局灶性脑梗死出血转化模型中基质金属蛋白酶9的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：理论上来说，出血性转化可发生于任何脑梗死患者，可见于脑梗死自然演变病程的任何阶段。因此进一步从缺血时间和再灌注角度进行梗死后出血转化发病机制研究可以为临床预防和治疗梗死后出血转化提供理论依据。
目的：观察持续性脑梗死与脑缺血再灌注大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达。
方法：将健康雄性成年Wistar大鼠随机分为3组：即假手术组、缺血再灌注组、持续脑梗死组。采用线栓法制成大脑中动脉闭塞模型，缺血再灌注组在相应缺血时间点(4.5，6，12，24，48 h)将线栓拔出再灌注24 h，假手术组手术过程同缺血再灌注组，但未置入栓线。持续脑梗死组制成大脑中动脉闭塞模型，但中间不取出栓线。分别于术后2 h进行模型成功评价，并于术后相应时间点进行神经功能障碍评分；TTC染色观察脑组织发生出血转化情况；用免疫组化方法测定基质金属蛋白酶9的表达。
结果与结论：脑梗死后4.5 h内血流再通神经功能评分明显提高，6 h以后尤其12 h以后血流再通将加重神经功能缺损；在缺血再灌注组内随着缺血时间的延长神经功能评分逐渐降低，缺血48 h降至最低。脑组织TTC染色可见缺血12，24，48 h再灌注大鼠均有不同程度的出血转化发生。基质金属蛋白酶9以负性因素参与再灌注损伤和出血性转化，加重缺血再灌注损伤以及促进出血性转化发病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 脑及脊髓损伤动物模型, 脑缺血, 再灌注损伤, 梗死后出血性转化, 基质金属蛋白酶9

Abstract:

BACKGROUND: Theoretically, hemorrhagic transformation can appear in any patients with cerebral infarction, and occurs in any process of natural evolution of cerebral infarction. Therefore, to further study the pathogenesis of hemorrhagic transformation after infarction from the angle of ischemia time and reperfusion can provide theoretical evidence for preventing and treating hemorrhagic transformation after infarction in the clinic.
OBJECTIVE: To observe matrix-metalloproteinase-9 expression in rats with persistent infarction and cerebral ischemia-reperfusion.
METHODS: Healthy male adult Wistar rats were randomly assigned to three groups: sham surgery group, ischemia-reperfusion group and persistent infarction group. Suture method was used to establish models of middle cerebral artery occlusion. In the ischemia-reperfusion group, suture was pulled out at 4.5, 6, 12, 24 and 48 hours after ischemia and reperfusion were conducted for 24 hours. In the sham surgery group, the operation was the same as the ischemia-reperfusion group, but suture was not inserted. In the persistent infarction group,

models of middle cerebral artery occlusion were generated, but the suture was not pulled out. Whether the models were successful or not was evaluated at 2 hours after the surgery. Neurological disorders were scored at corresponding time points after the surgery. 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride staining was utilized to observe hemorrhagic transformation in brain tissue. Immunohistochemistry was applied to determine matrix-metalloproteinase-9 expression.
RESULTS AND CONCLUSION: Within 4.5 hours after cerebral infarction, neurological score of blood recanalization was obviously elevated. 6 hours later, especially, 12 hours later, blood recanalization aggravated neurologic impairment. In the ischemia-reperfusion group, neurological score gradually decreased with prolonged time of ischemia. At 48 hours of ischemia, neurological score was lowest. 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride staining revealed that at 12, 24 and 48 hours after ischemia, hemorrhagic transformation appeared to different degrees in rats. Matrix-metalloproteinase-9 as a negative factor participates in reperfusion injury and hemorrhagic transformation, aggravated ischemia-reperfusion injury and promoted the onset of hemorrhagic transformation.

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中图分类号:

R318

肖洁，李小刚. 局灶性脑梗死出血转化模型中基质金属蛋白酶9的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 7969-7975.

