department of Sports Medicine, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2021-03-10 Revised:2021-03-15 Accepted:2021-04-23 Online:2022-05-08 Published:2021-12-20
Contact: Wang Fuke, MD, Professor, Chief physician, Department of Sports Medicine, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Liao Xinyu, Master candidate, Department of Sports Medicine, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
General Project of Applied Basic Research Joint Special Fund of Yunnan Provincial Department of Science and Technology-Kunming Medical University, No. 201701UH00095 (to WFK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
部分脱蛋白生物骨：是采用不同理化技术将猪椎骨制备成部分脱蛋白骨后再使用纤维粘连蛋白修饰制成的组织工程骨，具有良好的生物相容性、孔隙率及力学性能，在骨组织工程研究中应用广泛。
血管内皮细胞：参与形成血管内壁的一类细胞，为解决组织工程骨血管化缓慢、新骨生长迟缓等问题，在构建组织工程骨时不仅需要植入有成骨潜能的干细胞，而且同时需植入加速血管形成的内皮细胞。

背景：临界骨缺损的修复一直是困扰临床外科医生的关键问题，骨组织工程研究提供了解决该问题的新思路。如何加快组织工程骨的血管化，进而促进种子细胞的成骨分化是骨组织工程研究中的关键问题。
目的：探讨血管内皮细胞和脂肪干细胞联合培养体系与部分脱蛋白生物骨构建组织工程骨修复骨缺损的能力。
方法：体外构建3种组织工程骨：部分脱蛋白生物骨+血管内皮细胞、部分脱蛋白生物骨+脂肪干细胞、部分脱蛋白生物骨+脂肪干细胞+血管内皮细胞 (血管内皮细胞∶脂肪干细胞比例为 1∶1)，以单纯部分脱蛋白生物骨为对照组。取18周龄SD大鼠60只，随机分为5组，每组12只，分别将4种支架材料植入相应的SD大鼠下颌骨骨缺损处，空白对照组仅制造骨缺损，不做修复。术后2，4，8，12周处死动物行大体观察、X射线检查、苏木精-伊红染色和Masson染色组织学观察，并取Masson染色切片行骨胶原定量检测。
结果与结论：①大体观察示术后部分脱蛋白生物骨+脂肪干细胞+血管内皮细胞组骨支架降解最快，修复骨缺损能力强于其他组，空白对照组骨缺损未被修复；②X射线片示术后8周时部分脱蛋白生物骨+脂肪干细胞+血管内皮细胞组出现骨性联合，骨缝消失，至12周时骨密度明显增加，骨形态已经基本恢复正常；其他组至12周时材料大体形态依然存在，空白对照组骨缺损未被修复；③组织学观察可见部分脱蛋白生物骨+脂肪干细胞组与单纯部分脱蛋白生物骨组比较差异无显著性意义(P=0.607 > 0.05)，部分脱蛋白生物骨+血管内皮细胞组与部分脱蛋白生物骨+脂肪干细胞组比较差异有显著性意义(P=0.011 < 0.05)，其余各组两两比较差异均有非常显著性意义(P < 0.01)；④结果表明，联合培养细胞构建的组织工程骨修复骨缺损能力最强，血管内皮细胞的影响力大于脂肪干细胞。
缩略语：血管内皮细胞：vascular endothelial cells，VECs；脂肪干细胞：adipose-derived stem cells，ADSCs；部分脱蛋白生物骨：partially deproteinised biologic bone，PDPBB

https://orcid.org/0000-0002-8107-7864 (廖欣宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪干细胞, 血管内皮细胞, 联合培养, 组织工程骨, 骨缺损修复

