右美托咪定对脐血间充质干细胞向神经细胞分化的影响

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量研究证实右美托咪定在缺血再灌注损伤中具有显著的神经保护作用，但是其对神经系统的作用机制以及影响神经细胞功能的途径和方式鲜见报道。
目的：探讨右美托咪定对脐血间充质干细胞增殖及向神经细胞分化的影响。
方法：取第3代脐血间充质干细胞分为对照组、低浓度右美托咪定组(1 μg/L)和高浓度右美托咪定组(10 μg/L)，MTT法检测脐血间充质干细胞活性，Western blot法检测增殖期脐血间充质干细胞中ERK1/2磷酸化水平，免疫荧光法检测NeuN/DAPI、GFAP/DAPI和Nestin/DAPI双染细胞比例，观察细胞分化能力。
结果与结论：低浓度右美托咪定组干细胞活性及EKR1/2磷酸化水平较对照组明显增加(P < 0.05)；高浓度右美托咪定组干细胞活性及EKR1/2磷酸化水平较对照组及低浓度右美托咪定组明显降低(P < 0.05)；高、低浓度右美托咪定组中NeuN、GFAP阳性细胞数较对照组明显增加(P < 0.05)，而Nestin阳性细胞则显著降低 (P < 0.05)。结果表明低浓度右美托咪定诱导脐血间充质干细胞增殖而高浓度右美托咪则抑制其增殖，其机制可能通过调节EKR1/2磷酸化而实现的；高、低浓度右美托咪定均诱导脐血间充质干细胞向神经细胞的分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 右美托咪定, 增殖, 分化

Abstract:

BACKGROUND: Increasing evidence has shown that dexmedetomidine has a significant neuroprotection against ischemia-reperfusion injury, but its mechanism of action on the nervous system and its pathways to affect nerve cell function are rarely reported.
OBJECTIVE: To study the effect of dexmedetomidine on proliferation and neuronal differentiation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells.
METHODS: Umbilical cord blood mesenchymal stem cells at passage 3 were divided into control, low-concentration (1 μg/L) and high-concentration (10 μg/L) dexmedetomidine groups. MTT was used to detect the viability of umbilical cord blood mesenchymal stem cells; western blot assay was used to determine the ERK1/2 phosphorylation in the cells; immunofluorescence staining was used to detect the percentage of NeuN/DAPI, GFAP/DAPI and Nestin/DAPI positive cells. Cell differentiation and proliferation abilities were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell viability and EKR1/2 phosphorylation level were significantly increased in the low-concentration group compared to the control group (P < 0.05); while these two indicators in the high-concentration group were significantly lower than those in the other two groups (P < 0.05). The number of NeuN and GFAP positive cells was increased significantly in the two dexmedetomidine groups compared with the control group (P < 0.05), while the number of Nestin positive cells was significantly decreased in the two
dexmedetomidine groups (P < 0.05). These findings indicate that low-concentration dexmedetomidine can induce the proliferation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells that is however inhibited by the high-concentration dexmedetomidine, which can be realized by regulating EKR1/2 phosphorylation level. In addition, low- and high-concentration dexmedetomidine can both induce the neuronal differentiation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells.

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Key words: fetal blood, mesenchymal stem cells, dexmedetomidine, cell proliferation

中图分类号:

R394.2

樊志刚，乔蕾. 右美托咪定对脐血间充质干细胞向神经细胞分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8088-8092.

Fan Zhi-gang, Qiao Lei. Effect of dexmedetomidine on neuronal differentiation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8088-8092.

图/表（结果） 4

2.1 脐血间充质干细胞分离培养倒置显微镜下可见，培养初期胞体小且呈圆形(图1A)，2 d以后逐渐变为椭圆、胞体变大(图1B)，7 d(第3代)后向两级伸出凸起为长梭形(图1C)。

2.2 流式细胞仪检测结果 CD34、CD45的阳性率不足10%，CD19和CD86阳性率少于10%，CD90、CD105阳性率高于70%，主要组织相容性复合体HLA-ABC的阳性率为90%以上，HLA-DR阳性率低于5%，结果显示所培养细胞符合间充质干细胞表面分子标记特征。

2.3 右美托咪定对脐血间充质干细胞活力的影响 MTT法检测结果表明，低浓度右美托咪定组吸光值较对照组显著增高(P < 0.05)，高浓度右美托咪定组吸光值则较对照组明显降低(P < 0.05)，高浓度右美托咪定组吸光值较低浓度右美托咪定组也明显降低(P < 0.05)，说明低浓度右美托咪定可以促进干细胞增殖，而高浓度右美托咪定则抑制其增殖，见图2。