Xiao Jie, Li Xiao-gang. Matrix-metalloproteinase-9 expression in focal cerebral infarction models experiencing hemorrhagic transformation [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 7969-7975.

图/表（结果） 4

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引言

脑梗死后影像学检查中出血转化的出现率为20%-43%不等^[1]，而尸解发现其发生率可高达71%^[1-2]，脑缺血后不同时间出现率也不相同，48 h内为32%，1周内上升为40%，1个月时可达43%^[1,3]，心源性栓子导致脑梗死发生率远远高于血栓形成性脑梗死，为95%^[1-2]。溶栓治疗时发生率增高到67.3%^[1]，在所有病例中大部分不造成严重的临床后果，但6%-10%的患者会因此加重症状甚至死亡。静脉溶栓治疗的患者症状性增加到21.2%，并使与此相关的死亡率增高10倍[1]。症状性患者的1周内死亡率高达61%^[4]。因此，出血性转化是颇令临床医生担心的脑梗死合并症^[1]。
理论上来说，出血性转化可发生于任何脑梗死患者，可见于脑梗死自然演变病程的任何阶段。因此研究梗死后出血转化发生的危险因素及其发病机制，进一步预防和治疗梗死后出血转化已经成为脑血管病研究中的新靶点。出血性转化广义的定义为新近脑梗死后在颅腔内有出血，出血既可在梗死灶内也可以在梗死灶的远隔部位发生^[5]。梗死后出血转化按梗死灶内有无红细胞脑梗死分为白色(贫血性脑梗死)和红色(出血性脑梗死)两大类^[6]。之所以有这两种截然不同的病理改变主要是因为出血性梗死在梗死区域内存在小动脉毛细血管和/或小静脉壁因缺血缺氧而破损以及重灌流现象导致血液中的红细胞外溢所致。
以往研究发现：梗死后出血转化是由于缺血区血管重新恢复血流灌注导致的梗死区内继发性出血，因此研究梗死后出血转化即研究缺血缺氧的病理生理机制改变。在临床研究病例中，脑梗死后早期脑组织内或血液基质金属蛋白酶9含量都迅速被诱导上升，呈现出上升至最高峰然后下降的动态过程，并且造成血脑屏障的通透性增加和血脑屏障的破坏、脑水肿的产生及继发性脑损伤；而使用基质金属蛋白酶9抑制剂、抗体或者基因敲除都能有效减少脑损伤的程度，如梗死灶减小、神经功能缺损程度减轻等。Romanic等^[7]发现基质金属蛋白酶9抑制剂能显著减少脑缺血后的梗死体积，降低脑损伤的程度，且Lu等^[8]研究表明再灌注损伤后基质金属蛋白酶的激活进一步引起基底膜的破坏是再灌注引起神经损伤的重要因素。因此实验构建脑梗死出血转化模型，检测其脑组织中基质金属蛋白酶9的表达，从缺血时间和再灌注角度进行梗死后出血转化发病机制研究，为临床预防和治疗梗死后出血转化提供理论依据。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2010年1至10月在泸州医学院附属医院实验室完成。
1.3 材料健康雄性成年Wistar大鼠120只，体质量250- 320 g[9-10]，由重庆医科大学动物中心提供。