Abstract: BACKGROUND: The repair of critical bone defects has always been a key problem for clinical surgeons, and bone tissue engineering research provides a new way to solve this problem. How to accelerate the vascularization of tissue-engineered bone and promote the osteogenic differentiation of seed cells is a key problem in the research of bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To investigate the ability of tissue-engineered bone constructed by co culture system of vascular endothelial cells and adipose derived stem cells and partially deproteinized biological bone to repair bone defects.
METHODS: Three kinds of tissue-engineered bone were constructed in vitro: partially deproteinized biological bone + vascular endothelial cells, partially deproteinized biological bone + adipose derived stem cells, partially deproteinized biological bone + adipose derived stem cells + vascular endothelial cells (the ratio of vascular endothelial cells and adipose derived stem cells = 1 : 1), and partially deproteinized biological bone alone was used as control group. Totally 60 18-week-old SD rats were randomly divided into five groups with 12 rats in each group. Four kinds of scaffold materials were implanted into the corresponding mandibular bone defects of SD rats respectively. Only bone defects were made in the blank control group without repair. At 2, 4, 8, and 12 weeks after operation, the animals were killed for gross observation, X-ray examination, hematoxylin-eosin staining, and Masson staining for histological observation. Masson staining sections were taken for quantitative detection of bone collagen.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Gross observation showed that the degradation of bone scaffold in the partially deproteinized biological bone + adipose derived stem cells + vascular endothelial cells group was the fastest, and the ability of repairing bone defect was stronger than that in the other groups. Bone defect in the blank control group was not repaired. (2) X-ray examination showed that the partially deproteinized biological bone + adipose derived stem cells + vascular endothelial cells group had bony union at 8 weeks; bone suture had disappeared; bone density increased significantly at 12 weeks; and bone morphology had basically returned to normal. In the other groups, the general shape of the material still existed at 12 weeks, while in the blank control group, the bone defect was not repaired. (3) Histological observation showed that there was no significant difference between partially deproteinized biological bone + adipose derived stem cells group and simple partially deproteinized biological bone group (P=0.607 > 0.05). However, there was significant difference between partially deproteinized biological bone + vascular endothelial cells group and partially deproteinized biological bone + adipose derived stem cells group (P=0.011 < 0.05). There were significant differences between the other groups (P < 0.01). (4) It is concluded that the ability to repair bone defect is the strongest in tissue engineered bone constructed by co-cultured cells, and the influence of vascular endothelial cells is greater than that of adipose derived stem cells.

Key words: adipose derived stem cells, vascular endothelial cells, joint training, tissue-engineered bone, bone defect repair

中图分类号:

廖欣宇, 王福科, 李彦林, 王国梁, 杨桂然, 侯建飞, 杨腾云, 钟瑞颖. 联合培养血管内皮细胞和脂肪干细胞与部分脱蛋白生物骨构建组织工程骨修复颌骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2027-2033.

Liao Xinyu, Wang Fuke, Li Yanlin, Wang Guoliang, Yang Guiran, Hou Jianfei, Yang Tengyun, Zhong Ruiying. Tissue-engineered bone constructed by co-culture of vascular endothelial cells, adipose derived stem cells, and partially deproteinized biological bone to repair jaw defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 2027-2033.

图/表（结果） 9

2.1 一般情况观察 2只SD大鼠术后死亡；3只出现骨缺损处感染，移植物排出，予以补做实验；其余动物第1天开始进食，饮食、活动正常，术后第1周切口肿胀，2周后完全愈合。
2.2 大体观察结果第2周取材，单纯PDPBB组可见大量纤维组织包绕植入的组织工程骨，连接紧密，组织工程骨还有一定的活动度，见图1A；PDPBB+ADSCs+VECs组可见纤维组织长入骨支架的孔隙，孔隙减小，见图1B；空白对照组可见纤维组织已经封闭骨缺损，去除软组织后骨缺损依然存在，见图1C。第4周取材，PDPBB+ADSCs+VECs组可见纤维组织包绕连接植入的组织工程骨，植入材料不能移动，见图1D；PDPBB+VECs组可见周围肌肉及纤维组织明显增厚，把组织工程骨和下颌骨连接成一体，组织工程骨血供较其他组丰富，植入材料不能移动，见图1E。第8周取材，可见多数组织仍以纤维连接为主，PDPBB+ADSCs+VECs组去除周围组织，可见组织工程骨空隙已经消失，与下颌骨骨性连接，表面部分材料已皮质化，见图1F。第12周取材，各组均已和下颌骨骨性连接，单纯PDPBB组可见材料部分吸收，材料大体还保留有原来形态，见图1G；PDPBB+ADSCs+VECs组材料形态和正常下颌骨相似，表面已皮质化，材料已经大部分吸收，仅有少量未被取代，见图1H；空白对照组骨缺损未被修复，骨断裂部分已经被骨皮质封闭，形成半圆形骨缺损区，见图1I。

