构建大鼠白细胞介素1β基因shRNA腺病毒载体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.024

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2923-2927.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.024

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构建大鼠白细胞介素1β基因shRNA腺病毒载体

赵晓龙1，陈建平2，张宇3，李航1，刘艳芳1，高文燕1，韩磊1，邓亚南1

1山西医科大学，山西省太原市 030001；2山西医学科学院山西大医院麻醉科，山西省太原市 030032；3山西医科大学生理学教研室，山西省太原市 030001

收稿日期:2015-02-08 出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
通讯作者: 陈建平，博士，副主任医师，硕士生导师，山西医学科学院山西大医院麻醉科，山西省太原市 030032 并列通讯作者：张宇，博士，副教授，硕士生导师，山西医科大学生理学教研室，山西省太原市 030001
作者简介:赵晓龙，男，1988年生，山西省忻州市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事神经病理性疼痛机制方面的研究。
基金资助:
山西省自然科学基金(2010011049-1)

Construction of a recombinant adenovirus vector expressing shRNA targeting interleukin-1beta gene in rats

Zhao Xiao-long1, Chen Jian-ping2, Zhang Yu3, Li Hang1, Liu Yan-fang1, Gao Wen-yan1, Han Lei1, Deng Ya-nan1

1Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Anesthesiology, Shanxi Academy of Medical Sciences, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China; 3Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2015-02-08 Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
Contact: Chen Jian-ping, M.D., Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Anesthesiology, Shanxi Academy of Medical Sciences, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China Corresponding author: Zhang Yu, Ph.D., Associate professor, Master’s supervisor, Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Zhao Xiao-long, Studying for master’s degree, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shanxi Province, No. 2010011049-1

摘要/Abstract

摘要：

背景：特异性下调白细胞介素1β蛋白的表达可以有效缓解外周神经损伤后病理性疼痛。与siRNA相比，shRNA可以更加稳定、高效地抑制目的基因的表达，但是单纯的shRNA无法高效地进入靶细胞中发挥对目的基因的下调作用，而腺病毒载体具有宿主范围广、感染效率高以及能够在宿主细胞中稳定表达等特点。
目的：构建大鼠白细胞介素1β基因的shRNA腺病毒载体并检测其对目的基因表达的影响。
方法：根据NCBI查询获得的大鼠白细胞介素1β基因序列设计3条siRNA并合成相应的shRNA，分别为shRNA1、shRNA2、shRNA3。采用3’和5’单链退火得到的shRNA片段与经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pHBAd/U6/GFP干扰载体连接，构建白细胞介素1βshRNA腺病毒载体穿梭质粒。测序后将穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293细胞，进行白细胞介素1β基因的shRNA腺病毒载体(rAd/shRNAs)的包装与扩增，分别为rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3。将rAd/shRNAs感染大鼠H9C2细胞，使用荧光显微镜观察其感染效率，采用Western Blot 检测rAd/shRNAs对目的基因表达的影响。
结果与结论：测序结果显示白细胞介素1β基因的3条shRNA腺病毒载体穿梭质粒中的序列分别与所设计的3条shRNA序列相同；并成功构建了大鼠白细胞介素1β基因的shRNA腺病毒载体(rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3)。rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、 rAd/shRNA3均可以下调白细胞介素1β的表达，其中rAd/shRNA2的下调效果最明显。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 基因病毒载体及相关因子模型, 神经病理性疼痛, 白细胞介素1β, 基因表达, RNA干扰；小干扰RNA, 短发卡RNA, 腺病毒载体, 载体质粒, HEK293细胞, 大鼠H9C2细胞, 山西省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Specific down-regulation of interleukin 1 beta (IL-1β) may alleviate the pain behaviors effectively after peripheral nervous injury. Compared with small interference RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA) could inhibit the expression of target gene more stably and efficiently. However, simple shRNA could not enter target cells to down-regulate target gene efficiently. Adenovirus vectors have wide host range, high infection efficiency and stable expression in host cells.
OBJECTIVE: To construct recombinant adenovirus vector expressing shRNA targeting IL-1β gene and detect its effect on the expression of target gene.
METHODS: Three siRNAs were designed on the basis of the nucleotide sequence of IL-1β obtained from NCBI
and then three shRNAs (shRNA1, shRNA2 and shRNA3) were synthesized. The annealed shRNA product and adenovirus vector pHBAd/U6/GFP digested by BamH I and EcoR I were connected to construct the recombinant adenovirus vector shuttle plasmid expressing shRNA targeting IL-1β. After sequencing, HEK 293 cells were co-transfected by the shuttle plasmid and skeleton vector, and three recombinant adenovirus vector expressing shRNA targeting IL-1β (rAd/shRNA1, rAd/shRNA2 and rAd/shRNA3) were packaged and amplified. Rats H9C2 cells were infected by recombinant adenovirus vector expressing shRNA targeting IL-1β and fluorescence microscope was used to observe the infection efficiency. The effect of recombinant adenovirus vector expressing shRNA targeting IL-1β on the expression of target gene was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The sequencing results showed that the sequences of three shRNAs adenovirus vector shuttle plasmid were consistent with the sequences of three designed shRNAs. rAd/shRNA1, rAd/shRNA2 and rAd/shRNA3 were constructed successfully. rAd/shRNA1, rAd/shRNA2 and rAd/shRNA3 could down-regulate the expression of IL-1β in rat H9C2 cells and the down-regulation effect of rAd/shRNA2 was the most significant.

