不同生长因子对脂肪干细胞生物学行为的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (19): 3010-3016.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.010

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不同生长因子对脂肪干细胞生物学行为的影响

高洁¹，王明国²，杨帅¹，李雪¹，杨世茂²，李秀梅³，刘金盼³

¹潍坊医学院口腔医学院，山东省潍坊市 261053；²济南市中心医院口腔科，山东省济南市 250013；³济南市市中区人民医院口腔科，山东省济南市 250002

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 王明国，副教授，硕士生导师，济南市中心医院口腔科，山东省济南市 250013
作者简介:高洁，女，1987年生，山东省日照市人，汉族，潍坊医学院在读硕士，主要从事口腔种植方面的研究。
基金资助:
山东省科技发展项目(2014GSF11804)

Effects of different growth factors on biological behaviors of adipose tissue-derived stem cells

Gao Jie¹, Wang Ming-guo², Yang Shuai¹, Li Xue¹, Yang Shi-mao², Li Xiu-mei³, Liu Jin-pan3

¹School of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China; ²Department of Stomatology, Jinan Central Hospital, Jinan 250013, Shandong Province, China; 3Department of Stomatology, People’s Hospital of Shizhong District, Jinan 250002, Shandong Province, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Wang Ming-guo, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Stomatology, Jinan Central Hospital, Jinan 250013, Shandong Province, China
About author:Gao Jie, Studying for master’s degree, School of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Development Program of Shandong Province, No. 2014GSF11804

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨量不足限制了口腔种植修复的广泛应用，如何促进干细胞的迁移、黏附和增殖进而促进内源骨再生成为研究的关键点。
目的：观察不同生长因子对体外培养兔脂肪干细胞迁移、黏附和增殖的影响，筛选出最佳的组合因子。
方法：无菌切除兔腹股沟处的白色脂肪组织，采用酶消化法培养脂肪干细胞，取第3代细胞分为5组进行干预，分别为转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB组(组1)，血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组2)，转化生长因子β1+血管内皮生长因子组(组3)，转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组4)和空白对照组。采用Transwell小室法检测细胞的迁移能力，黏附实验检测细胞的黏附能力，CCK-8法检测细胞的增殖能力。
结果与结论：Transwell实验显示，4组间迁移细胞数差异有显著性意义(P < 0.05)，其中，转化生长因子β1(2 μg/L)+血小板源性生长因子AB(10 μg/L)+血管内皮生长因子(10 μg/L)组(组4)迁移细胞数最多，显著促进了脂肪干细胞的迁移。黏附实验结果显示，4组间黏附细胞数差异有显著性意义(P < 0.05)，其中转化生长因子β1+血管内皮生长因子组(组3)黏附细胞数最多，显著促进了脂肪干细胞的黏附。CCK-8结果显示，在不同的时间点(1，3，5，7 d)，各因子组合组吸光度值较对照组均显著增高(P < 0.05)，其中血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组2)递增的吸光度值最大，显著促进了兔脂肪干细胞的增殖。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 转化生长因子, 血小板源性生长因子AB, 血管内皮生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Bone deficiency restricts the extensive use of oral implant restoration. How to promote stem cell migration, adhesion and proliferation so as to promote endogenous bone regeneration becomes the key of research.
OBJECTIVE: To observe the effects of different growth factors on the migration, adhesion and proliferation of rabbit adipose tissue-derived stem cells cultured in vitro and to screen the optimal combined factors.
METHODS: The inguinal adipose tissues of rabbits were cut under aseptic conditions and primary adipose tissue-derived stem cells were cultured by enzyme digestion method. Passage 3 cells were randomly divided into
five groups: transforming growth factor β1+platelet-derived growth factor AB group (group 1), platelet-derived growth factor AB+vascular endothelial growth factor group (group 2), transforming growth factor β1+vascular endothelial growth factor group (group 3), transforming growth factor β1+platelet-derived growth factor AB+vascular endothelial growth factor group (group 4), and blank control group. In vitro cell migration ability was examined by Transwell chamber. Cell proliferation and adhesion abilities were examined by cell counting kit-8 and cell adhesion assay, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Results from the Transwell test showed that the migration number of rabbit adipose tissue-derived stem cells showed significant differences among the former four groups (P < 0.05), which was highest in the group 4 that significantly promoted the migration of adipose tissue-derived stem cells. In the cell adhesion assay, there were significant differences in the number of adherent cells among the former four groups (P < 0.05), and the group 3 showed the most adherent cells that dramatically improved the adhesion of adipose tissue-derived stem cells. Compared with the blank control group, the absorbance values in the groups 1-4 were significantly higher at days 1, 3, 5, 7 (P < 0.05), and the group 2 showed the highest absorbance value, indicating the combination of platelet-derived growth factor AB and vascular endothelial growth factor significantly promoted the proliferation of rabbit adipose tissue-derived stem cells.