2.3 颌骨缺损成骨的X射线片检查结果 ①PDPBB+VECs组：第2周支架材料与下颌骨缺损之间的缝隙较宽，周围有新生骨痂生成；第4-8周骨痂逐渐增多，第12周较前相比组织工程骨的骨密度明显增加，与正常骨质相比已基本相同，见图2A。②PDPBB+ADSCs组：第2周骨缺损周围骨痂开始生成，随时间延长逐渐增加，植入生物骨和缺损之间缝隙减小，第8周和第12周缝隙之间消失，第12周时支架材料与下颌骨缺损之间缝隙明显减淡，但支架材料大体形态依然存在，见图2B。③PDPBB+ADSCs+VECs组：第4-12周骨缺损周围骨痂生成随时间延长逐渐增加，植入生物骨和缺损之间缝隙减小，第8周已经骨性联合，骨缝已经消失；第12周骨密度明显增加，骨形态已经基本恢复正常，见图2C。④单纯PDPBB组：第2周可见支架材料与下颌骨缺损之间的缝隙较宽，周围有新生骨痂生成；第4-12周骨痂逐渐增多，第12周时支架材料骨密度较前减轻，与正常骨质对比明显，见图2D。⑤空白对照组：第2周颌骨体部有长方形骨缺损，未见明显骨痂；第4周在骨缺损周边少许骨痂出现；第8周和第12周骨缺损面积减小，边缘有骨痂修复，骨皮质已经封闭缺损端，仅剩下半圆或三角形缺损，见图2E。

2.4 颌骨缺损成骨的组织学观察结果
PDPBB+VECs组：第2周支架材料周围出现大量多形性细胞，核大，排列不规则，部分细胞为多核巨细胞，侵蚀入支架材料内部，外层为层状排列的梭形成纤维细胞，见图3A；第4周支架材料周围多核破骨细胞和巨噬细胞增多，大量细胞侵入支架材料内部，骨支架内部出现大量细胞结构，见图3B，支架材料被周围多核破骨细胞和巨噬细胞侵蚀，可见多个月牙形改变，周围大量新生血管形成，见图3C；第8周支架材料周围改变外，还可见大量的小血管形成，见图3D；第12周支架材料内部部分骨支架吸收，梭形成纤维细胞消失，出现大量多形性髓腔细胞成分，见图3E，支架材料部分吸收，周围梭形成纤维样细胞分泌大量胶原，平行或螺旋形排列，编织成网状，见图3F。

PDPBB+ADSCs组：第2周有大量梭形成纤维细胞包绕组织工程骨，少见淋巴细胞浸润，见图4A；第4周交界端未见明显的新骨形成，见图4B；第12周支架材料大部分老化，材料边缘有骨样组织形成，见图4C；大量胶原沿支架材料周围平行排列，形成新的骨小梁结构，见图4D。

PDPBB+ADSCs+VECs组：第2周有大量软组织长入组织工程骨孔隙，大部分为梭形成纤维细胞，胶原分泌少，少量淋巴细胞浸润，见图5A；第4周支架材料周围存在大量的破骨细胞，骨支架材料被分割降解，骨支架内部出现细胞结构，周围成纤维细胞排列紊乱，骨支架周围形成大量的骨样物质，见图5B；支架材料降解、碎裂，成纤维样细胞长入加快支架材料降解；成纤维细胞胶原分泌量增多，排列紊乱；大量新生小血管形成，见图5C；第8周纤维组织纤维包裹支架材料，材料降解形成多个月牙形凹痕，软组织中出现多个新生小血管，局部出现髓腔化改变，见图5D；第12周支架材料部分降解完毕，取代为新的成骨中心，周围存在大量的巨噬细胞和新生血管网，见图5E；支架材料周围胶原组织堆积形成新的骨小梁结构，骨细胞包埋进胶原内部，大量骨支架被降解取代，见图5F。