1.4.1 动物分组 120只大鼠按随机原则分为3组：假手术组，缺血-再灌注组，持续性脑梗死组，每组40只。
其中缺血再灌注组分缺血4.5 h灌注24 h，缺血6 h灌注24 h，缺血12 h灌注24 h，缺血24 h灌注24 h，缺血48 h灌注24 h 5个亚组，每个亚组8只。
持续性脑梗死组和假手术组与缺血再灌注组相对应的时间点分为28.5 h(4.5 h+24 h)，30 h (6 h+24 h)，36 h (12 h+24 h)，48 h(24 h+24 h)，72 h(48 h+ 24 h)5个亚组，每个亚组8只。
1.4.2 构建局灶性脑缺血再灌注模型
假手术组：手术过程同缺血-再灌注组，但未插栓线，不造成脑缺血。
缺血-再灌注组：选用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔给药麻醉大鼠^[11]。然后将其固定在手术台上。根据Koiznmi和Longa以及Minematsu等的方法制备脑缺血模型^[12-14]：先剪去大鼠颈部毛发，用碘酒、乙醇局部消毒，采用颈部正中切口，切开皮肤及皮下组织，分离右侧颈总动脉(CCA)及分支，在近颈总动脉分叉处结扎颈外动脉(ECA)及分支，分离颈内动脉(ICA)至鼓泡处，在颈内动脉近端备线，近心端结扎颈总动脉，在颈总动脉上用眼科剪剪一V型小口，然后从切口插入准备好的尼龙线，栓线进入颈内动脉穿过大脑中动脉(MCA)起始端至大脑前动脉(ACA)近端，阻断了大脑中动脉的所有血流来源^[15]。栓线根据动物的体质量不同进入17-22 mm后^[16]，可以感到一个轻微的阻力，这时停止进线，扎紧颈内动脉备线，缝合皮肤，外留尼龙线头约15 mm，整过手术过程10-15 min完成，该方法可以固定的引起右侧额顶皮质、尾状核、壳核梗死。分别于缺血后4.5，6，12，24，48 h将尼龙线从颈内动脉内撤出，拔出约10 mm，形成脑缺血-再灌注模型^[17-19]，均于再灌注 24 h终止观察。其目的是观察手术过程对基质金属蛋白酶9以及出血转化的影响。
持续性脑梗死组：制成局灶性脑缺血模型，中间不取出栓线，缺血后28.5，30，36，48，72 h终止观察。缺血再灌注组与对应相同时间点持续性脑梗死组比较的目的是观察再灌注本身引起的脑损伤。
1.4.3 模型成功评价根据Bederson等[20]的评定方法分为4级。0级：未有神经缺失症状；1级：将大鼠尾巴提起，瘫痪侧前肢回收屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展；2级：除1级体征外，向瘫痪侧推大鼠时阻力较对侧明显降低；3级：除以上体征外，大鼠有向瘫痪侧旋转的行为。实验动物大部分在术后2 h内苏醒。手术后2 h对大鼠神经症状进行评定，神经症状达1，2，3级判断为模型成功，否则排除进一步试验，因缺乏神经系统体征说明大脑中动脉没有可靠的阻塞。
1.4.4 TTC染色将缺血再灌注组和持续性脑梗死组大鼠脑组织块置入4%TTC溶液中，在37 ℃条件孵育30 min，每四五分钟翻动脑片一次。由于正常脑组织的酶使TTC分解变红色，所以TTC染色时，正常脑组织呈红色，梗死灶呈白色^[20]。发生梗死后出血转化的脑组织在白色梗死中心有红色区域。
1.4.5 大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经功能障碍的评分各组分别在术前和术后各相应处死时间点按Garcia方法^[21]进行神经功能评分(表1)，最高分18分，最低分3分，分数越低，神经功能障碍越重。

1.4.6 基质金属蛋白酶9测定各组于相应的时间点终止观察，用2%戊巴比妥钠过量麻醉，开胸钝性分离临近组织暴露心脏，2%肝素0.3 mL注入左心室，用静脉留置针经心尖穿刺置入胸主动脉，固定留置针，剪开右心耳，同时经左心室快速灌注生理盐水150 mL，然后用40 g/L多聚甲醛150 mL灌注固定。开颅取出脑组织，在血肿周围切2块脑组织浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定过夜。脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片(厚度5-7 μm)脱蜡至水后，用SP法、DAB显色，镜下观察基质金属蛋白酶9蛋白表达，每只大鼠每个指标选一张切片，在400倍光镜下随机选择血肿周围的4个互不重叠的视野，每个时点共计16个视野，计数每个视野的阳性细胞数。基质金属蛋白酶9蛋白表达以胞质染成棕黄色的细胞为阳性细胞。
1.5 主要观察指标各组神经功能障碍评分及基质金属蛋白酶9表达。
1.6 统计学分析所测数值均用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义，各组之间比较均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的多个样本均数的两两比较法(LSD法)，全部统计方法用SPSS 17.0统计分析软件完成。