Key words: Adipose Tissue, Stem Cells, Cell Movement, Cell Adhesion, Cell Proliferation, Transforming Growth Factor beta1, Platelet-Derived Growth Factor, Vascular Endothelial Growth Factors

中图分类号:

R394.2

高洁，王明国，杨帅，李雪，杨世茂，李秀梅，刘金盼. 不同生长因子对脂肪干细胞生物学行为的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 3010-3016.

Gao Jie, Wang Ming-guo, Yang Shuai, Li Xue, Yang Shi-mao, Li Xiu-mei3, Liu Jin-pan. Effects of different growth factors on biological behaviors of adipose tissue-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 3010-3016.

图/表（结果） 4

2.1 脂肪干细胞的鉴定结果
成骨诱导结果：在倒置显微镜下观察，成骨诱导第4天左右，脂肪干细胞的形态开始发生变化，由原来的长梭形渐变为立方形或矮柱状，接近成骨细胞的形态；成骨诱导1周后可见细胞外基质中有少量类似晶体状的沉淀，随着成骨诱导时间的延长，晶体状的沉淀物逐渐聚集增多；成骨诱导21 d后茜素红染色，可见明显的红色团块形成即钙结节形成(图1A)。
成脂诱导结果：成脂诱导三四天，脂肪干细胞的形态开始发生变化，由原来的长梭形渐变为多边形或类圆形，与脂肪细胞的形态相近，有一部分脂肪干细胞的胞质内出现小的脂滴类似物，随着成脂诱导时间的延长，胞质内脂滴类似物的数量逐渐增多且逐渐融合成大脂滴类似物；成脂诱导21 d后油红O染色，胞质内呈现红染的大脂滴(图1B)。

2.2 不同组合因子对脂肪干细胞迁移的影响 Transwell小室结果显示，脂肪干细胞在不同组合因子的作用下，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，其中转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组4)迁移细胞数最显著，转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB组(组1)迁移细胞数较血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组2)和转化生长因子β1+血管内皮生长因子组(组3)显著(P < 0.05)，见表1和图2。

2.3 不同组合因子对脂肪干细胞黏附的影响黏附实验结果显示，脂肪干细胞在不同组合因子的作用下，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，各因子组合组较对照组均显著增高(P < 0.05)，其中转化生长因子β1+血管内皮生长因子组(组3)黏附细胞数明显高于转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB组(组1)和血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组2)，与转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组4)的黏附细胞数相近，见表2。

2.4 不同组合因子对脂肪干细胞增殖的影响 CCK-8实验结果显示，在不同的时间点(1，3，5，7 d)，各组合组吸光度值较对照组均显著增高，其中血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因组(组2)递增的吸光度值明显高于转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB组(组1)和转化生长因子β1+血管内皮生长因子组(组3) (P < 0.05)，与转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组4)递增的吸光度值相近，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

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引言

材料方法

设计：空白对照，细胞实验。
时间及地点：实验于2014年5月至2015年2月在济南市中心医院实验室完成。
材料：
实验动物：3月龄雌性新西兰大白兔5只，体质量2.0-2.5 kg，由青岛市市立医院动物中心实验室提供，许可证号：SCXK(京)2009-0017。

不同生长因子干预后脂肪干细胞生物学行为检测所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
特级胎牛血清、α-MEM培养液、 Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶	Gibco，美国
磷酸盐缓冲液	HyClone，美国
链霉素、青霉素	华北制药股份有限公司
血小板源性生长因子AB、转化生长因子β1、血管内皮生长因子	Peprotech，美国
Transwell小室	Corning，美国
CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒	Dojindo，日本
DAPI染液、40 g/L多聚甲醛	上海碧云天生物技术研究所
酶标检测仪	上海精宏实验设备有限公司
OLYMPUS CX71倒置相差荧光显微镜	Olympus，日本