单纯PDPBB组：第2周有大量梭形成纤维细胞包绕组织工程骨，未见大量破骨细胞，见图6A；第8周支架材料边缘清晰，未见明显降解现象和骨样物质形成，较多炎性细胞浸润，见图6B；第12周支架材料部分老化，材料边缘未见明显骨样组织和新生血管形成，见图6C。

2.5 组织工程骨成骨能力检测每组原位成骨Masson染色切片任选100倍6张使用Adobe Photoshop 7.0软件的魔棒工具和直方图(histogram)功能，进行胶原组织形态计量分析，以像素(pixels)代表骨面积计算成骨量[5]。各组骨胶原量随时间延长逐渐上升；各时间点PDPBB+ADSCs+VECs组均大于其他组，单纯PDPBB组曲线基本呈一直线；PDPBB+ADSCs组和PDPBB+ADSCs+VECs组第4周胶原量较第2周略有下降，第8周和第12周逐渐上升，见图7。

统计学分析各分组差异有非常显著性意义(F=54.734，P < 0.01)；PDPBB+ADSCs组与单纯PDPBB组比较差异无显著性意义(P=0.607 > 0.05)，PDPBB+VECs组与PDPBB+ADSCs组比较差异有显著性意义(P=0.011 < 0.05)；其余各组两两比较差异均有非常显著性意义(P < 0.01)。第2周数据分析各组差异有非常显著性意义(F=40.154，P < 0.01)；PDPBB+ADSCs+VECs组与其他组两两比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，其余各组两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)。第4周数据分析各组差异有非常显著性意义(F=11.675，P < 0.01)，PDPBB+VECs组与单纯PDPBB组和PDPBB+ADSCs组比较差异无显著性意义 (P > 0.05)，单纯PDPBB组与PDPBB+ADSCs组两两比较差异有显著性意义(P=0.047 < 0.05)；其余各组两两比较差异均有非常显著性意义(P < 0.01)。第8周数据分析各组差异有显著性意义(F=95.420，P < 0.01)，各组两两比较差异均有非常显著性意义(P < 0.01)。第12周数据分析各组差异有非常显著性意义(F=35.510，P < 0.01)；PDPBB+ADSCs组与PDPBB+VECs组和单纯PDPBB组两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，其余各组两两比较差异均有非常显著性意义(P < 0.01)，见表1。

2.6 生物相容性实验前期研究中，已对构建的组织工程骨进行了相关检测，在体外实验中，各组工程骨附着的种子细胞均生长良好，细胞能够正常增殖分化，在异位成骨实验中，移植到大鼠肌袋的组织工程骨能够正常降解并被取代为新的成骨中心[5]，在此次实验中，该组织工程骨支架能够修复大鼠颌骨缺损，且联合培养组修复骨缺损的能力更强，这都表明构建的组织工程骨无毒性作用，具有良好的生物相容性。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2006年1月至2009年3月在昆明医学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 18周龄SD大鼠60只，雌雄不限，体质量(200±10) g，由昆明医科大学动物科提供。
1.3.2 实验材料及仪器低糖DMEM培养基、新生牛血清(GIBCO公司，美国)；胰蛋白酶、EDTA(Sigma 公司，美国)；纤维粘连蛋白(R&D公司，美国)。超净工作台、恒温CO2培养箱(Thermo Scientific公司，美国)；低温自动平衡离心机(北京医用离心机厂)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；SP2500型硬组织切片机(Leica公司，德国)；DM 2500型正置图像采集显微镜(Leica公司，德国)。
1.4 方法
1.4.1 构建体外组织工程骨参照文献[5]制备PDPBB、ADSCs、VECs。取0.5 cm × 0.4 cm × 0.3 cm的PDPBB材料60块，L-DMEM预湿，随机分为4组：PDPBB+VECs组，PDPBB+ADSCs组，PDPBB+VECs+ADSCs组(VECs∶ADSCs为1∶1)，单纯PDPBB组，每组12块，分别置入4块6孔板中，每孔放置2块。取第4代ADSCs和诱导6周的脐血来源VECs，以5.0×109 L-1的细胞浓度接种预湿过的各组PDPBB材料上，每孔100 μL[4]，置于37 ℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养4 h后，加入含体积分数为15%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、0.01 mol/L HEPES缓冲液的L-DMEM培养基，隔日换液。体外培养10 d后移植入颌骨缺损模型[5]。