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讨论

3.1 梗死后出血转化模型建立以往研究在建立脑梗死模型的基础上，结合大鼠脑出血模型技术建立血肿型梗死后出血转化大鼠模型利于控制出血量及出血时间，但是与临床再灌注的过程有较大差异。本实验采用血管再通法弥补这一点。线栓法大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型具有不开颅，手术时间短，术中不引起血压、体温、血气等异常变化，对全身影响小。组织学证实，2 h后均在大脑中动脉供血区出现大小不等的梗死灶，梗死灶位于同侧额顶叶皮质及尾状核与壳核外侧部。光镜下亦见到了典型的神经细胞缺血性坏死，表明该模型可靠，重复性好，与临床大脑中动脉缺血病灶相似。这种模型缺血梗死部位恒定，而且可准确控制缺血和再灌注时间，便于评价再灌注作用以及治疗时间窗的选择，已成为应用广泛的脑缺血再灌注模型，模型成功的标志是动物苏醒后出现同侧的Horner征和对侧前肢为重的偏瘫^[22-27]。以往的研究证实，脑缺血超早期治疗时间窗为4.5 h之内，超过6 h血流再通则容易引起出血并发症。本实验旨在研究出血性转化的发病机制，故分别在大鼠脑缺血4.5，6，12，24，48 h，拔出栓线造成血流再通24 h，并且随机抽取10只模型成功评价为3级的大鼠观察发现确有梗死后出血转化发生。此方法更接近临床发病过程。
3.2 大鼠神经功能障碍评分及与梗死后出血转化脑动脉闭塞导致缺血超过5 min可发生脑梗死。急性脑梗死病灶由中心坏死区及周围的缺血半暗带组成。缺血半暗带仍存在侧支循环，可获得部分血液供应，尚有大量可存活的神经元。闭塞血管再通，继发性纤溶亢进血栓溶解或栓子破碎移向远端和侧支循环开放，凝血障碍以及临床过程中的溶栓治疗等均可导致再灌注。脑梗死区血流再通后氧与葡萄糖供应及脑代谢恢复，脑组织损伤理应得到恢复。然而，实际上并非如此，这是因为存在再灌注时间窗。如果血流再通超过此时间窗，脑损害可继续加重，产生再灌注损伤，严重时发生出血转化。本实验发现缺血4.5 h再灌注24 h与持续缺血28.5 h比较神经功能评分明显升高，缺血6 h再灌注24 h与持续缺血30 h组比较神经功能障碍评分无明显差异，而缺血12 h再灌注24 h，缺血24 h再灌注24 h，缺血48 h再灌注24 h组与持续缺血36，48，72 h组比较神经功能评分显著降低，在缺血再灌注组内随着缺血时间的延长，神经功能评分值逐渐降低，在缺血48 h灌注24 h达到最低。这不仅说明随缺血时间延长，神经功能损害越重，而且在 6 h以后尤其12 h以后行再灌注出血转化发生(70%)大于持续性脑梗死组(30%)。由此可见缺血与再灌注共同参与了出血转化发病过程。研究证实：出血性转化的一个主要标志是血细胞渗出血管壁，这个出血性转化的过程与血管壁完整性的破坏相关联。在保持血管壁完整性方面有两个解剖和功能方面的屏障^[28]。①血脑屏障：包括毛细血管的基底膜和内皮细胞间的紧密连接。血供丧失时，血脑屏障完整性受损。缺血后最初几小时微血管内皮上白细胞黏附受体的出现和微血管完整性的改变，提示缺血早期微血管的激活和血管生成的发生。内皮功能障碍可导致脑缺血早期通透性增加，致血浆成分的外渗和水肿形成。②细胞外基质(基底层)：细胞外基质是连接内皮细胞和附近细胞层以及平滑肌细胞的一种特殊成分，由Ⅳ型胶原、层黏连蛋白(laminin)、纤维结合蛋白、entactin、血小板凝血酶敏感蛋白、各种各样的肝素硫酸软骨素蛋白多糖组成。细胞外基质成分的降解可导致细胞水肿、死亡及丧失生存力，是导致出血性转化的重要原因。由此推断，脑缺血再灌注和血脑屏障通透性改变共同参与出血性转化的发生。