实验方法：
脂肪干细胞的培养：无菌切除兔腹股沟处的白色脂肪组织并置于含有双抗的D-Hank’s液中。将脂肪组织中的筋膜和毛细血管剥离干净，并将脂肪组织剪碎，收集于15 mL的离心管中，加入2倍体积的0.2%Ⅰ型胶原酶，放在37 ℃恒温摇床中振荡消化0.5 h，加入等体积的α-MEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清和双抗)中和消化。选取200目的细胞筛网置于50 mL的离心管上，过滤脂肪组织的消化液，1 000 r/min离心10 min，吸弃混有残留的脂肪组织悬液，加入细胞培养基并将细胞悬液吹打均匀，接种于25 cm²细胞培养瓶中，置于37 ℃含体积分数为5%CO2的细胞培养箱中培养，待其贴壁约24 h首次更换细胞培养基，以后每3 d更换1次。每天于倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况，待细胞长满瓶底约80%时，用0.25%胰酶消化，按1︰3传代培养，取第3代兔脂肪干细胞用于实验。
脂肪干细胞的鉴定：
成骨诱导：取生长状态良好的第3代脂肪干细胞，待其长满至80%时，用0.25%胰酶消化收集细胞。将细胞以3×107 L-1的浓度接种于经0.1%明胶涂料预处理过的6孔板中，向每孔中加入2 mL细胞培养基，置于培养箱中培养24 h后吸弃培养基，向每孔中加入2 mL成骨诱导液(含有体积分数为10%胎牛血清和双抗的α-MEM培养基、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.1 μmol/L 地塞米松、50 mg/L抗坏血酸)，每3 d换诱导液1次，诱导21 d，用PBS清洗后经40 g/L多聚甲醛固定，茜素红染色，置于倒置相差显微镜下观察并拍照。
成脂诱导：取生长状态良好的第3代脂肪干细胞，待其长满至80%时，用0.25%胰酶消化收集细胞，将细胞以2.1×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板中，置于37 ℃含体积分数为5%CO2的细胞培养箱中培养，常规换液。当细胞长满瓶底后吸弃细胞培养基，换成脂诱导液A(含双抗的α-MEM培养液、200 μmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松、 10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)诱导3 d，吸弃诱导液A，换保持液B(含双抗的α-MEM培养液、10 mg/L胰岛素)培养1 d，再换用诱导液A进行诱导，如此重复4个循环后用成脂诱导液A诱导5 d，即诱导3周后，用油红O染色并拍照。
Transwell法：采用含有滤膜孔径为8 μm的24孔Transwell小室来研究不同生长因子组合对兔脂肪干细胞迁移的影响。取生长状态良好的第3代脂肪干细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，用不含有胎牛血清的α-MEM培养液制成每孔密度为1×105个细胞悬液。实验组：每孔加 200 μL的细胞悬液于Transwell小室的上室，Transwell的下室中加入α-MEM培养液，每孔600 μL，以及分别加入2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血小板源性生长因子AB(组1)，10 μg/L血小板源性生长因子AB+10 μg/L血管内皮生长因子(组2)，2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血管内皮生长因子(组3)，2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血小板源性生长因子AB+10 μg/L血管内皮生长因子(组4)，设空白对照组(加无血清培养液)，然后置于37 ℃含体积分数为5%CO2的细胞培养箱中培养，并在倒置显微镜下实时观察细胞迁移的情况。培养24 h后，从细胞培养箱中取出含有Transwell小室的24孔板，吸弃上室中的培养液，用棉棒轻轻擦拭小室细胞滤膜上表面的细胞，残余的细胞碎片用PBS冲洗2次，40 g/L多聚甲醛固定，DAPI染色，放置于倒置荧光显微镜下观察。每孔随机选取5个无重叠的视野照相，并于高倍镜下计数穿过滤膜下表面的细胞数。
黏附实验：向24孔培养板中分别加入混有不同生长因子组合的培养液，4 ℃放置16 h，PBS冲洗3遍，用含有3% BSA的PBS室温封闭2 h，PBS冲洗2遍。取生长状态良好的第3代脂肪干细胞，0.25%的胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，用含有体积分数为2%胎牛血清和3% BSA的α-MEM培养基重悬计数，以每孔1×105个细胞密度接种在预处理的24孔板上。向实验孔中分别加入2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血小板源性生长因子AB(组1)，10 μg/L血小板源性生长因子AB+10 μg/L血管内皮生长因子(组2)，2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血管内皮生长因子(组3)，2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血小板源性生长因子AB+10 μg/L血管内皮生长因子(组4)，设空白对照组(加无血清培养液)，放置细胞培养箱中孵育4 h。常规消化后于倒置显微镜下细胞计数。
增殖实验：采用CCK-8法研究不同生长因子组合对兔脂肪干细胞增殖的影响。取生长状态良好的第3代脂肪干细胞，待其长满至80%时，用0.25%胰酶消化收集细胞，以每孔2×103个细胞种于96孔培养板中，每孔100 µL，设3个复孔，放入细胞培养箱中常规培养24 h，PBS冲洗2遍去除未贴壁的细胞，为使细胞状态同步化，换不含胎牛血清的α-MEM培养液培养24 h，实验组再换成含2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血小板源性生长因子AB(组1)，10 μg/L血小板源性生长因子AB+10 μg/L血管内皮生长因子(组2)，2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血管内皮生长因子(组3)，2 μg/L转化生长因子β1+10 μg/L血小板源性生长因子AB+10 μg/L血管内皮生长因子(组4)的α-MEM培养液(不含胎牛血清)，空白对照组为不含胎牛血清的α-MEM培养液。每次检测之前吸弃原培养液，重新混匀加入100 µL α-MEM培养液和10 µL CCK-8液。将96孔培养板置于细胞培养箱中培养2 h后，使用酶联免疫检测仪在450 nm波长检测各孔的吸光度值，实验重复3次，连续检测7 d。
主要观察指标：①倒置荧光显微镜下观察迁移细胞数。②倒置显微镜下观察黏附细胞数。③酶联免疫检测各组吸光度值随时间的变化。
统计学分析：应用 SPSS 13.0统计软件完成数据的统计。数据用x(_)±s表示，采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