1.4.2 组织工程骨植入颌骨缺损模型取健康SD大鼠60只，雌雄不限，随机分为5组： PDPBB+VECs组，PDPBB+ADSCs组，PDPBB+ADSCs+VECs组，单纯PDPBB组，空白对照组，每组12只。3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)肌肉注射麻醉后脱毛，0.5%碘伏消毒手术区域，分层切开下颌部皮肤、皮下，钝性分离肌肉，暴露下颌骨体部，在下颌骨体部椎板用咬骨钳制造0.5 cm×0.4 cm临界骨缺损[6-7]，分别将相应组织工程骨植于SD大鼠下颌骨骨缺损处，空白对照组仅制造骨缺损，不进行修复。术毕肌注青霉素40万Ｕ预防切口感染。术后各组动物于相同条件下分笼饲养。
1.5 主要观察指标
1.5.1 一般情况观察术后各组动物的活动、进食、伤口愈合情况。
1.5.2 骨缺损修复标本大体观察术后2，4，8，12周脱颈处死大鼠，每组每个时间点3只，动物处死后大体观察植入材料的外观形态变化及其与周围软组织的关系。
1.5.3 X射线片检查标本大体观察后，取出下颌骨进行摄片(电压40 kV，电流50 mA，焦距75 cm，曝光时间0. 03 s)，比较X射线下各组组织工程骨成骨情况。
1.5.4 组织学检查术后各时间点X射线片检查后的标本放入体积分数为10%甲醛中固定12 h，树脂包埋，硬组织切片机连续切片，片厚5 μm，常规行苏木精-伊红染色、Masson染色，倒置相差显微镜下观察。每组100倍Masson染色切片任选6张使用Adobe Photoshop 7.0软件的直方图功能，进行胶原组织形态计量分析，以像素(pixels)代表新骨面积，计算比较成骨量[5]。
1.6 统计学分析采用SPSS 11.5统计软件进行分析。数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