3.3 大鼠脑组织基质金属蛋白酶9表达与梗死后出血转化基质金属蛋白酶9属于基质金属蛋白酶家族，且是其家族中目前发现分子量最大、表达最多的蛋白酶，属于明胶酶，从其N端至C端依次为信号肽、前肽、催化区(含高度保守的锌结合位点、绞链区、血液结合素区)，在其催化区还含3个重复的Ⅱ型纤维连接蛋白，这些重复结构作用于明胶和胶原而发挥其催化作用。其主要作用是通过降解Ⅳ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、明胶、纤维连接蛋白等^[29-31]，Rosenberg等[31]于鼠脑注射明胶酶的实验中较早注意到缺血与基质金属蛋白酶的关系，并认为由于明胶酶的作用使得血脑屏障破坏，产生继发性组织损伤，这一结论在以后的研究中得到了进一步的证实。Fujimura等^[29]用酶谱法研究小白鼠脑缺血早期基质金属蛋白酶9的表达时发现，基质金属蛋白酶9于梗死4 h出现，与血脑屏障的开放时间一致。也有学者研究认为活性基质金属蛋白酶9于血管闭塞后3 h即可检测到。Romanic等^[30]则用含明胶酶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)酶谱法检测大鼠大脑中动脉梗死后6 h-30 d基质金属蛋白酶的脑内表达与活性，发现卒中 6 h可检测到基质金属蛋白酶9活性，卒中后12 h明显升高，24 h表达最多。
基质金属蛋白酶9又称明胶酶B^[31](gclatinase)，是一种相对分子质量为92 000的基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶9的激活与表达失控与众多病理改变如血管重构，急性冠脉综合征，动脉瘤和肿瘤转移有关。脑缺血诱导基质金属蛋白酶9表达升高的确切机制目前尚不清楚。多数学者认为中性白细胞、内皮细胞是脑梗死后早期表达基质金属蛋白酶9的细胞，受炎性递质的刺激，小胶质细胞也能产生^[32]；晚期表达则见于巨噬细胞，主要参与组织修复。脑缺血后组织产生一系列神经化学方面变化如炎症递质、急性蛋白或细胞因子等，作用于基质金属蛋白酶9基因的启动因子，从而诱导基质金属蛋白酶9基因表达增加。许宏伟等^[33]用鼠自体血注入其脑内制模成功后发现，脑出血6 h后基质金属蛋白酶9表达即显著升高，24 h达高峰，并推测基质金属蛋白酶9在急性期参与了脑水肿的形成。同时基质金属蛋白酶9也是脑缺血后继发性损伤的重要原因之一。许多研究显示无论是在脑梗死动物模型中，还是在临床研究病例中，脑梗死后早期脑组织内或外周血中基质金属蛋白酶9含量迅速上升，呈现出上升至最高峰然后下降的动态过程，并且造成血脑屏障的通透性增加和血脑屏障的破坏、脑水肿的产生及继发性脑损伤^[34]；而使用基质金属蛋白酶9抑制剂、抗体或者基因敲除都能有效减少脑损伤的程度，如梗死灶减小、神经功能缺损程度减轻等。Heo等^[35]在非灵长类动物的研究结果显示基质金属蛋白酶9与梗死后出血转化密切相关；Lapchak等^[36]在兔栓塞性脑缺血模型上使用基质金属蛋白酶抑制剂(BB-94)能减少组织型纤维蛋白酶原激动剂(tPA)引起的出血。本实验研究发现缺血12 h再灌注24 h，缺血24 h再灌注24 h，缺血48 h再灌注24 h与持续缺血36，48，72 h组及缺血12 h前再灌注组比较基质金属蛋白酶9表达明显升高。在缺血再灌注组内基质金属蛋白酶9表达持续增高，在缺血48 h灌注24 h达到最高，且此变化与大鼠神经功能评分呈明显负相关。表明基质金属蛋白酶9可能参与了出血转化及脑损伤。