内源性组织工程骨依赖于种子细胞在细胞因子复合支架材料诱导下发生归巢、黏附、增殖和分化，从而促进骨组织的再生修复。本实验在体外观察不同生长因子组合对内源性组织工程骨再生的前期影响，从而筛选出最佳因子组合，为成骨奠定基础。研究表明，体内存在的脂肪干细胞为骨组织再生的内源性种子细胞来源^[9-10]。本实验对酶消化法培养的脂肪干细胞进行了多向诱导分化，证实了体外分离培养的脂肪干细胞为间充质来源的脂肪干细胞。
干细胞迁移至损伤区域时需要降解细胞外基质和基底膜，而基质金属蛋白酶能降解细胞外基质，并参与调节细胞外基质的动态平衡。Ries等^[11]认为间充质干细胞表达基质金属蛋白酶2，3，10，11，13和膜型基质金属蛋白酶1，其中基质金属蛋白酶2和膜型基质金属蛋白酶1在间充质干细胞迁移的过程中发挥重要作用。膜型基质金属蛋白酶1能够激活其他的基质金属蛋白酶，如基质金属蛋白酶2，而对细胞外基质的降解起到协同的作用^[12]。研究认为转化生长因子β1能够通过上调膜型基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶2的表达而提高间充质干细胞的迁移能力^[11]。Chang等[^13]研究表明，转化生长因子β1、血小板源性生长因子AB在调节整合素的表达及成纤维细胞向创伤区的迁移中发挥了重要作用。血管内皮生长因子则通过PI3K/Akt途径等多种方式促进间充质干细胞的迁移^[14-15]。血小板源性生长因子AB为一种公认的促有丝分裂和趋化因子，可在创伤骨组织中高度表达，对成骨细胞有趋化和促增殖的作用，并促进胶原蛋白的合成和促进破骨细胞的吸收，进而促进新骨的形成。本文依据上述学者的研究成果，利用3种因子单独作用时最佳的浓度进行了因子间的组合，以期筛选出促进脂肪干细胞迁移的最佳组合。Transwell实验结果显示，脂肪干细胞在不同组合因子的作用下，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，其中转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB组(组1)迁移细胞数较血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组2)和转化生长因子β1+血管内皮生长因子组(组3)显著，转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组4)迁移细胞数最显著，此组合恰恰包含了公认的促迁移因子，故组4的促进干细胞迁移作用是一个必然，而且实验结果也表明，3种因子的联合应用显著地增强了脂肪干细胞的迁移能力，提示了转化生长因子β1、血小板源性生长因子AB、血管内皮生长因子之间具备协同作用，但其详细的迁移机制尚需进一步探讨。
脂肪间充质干细胞作为组织工程骨研究的新兴种子细胞，其与载体的黏附是基础，决定性影响后续发生的增殖和成骨分化^[16]。细胞的黏附通常包括早期的理化性黏附和晚期的生物学黏附。理化性质的黏附发生于黏附的早期阶段，由范德华力和离子力的作用使得细胞能够迅速与载体发生暂时性的贴附。而生物学黏附则是由细胞膜蛋白、细胞外基质及细胞骨架蛋白共同起作用将载体与细胞界面的作用信号传递至胞内，进而调控了细胞基因的表达^[17]。生物学黏附与穿膜受体整合素、细胞骨架蛋白及细胞外基质密切相关。这一过程主要通过激活整合素介导的信号通路得以实现，伴随着细胞的铺展、肌动蛋白的骨架重排、黏着斑的形成^[18]。FAK是一种具有酪氨酸激酶活性的蛋白质分子，磷酸化的FAK是影响生物学黏附的重要信号分子^[19]。PaxiIIin参与了FAs的组装和整联蛋白介导的信号转导，当细胞与胞外基质蛋白发生结合时，整联蛋白的聚集改变了其胞质区的构象，促进了整联蛋白的尾部和FAK的N末端的结合，而暴露的FAK的Y397位点，直接激活了FAKt。活化的FAK又使得paxillin发生酪氨酸磷酸化，4个酪氨酸的磷酸化位点中的Y31和Y118位点与细胞的迁移和细胞的黏附密切相关^[20]。