3.1 联合培养体系中VECs对间充质干细胞的影响组织器官是由多种细胞构成的，各细胞之间相互作用、相互影响，共同承担复杂组织的结构和功能。随着组织工程学的发展，学者们越来越发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，为此联合培养细胞技术就应运而生。联合细胞培养是一门采用不同类型细胞进行混合培养的技术，可以采用两种或多种细胞共同培养，联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系。联合细胞培养技术更符合仿生学的原理，更有利于种子细胞的增殖和分化，为复杂的细胞诱导分化和体外组织构建提供了新思路、新方法。在骨组织工程中，建立VECs和间充质干细胞联合培养体系的研究尤为突出。
SWANSON等[8]认为内皮细胞主要表达的是骨形态发生蛋白2因子，骨形态发生蛋白2因子能强烈促进成骨细胞分化。研究发现，VECs与成骨细胞联合修复骨缺损过程中，成骨细胞表达血管内皮生长因子，促进血管内皮细胞的分裂增殖，同时血管内皮生长因子促进血管内皮细胞表达骨形态发生蛋白，骨形态发生蛋白作用于成骨细胞一方面可以提高血管内皮生长因子的表达，另一方面可以促进骨再生，两种细胞分泌的生长因子之间形成一个正反馈调节，因此两种细胞可互相促进而非相互抑制[8-10]。
有学者发现将人成骨细胞和几乎不表达碱性磷酸酶活性的人脐静脉内皮细胞共培养时，其碱性磷酸酶活性升高并伴随细胞数增多[11]，认为这种作用是内皮细胞通过分泌具有促成骨作用的因子如胰岛素样生长因子1和内皮素1来实现的，而成骨细胞可以通过血管内皮生长因子来增强这一作用。DECKERS等[12]也认为在骨折修复过程中成骨细胞及其前体细胞和内皮细胞之间存在相互作用，在骨缺损局部血管发生和骨形成具有某种偶连关系。还有学者采用了内皮细胞和骨髓间充质干细胞共同培养的方法[13]，实验表明联合培养的内皮细胞显著促进了骨髓间充质干细胞在聚乙酸内酯支架的黏附和增殖。这些研究都证明VECs能分泌多种细胞因子，在有内皮细胞的共培养体系中，内皮细胞能影响间充质干细胞的生长、黏附和分化等。
在该实验中PDPBB+ADSCs+VECs组组织工程骨的成骨能力、支架材料的降解性均超过单独使用一种细胞组，说明联合培养细胞体系作为组织工程骨的种子细胞有独特的优势；VECs分泌的多种细胞因子不仅可以作用于成骨细胞，也可以作用于组织工程骨上的ADSCs，即保持了组织工程骨的血供，为骨组织的构建提供营养，又促进ADSCs增殖和成骨分化。第8周和12周时PDPBB+VECs组的胶原量仅次于PDPBB+ADSCs+VECs组，PDPBB+ADSCs组和单纯PDPBB组相比较差异有显著性意义，说明VECs的影响力大于ADSCs；PDPBB+ADSCs+VECs组与PDPBB+VECs组比较有显著差异说明联合培养细胞的作用显著优于VECs或ADSCs。
3.2 脐血来源血管内皮细胞的优势组织工程化人工骨修复骨缺损的关键问题依然是如何加快组织工程骨的血管化，大段骨缺损修复难度大，主要原因就在于其局部血供相对较差。组织工程中起血管化作用的种子细胞主要是从机体自身动脉或静脉获得的内皮细胞，细胞来源有限，且对供体具有创伤性。更为重要的是，来源于成熟血管的内皮细胞多为终末分化细胞，易老化，扩增数量有限，不能满足血管构建对大量种子细胞的要求，因此寻找初期分化细胞来源的内皮种子细胞已成为血管化组织工程骨构建的关键。
近来研究表明，内皮祖细胞较成熟的内皮细胞具有迟发性高增殖潜能，成熟内皮细胞在体外能很快进入增殖期，但4-6周后增殖活力即明显下降，与此相反，内皮祖细胞在15-20 d 形成迅速生长的鹅卵石样内皮细胞，并能稳定传代30代以上，其增殖能力是脐静脉内皮细胞的10倍[14]。内皮祖细胞主要来源于脐血、成人骨髓和外周血[15]。脐血中分离的内皮祖细胞表达CD34、CD133和VEGFR2，约占CD34+细胞的2%，这些CD34+和CD133+细胞可以在缺血组织分化成内皮细胞并诱导血管新生[16]。PESCE等[17]将新鲜提取的脐血CD34+注入大鼠缺血的肌肉中，证实产生了内皮细胞。还有实验证明脐血内皮祖细胞能促进缺血肢体的血管生成[18]。虽然有学者认为骨髓诱导的内皮细胞在一定条件下也能够在体内促进血管生成[19-20]，但骨髓来源干细胞随着年龄的增大逐渐减少，而且细胞集落实验表明女性的细胞集落随年龄增加明显下降[21]。在临床应用中，脐血来源血管内皮细胞优于骨髓来源，所以该研究中采用脐血诱导来源的血管内皮细胞。