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Key words: Pain, Interleukin-1beta, RNA Interference

中图分类号:

R318

赵晓龙，陈建平，张宇，李航，刘艳芳，高文燕，韩磊，邓亚南 . 构建大鼠白细胞介素1β基因shRNA腺病毒载体[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2923-2927.

Zhao Xiao-long, Chen Jian-ping, Zhang Yu, Li Hang, Liu Yan-fang, Gao Wen-yan, Han Lei, Deng Ya-nan . Construction of a recombinant adenovirus vector expressing shRNA targeting interleukin-1beta gene in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2923-2927.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

白细胞介素1β是星形胶质细胞活化后释放的炎性因子，在外周神经损伤后，白细胞介素1β通过PKA、PKC等细胞信号转导途径参与了神经病理性疼痛的产生及发展过程。使用白细胞介素1β特异性的拮抗剂可以明显下调其在体内的表达水平，有效缓解疼痛反应^[1-4]，而目前使用的大多数白细胞介素1β拮抗剂特异性较低、作用时间较短，很大程度上限制了其在临床上的应用。因此，需要寻找一种特异性较高的白细胞介素1β的拮抗剂。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA(double strand RNA，dsRNA)介导的特异性的基因沉默技术。短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是根据小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)的序列设计合成的类似双链结构的短发卡状RNA，其中包括2个短的反方向重复序列，中间由一茎环结构连接。在随表达载体进入体内时，可以由Dicer酶切割成siRNA，随后参与对目的基因的特异性沉默。与siRNA相比，shRNA在随载体进入细胞时的稳定性更高，并且shRNA在宿主细胞内可以由单个模板快速合成大量的shRNA，使其对目的基因的沉默作用更加持久。

目前有关RNAi技术的研究中，主要使用的载体有慢病毒、腺病毒和腺相关病毒^[5-8]，此外还有少数研究使用非病毒载体^[9]。在这几种载体中，腺病毒载体是使用最广泛的载体，因为相比于其他的载体，腺病毒载体的宿主范围广、感染效率及安全性较高，并且能够在体内长时间复制。另外，在感染宿主细胞之后，腺病毒的基因组及其携带的外源基因不会整合到宿主细胞中，避免了因基因整合而引发潜在的基因突变和随机效应等，可控性高。因此本实验拟构建大鼠白细胞介素1β的shRNA腺病毒载体，并观察其基因沉默效应。

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材料方法

设计：观察性实验

时间及地点：实验于2013年1月至2014年3月在山西医科大学生理学实验室完成。

材料：

大鼠白细胞介素1β基因shRNA腺病毒载体的构建主要试剂及仪器：
细胞、试剂及仪器	来源
HEK293细胞、H9C2细胞、载体pHBAd/U6/GFP、Lipofiter脂质体	Hanbio
质粒试剂盒(Qiagen)	康为世纪
大肠杆菌菌株	Invitrogen
一抗、二抗	sigma
GAPDH抗体	Epitomics
荧光显微镜	Carl Zeiss公司

实验方法：

大鼠白细胞介素1β shRNA的构建：根据在NCBI中查询得到的大鼠白细胞介素1β基因的核苷酸序列。

设计其干扰序列如下：

siRNA1：CAA GTG GTA TTC TCC ATG A

siRNA2：ATG AAC AAC AAA AAT GCC TCG

siRNA3：ATT GCT TCC AAG CCC TTG ACT T

随后设计由茎环结构连接的shRNA，其序列如下：
shRNA1：	5’-AAT TCG CAA GTG GTA TTC TCC ATG ATG TGC TTT CAT GGA GAA TAC CAC TTG TTT TTT G-3'(正义链) 5’- GAT CCA AAA AAC AAG TGG TAT TCT CCA TGA AAG CAC ATC ATGGAG AAT ACC ACT TGC G -3’(反义链)
shRNA2：	5’AAT TCG ATG AAC AAC AAA AAT GCC TCG TGT GCT TCG AGG CAT TTT TGT TGT TCA TTT TTT G-3’(正义链) 5’-GAT CCA AAA AAA TGA ACA ACA AA A ATG CCT CGA AGC ACA CGA GGC ATT TTT GTT GTT CAT CG-3’(反义链)
shRNA3：	5’-AAT TCG ATT GCT TCC AAG CCC TTG ACT TTG TGC TTA AGT CAA GGG CTTGG AAGCAAT TT TTTTG-3’(正义链) 5’-GAT CCA AAA AAA TTG CTT CCA AGC CCT TGA CTT AAG CA C AAA GTC AAG GGC TTG GAA GCA ATC G-3’(反义链)