FAK是FAs的主要构成蛋白，作为胞质非受体蛋白酪氨酸激酶，它不仅能够传递整联蛋白激活的信号，还可以介导许多生长因子与其受体结合而传递信号，激活胞内的JNK、MAPK、PI3K等信号通路，来调节细胞的黏附^[21]。研究证明，血小板源性生长因子通过减慢黏着斑的组装进程和抑制应力纤维带形成，抑制paxillin的酪氨酸磷酸化，从而抑制平滑肌细胞的黏附^[22]。转化生长因子β1则通过刺激整合素链接激酶、PINCH蛋白以及桩蛋白等的表达来增加整合素β1及黏着斑激酶的活性，从而促进细胞的黏附^[23-24]。血管内皮生长因子通过促进FAK和paxillin的酪氨酸磷酸化，募集磷酸化的黏着斑蛋白至新生的黏着斑处，促进黏着斑的组装，从而加快细胞黏附的进程^[25]。此外，血管内皮生长因子通过其特异性的受体激活了其他的信号通路^[26]，包括细胞骨架元件和胞外信号调节激酶等，诱导actin聚合形成应力纤维以及加快了胞体腹侧面黏着斑的形成速度，进而使得细胞骨架提前形成，最终促进了细胞的黏附及铺展^[27]。黏附验结果显示，在不同的组合因子的作用下，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，其中转化生长因子β1+血管内皮生长因子组(组3)的黏附细胞数较血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组2)和转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB组(组1)显著，与转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组4)黏附细胞数相近，提示转化生长因子β1+血管内皮生长因子的促黏附作用优于转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB，血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子。
研究表明，血小板源性生长因子能够促进间充质干细胞的细胞周期从G0/G1期向S期的转换，上调cyclinD1的表达和Rb的磷酸化^[28-29]。血管内皮生长因子为二聚体糖蛋白，通过旁分泌或是自分泌与血管内皮细胞表面的受体结合，促进了内皮细胞的增殖，并诱导新血管的形成^[30]。Lee等[31]认为转化生长因子β1是一种多功能因子，抑制细胞的生长，参与细胞的迁移和分化。Zhang等^[32]研究了转化生长因子β1对肾足细胞的影响，认为随着浓度的增加，对细胞的抑制作用越来越明显。CCK-8法是一种广泛应用于检测细胞增殖活性的方法，通过使用酶标仪在450 nm波长测定吸光度值即可反映活细胞的数量。CCK-8实验结果显示，在不同的时间点(1，3，5，7 d)，各组间差异有显著性意义(P < 0.05)，结果提示血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组2)促增殖活性作用优于转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB组(组1)和转化生长因子β1+血管内皮生长因子组(组3)(P < 0.05)，与转化生长因子β1+血小板源性生长因子AB+血管内皮生长因子组(组4)的促增殖活性的作用相近，但其详细的分子机制尚需进一步探讨。
综上所述，通过体外筛选出促进间充质干细胞迁移、黏附、增殖的适宜因子组合，为后续生长因子复合支架材料构建组织工程骨提供了理论依据。

不同生长因子对脂肪干细胞生物学行为的影响

Effects of different growth factors on biological behaviors of adipose tissue-derived stem cells

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