3.3 血管内皮细胞移植对组织血管化的影响理论上血管内皮细胞移植可以为新生血管提供细胞来源和细胞因子支持，在实际机体内是否能促进新生血管生成呢？学者们进行了一系列的研究。谭洪波等[22]研究认为纤维蛋白凝胶和骨髓诱导的内皮细胞与支架复合能够让细胞在支架内很好的生长，在体外能够形成内皮样血管芽结构。目前在肢体缺血、心肌梗死方面，动物实验显示骨髓诱导的内皮细胞注入缺血组织可以促进新生血管生成[19-20]。这些研究表明移植的血管内皮细胞参与了新生血管的生成。
在该研究中硬组织切片上可以看到PDPBB+VECs组和PDPBB+ADSCs+VECs组有大量的新生血管生成，BrdU标记的植入细胞免疫荧光染色也显示，植入的血管内皮细胞参与了新生血管的生成，但是植入血管内皮细胞是否能加速组织工程骨的血管化还需要进一步研究[5]。
3.4 共培养体系中间充质干细胞的作用近期研究表明间充质干细胞也能够分泌多种生长因子，可以同其他间充质细胞或成体细胞一起构成结缔组织骨架，分泌细胞因子及胞外基质蛋白，调节造血细胞的增殖和归巢。LIU等[23]用RT-PCR和ELISA等方法检测了在创伤微环境作用下生长因子在骨髓间充质干细胞中的表达，结果显示在创伤微环境作用下骨髓间充质干细胞可分泌转化生长因子β1、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等，而这些生长因子在创伤修复过程中起到关键的促进作用。
有学者将肝细胞和骨髓间充质干细胞联合培养技术应用于肝组织工程[24]，利用骨髓间充质干细胞分泌的肝细胞生长因子促进肝细胞在体外培养时的生长分化，结果显示7 d时体外培养的肝细胞仍能保持特有的功能，4 d左右肝细胞功能活性最佳。MURAKAMI等[25]也认为两种细胞在非接触和相互接触情况下，肝细胞的氨代谢和白蛋白分泌功能都得到了明显提高，骨髓间充质干细胞分泌的可溶性因子是这种现象的关键因素，但这种因子绝不单单是肝细胞生长因子能够解释的[26]，说明间充质干细胞对肝细胞的促进作用是一个复杂的过程。
在造血系统的组织工程研究中，间充质干细胞也有同样的价值。2005年KIM等[27]发现骨髓间充质干细胞能够诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化，在联合培养系统中7-10 d造血干细胞的数量明显增高，随后BOROUJENI等[28]用半定量RT-PCR技术验证了当两种细胞共同培养10 d时，Ⅴ珠蛋白、βH1珠蛋白、成骨特异性转录因子1(RUNX1)、促红细胞生成素受体等基因表达明显增高。这些现象的真正原因还不清楚，但通过该研究可以认为骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞的诱导、分化有积极的影响。这个共培养系统可以成为治疗造血系统疾病新的选择。
以上研究表明骨髓间充质干细胞也能分泌多种因子，作用于共培养体系中的其他细胞，有助于组织的形成。虽然先前的研究使用的都是骨髓来源间充质干细胞，但从不同来源间充质干细胞的表面抗原基本相同来看，可以预料其他来源间充质干细胞同样能够起到这样的效果。在该研究中虽然没对VECs和ADSCs之间相互影响的分子机制进行研究，但从联合培养细胞体系作为种子细胞构建组织工程骨的成骨性能、新生血管化能力来看，ADSCs可以起到和骨髓来源间充质干细胞相似的作用，这些还有待以后的研究证明。
综上所述，PDPBB+ADSCs+VECs组修复骨缺损能力最强，VECs能增强组织工程骨的成骨能力；在组织工程骨修复骨缺损时，VECs的影响力大于ADSCs。虽然这些研究还处在初级阶段，VECs和间充质干细胞分泌的细胞因子还不完全明了，对共培养体系中两种细胞相互影响的传导通路、作用机制还不完全清楚，但可以预见组织工程的将来，用单一种子细胞完全构建与正常组织相同的组织是不可想象的，有可能需要不仅有两种细胞的种子细胞体系，而且还可能需要多种细胞联合培养体系作为种子细胞。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

联合培养血管内皮细胞和脂肪干细胞与部分脱蛋白生物骨构建组织工程骨修复颌骨缺损

Tissue-engineered bone constructed by co-culture of vascular endothelial cells, adipose derived stem cells, and partially deproteinized biological bone to repair jaw defects

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