根据3条shRNA的序列分别设计其特异性引物，由上海桑尼生物合成PAGE胶纯化的oligo引物序列。采用3’和5’

单链退火获得目的片段shRNA。退火条件为95 ℃10 min，75 ℃ 10 min，55 ℃ 10 min，35 ℃ 10 min，15 ℃ 10 min。使用pHBAd/U6/GFP干扰载体(Hanbio)，BamHⅠ和EcoRⅠ(Fermentas)双酶切之后与处理好的目的片段shRNA连接，构建腺病毒载体穿梭质粒。转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(Invitrogen)后平板挑菌，37 ℃下250 r/min摇菌14 h，之后进行菌落PCR鉴定，阳性菌液送往上海桑尼生物技术有限公司测序。

构建大鼠白细胞介素1β基因shRNA腺病毒载体(rAd/shRNA)的过程：上述3条shRNA的腺病毒载体穿梭质粒(pHBAd/U6/shRNA1/GFP、pHBAd/U6/shRNA2/GFP和pHBAd/U6/shRNA3/GFP)分别转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，取处于对数生长期的菌液2 mL加入100 mL含有100 mg/L Amp的LB培养基中，37 ℃下300 r/min震荡摇菌过夜，提质粒。转染前1 d，将HEK293细胞置于DMEM+体积分数10%胎牛血清的培养基内，37 ℃下在含体积分数5% CO₂的培养箱中培养过夜。转染前2 h更换新鲜培养基，待细胞生长至底面积的80%-90%时，每个转染孔取2 μg白细胞介素1β基因的shRNA腺病毒载体穿梭质粒(pHBAd/U6/shRNA/GFP)和4 μg骨架质粒pHBAd/BGH，用300 μL DMEM培养液稀释，再取15 μL的Lipofiter脂质体，300 μL DMEM培养液稀释，室温下放置5 min。二者混合后室温下避光放置30 min，加入到HEK293细胞中。

转染6 h后更换新鲜培养基，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分发生病变并从底部脱落时进行收毒。将所有细胞及培养液收于15 mL离心管中，于-80 ℃冰箱保存。在干冰乙醇及37 ℃水浴反复冻融3次，3 000 r/min离心5 min，收集上清液，即为随后用于大量病毒扩增的第一代毒种(P1)。

腺病毒扩增时，从P1代病毒上清液中取2 mL转染感染一个75 cm细胞培养瓶的HEK293细胞(细胞密度保证90%以上)，余下的病毒上清液于-80 ℃作为毒种保存。腺病毒扩增2 d后待所有细胞脱落底面后即可进行收毒。将细胞与培养液一放入15 mL离心管，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL ST Buffer(DMEM培养液+体积分数10%胎牛血清+2.5%甘油)，votex混匀后于-80 ℃下保存备用。

腺病毒感染效率的鉴定：以密度为2×10⁵种植大鼠H9C2细胞至6孔板中，待细胞生长至60%的汇合度后，分别感染rAd/GFP和3个shRNA的腺病毒载体(rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3)，37 ℃下在含有体积分数5%CO₂的培养箱培养2 h，之后更换培养。36 h后于荧光显微镜下观察GFP的表达。

Western blot法检测rAd/shRNAs对目的基因表达的下调效果：取上述感染之后的大鼠H9C2细胞，分别加入100 μL RIPA蛋白裂解液，100 ℃煮沸5 min。5 000 r/min离心2 min，取上清，采用BCA法测定蛋白质浓度。以100 V的电压进行SDS-PAGE电泳2 h。电泳完毕后将凝胶转至PVDF膜，100 V恒压下转膜1.5 h，5%脱脂奶粉封闭。加一抗(1∶100稀释)和GAPDH抗体，4 ℃过夜。使用PBS漂洗10 min×3次，加荧光标记的二抗(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，PBS液漂洗10 min×3次，ECL化学发光液X射线片曝光显色。使用The Odyssey^® Infrared Imaging System 扫描荧光条带。使用Photoshop CS6.0软件计算蛋白条带的灰度值，GAPDH条带灰度值与白细胞介素1β条带灰度值的比值来表示白细胞介素1β蛋白的表达水平。