以上研究说明基质金属蛋白酶9与出血转化有明确的关系。其出血机制可能与基质金属蛋白酶9破坏血脑屏障通透性有关：血脑屏障是由中枢神经系统血管内皮细胞、内皮细胞之间的紧密连接、基底膜以及毛细血管基底膜外的星形胶质细胞终足构成的，其中血管内皮细胞及其紧密连接是最重要的形态学基础。脑梗死时基质金属蛋白酶9主要表达于血管内皮细胞，基底膜是包绕微血管内皮细胞的一种特殊形式的细胞外基质，主要由Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、纤黏连蛋白构成，这些都是基质金属蛋白酶9的酶作用底物，这些基底膜成分的蛋白水解将导致血脑屏障完整性的破坏和血管源性脑水肿^[37]。构成血管内皮细胞之间的紧密连接的蛋白质分子，包括膜周蛋白ZO-1是基质金属蛋白酶9的底物^[38]，Asahi等^[39]的研究中，Western印迹法显示ZO-1在脑梗死后明显减少，光密度法分析显示脑缺血24 h时，ZO-1减少了30%，而在基质金属蛋白酶9基因敲除组，ZO-1没有明显的减少。同时，Rosell等^[40]研究表明：基于基质金属蛋白酶9可以降解包括Ⅳ型胶原在内的基底膜的主要成分，基质金属蛋白酶9破坏基底膜的完整性就成为脑梗死后出血转化发生的始动因素。Kim等^[41]实验发现在小鼠一侧纹状体注射线粒体毒素3-硝基苯丙烯酸致其受损后2 h基质金属蛋白酶9的表达较对侧增高，并持续增高达24 h。且4 h后基质金属蛋白酶9的表达和激活与血脑屏障通透性增高一致。Gursoy-Ozdemir等^[42]发现血浆蛋白的渗漏与脑水肿形成同时发生，而在没有基质金属蛋白酶9的大鼠中没有发现蛋白质渗漏，提示在血脑屏障破坏中有基质金属蛋白酶9形成。此外，充分表达铜/锌过氧化物歧化酶的转基因小鼠分别与野生型同窝出生鼠比较，随着对基质金属蛋白酶9的免疫反应性的降低，纹状体损害范围的大小和水肿程度都降低；而缺乏铜/锌过氧化物歧化酶的基因敲除鼠明显显示出更大的水肿，由此认为基质金属蛋白酶9的早期表达与激活与早期血脑屏障的破坏有关。本实验同样证明基质金属蛋白酶9表达与神经功能评分呈负相关。且缺血再灌注组中随缺血时间的延长基质金属蛋白酶9的表达明显增高，缺血12 h以后再灌注各组与持续脑梗死对应时间点相比基质金属蛋白酶9的表达明显增高，间接表明基质金属蛋白酶9表达与出血转化有关。
结论：①采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，在此基础上通过延长再灌注时间窗来制造出血转化模型，本实验发现在缺血12 h以后尤其是48 h以后再灌注容易发生出血转化。②基质金属蛋白酶9表达在缺血再灌注组内随时间延长而升高，缺血12 h以后再灌注24 h较对应相同缺血时间后非灌注组基质金属蛋白酶9表达明显升高，与出血转化发生率变化趋势一致，说明基质金属蛋白酶9可能参与出血性转化发生。

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