主要观察指标：3个rAd/shRNA对大鼠H9C2细胞的感染效率以及对白细胞介素1β蛋白表达水平的影响。

统计学分析：所有数据均采用x(_)±s表示，使用SPSS 20.0进行分析。组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

白细胞介素1β是一种由星形胶质细胞释放的促炎性细胞因子。在外周神经损伤或疾病中，白细胞介素1β可以通过PKA途径激活外周N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)，通过PKC途径激活辣椒素受体(TRPV1)，还可以通过随之参与了神经病理性疼痛的产生以及发展过程^[10-12]。有研究表明，使用曲马多、蔘总皂甘等可以下调白细胞介素1β的表达水平，可以有效缓解疼痛反应^[13-14]。但这些药物并非是白细胞介素1β的特异性拮抗剂，使得其在临床上的应用受到了很大的限制。因此，更多的研究倾向于寻找一种特异性较高的拮抗剂，但是目前这方面的研究仍然没有实质性的突破。

RNA干扰技术是一种由内源性或者外源性双链DNA介导的转录后水平的基因沉默技术^[15-17]。有研究表明，使用NMDA受体NR1亚基的siRNA可以特异性下调其表达水平，有效缓解由甲醛引起的疼痛反应^[18]。短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是根据siRNA设计的类似双链结构的RNA，相比于siRNA，其在随载体进入细胞时具有更高的内在稳定性，并且shRNA在细胞内可以由单个模板快速合成大量的shRNA，使用NMDA受体NR1亚基的shRNA可以对其产生较长时间的基因沉默，因此shRNA的沉默作用更加持久^[19]。在本实验中设计并合成了白细胞介素1β的shRNA腺病毒载体，将白细胞介素1β的shRNA导入靶细胞发挥其基因沉默作用。结果显示其可以明显下调宿主细胞内白细胞介素1β的表达。

siRNA或者shRNA直接转染宿主细胞的效率较低，因此需要借助一定的载体。载体有非病毒载体和病毒载体，非病毒载体的优点是对宿主细胞的不良反应较少，并且不会产生免疫反应，但是其转染效率较低，外源基因进入宿主细胞之后其表达也很短暂。病毒载体的优点是转染效率高，但具有感染性，可能引起机体产生免疫反应。

目前研究中使用的病毒载体主要有慢病毒载体、腺病毒载体以及腺相关病毒载体。有研究表明，Gli1基因在胰腺癌的发生中起着重要作用，构建Gli1基因的siRNA腺病毒载体对胰腺癌有一定的疗效^[20]。通过脑脊液注射以重组腺相关病毒为载体的超氧化物歧化酶的microRNA(miRNA)对肌萎缩性侧索硬化症有一定的治疗效果。有学者通过构建促红细胞生成素的shRNA慢病毒载体，强调了生物制药在未来的重要性^[21-23]。向新生小鼠腹腔内注射超氧化物歧化酶的shRNA腺相关病毒载体可以有效降低其在背根神经节中的表达，缓解其疼痛反应^[24]。由于腺病毒载体对宿主细胞的感染效率高，并且目前的第3代腺病毒载体缺失了除两端包装信号序列以外的所有病毒基因，其安全性以及高效性均得到较大的提升^[25]，所以本实验选择腺病毒作为白细胞介素1β基因及其shRNA的载体。实验过程中，通过荧光显微镜可以观察到腺病毒对宿主细胞的感染效率均很高。Western Blot结果显示构建成功的白细胞介素1β的shRNA腺病毒载体可以明显下调宿主细胞内白细胞介素1β的表达水平。

本实验选择HEK293细胞用于腺病毒载体的包装与扩增，其来源于人胚肾上皮细胞，由于其容易培养并且易于转染，而且可以提供腺病毒复制所需的E1基因。大鼠H9C2细胞是常见的细胞系，易于获得及感染，并且可以表达白细胞介素1β，所以在本实验中选择其用于检验腺病毒载体的感染效率以及其对白细胞介素1β基因表达的影响。

本实验中，将白细胞介素1β的3条rAd/shRNAs感染大鼠H9C2细胞之后，与rAd/GFP组相比，白细胞介素1β蛋白表达均下降，rAd/shRNA2对目的基因的下调效果最明显。这些结果说明白细胞介素1β的shRNA腺病毒载体构建成功，而且大鼠白细胞介素1β的shRNA腺病毒载体可以明显下调白细胞介素1β蛋白的表达水平。这为RNA干扰技术在神经病理性疼痛基因治疗领域的应用提供了一种有效的手段。

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