2.4 右美托咪定对脐血间充质干细胞增殖期ERK1/2磷酸化的影响与对照组相比，低浓度右美托咪定组脐血间充质干细胞ERK1/2磷酸化水平明显增加(P < 0.05)，而高浓度右美托咪定组脐血间充质干细胞ERK1/2磷酸化水平则较明显下降(P < 0.05)，高浓度右美托咪定组较低浓度右美托咪定组也明显下降(P < 0.05)，说明低浓度右美托咪定促进干细胞增殖可能是通过提高ERK1/2磷酸化水平实现的，而高浓度右美托咪定抑制其增殖是降低了ERK1/2磷酸化水平，见图3。2.5 右美托咪定对脐血间充质干细胞向神经细胞分化的影响通过免疫荧光计数可见，对于NeuN阳性(神经元细胞)、GFAP阳性(胶质细胞)比例，低浓度右美托咪定组和高浓度右美托咪定组均较对照组明显增加(P < 0.05)，见图4A，B；低、高浓度右美托咪定组间差异无显著性意义(P > 0.05)。对于Nestin阳性(神经干细胞)比例，低浓度右美托咪定组和高浓度右美托咪定组均较对照组明显降低(P < 0.05)，见图4C，D；低、高浓度右美托咪定组间差异无显著性意义(P > 0.05)，说明高、低浓度右美托咪定都可促进脐血干细胞向神经细胞的分化，且差异无显著性意义，见图4E。

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引言

材料方法

设计：体外细胞学观察实验。

时间及地点：实验于2013年7至10月在郑州大学干细胞研究中心完成。

材料：淋巴细胞分离液(1. 077 g/cm³)(天津TBD公司)；DMEM/F12培养基(Gibco公司，美国)；BrdU、鼠BrdU抗体、神经上皮干细胞蛋白抗体、胶质原纤维酸性蛋白、抗ERK1/2抗体和p-ERK1/2抗体(Sigma，美国)。

实验方法：

脐血间充质干细胞的分离培养：选择郑州市妇幼保健医院产科产妇志愿捐献的足月妊娠顺产的婴儿脐血80 mL，参照文献[19]采用密度梯度离心法获取脐血间充质干细胞，将分离的细胞以5×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。培养1 d后弃去全部液体，然后每2 d全量换液1次，取第3代细胞冻存备用。

细胞的鉴定：参照文献[20]复苏细胞，细胞悬液浓度调整为1×10⁸ L^-¹，分别与鼠抗人的FITC-CD90、PE-CD86、FlTC-CD45，PE-CD19、FITC-CD105、PE-HLA-DR、FITC-HLA-ABC和PE-CD34抗体反应，在4 ℃的暗室中放置30 min，用流式细胞仪测定细胞表面标志表达。以鼠抗人PE/FITC-IgG1为平行对照，数据用Cell Quest软件处理。

实验分组：实验将细胞分为对照组、低浓度右美托咪定组、高浓度右美托咪定组。参照文献[19]复苏细胞，以细胞浓度5×10⁹ L^-¹接种于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中孵育24 h，然后加入PBS、1 μg/L及10 μg/L右美托咪定再培养12 h后进行检测。

脐血间充质干细胞活性检测：细胞活性采用MTT法检测。每组脐血间充质干细胞以1×10⁵/孔接种于96孔培养板中，24 h贴壁之后，每孔加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液50 μL，于37 ℃孵箱中孵育4 h，弃上清，加150 μL二甲基亚砜，充分振摇10 min，在酶联免疫检测仪490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。每组细胞分别重复4次。

脐血间充质干细胞增殖期ERK1/2磷酸化：每组脐血间充质干细胞以1×10⁵/孔种于48孔板中，加入细胞裂解液4 ℃裂解30 min，12 000 r/min离心10 min取上清液，用BCA法测蛋白浓度。配制12%分离胶和5%积层胶进行SDS-PAGE电泳，每孔上样量50 μg，以GAPDH作为内参照。电泳结束后转膜，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭，分别加入兔抗ERK抗体、P-ERK抗体于4 ℃孵育过夜。洗膜，加入HRP标记的相应的羊抗兔IgG抗体于室温孵育1 h。洗膜，ECL显影曝光，得到胶片，比较各条带的灰度值，分析所检测蛋白的磷酸化水平。每组细胞分别重复4次。

脐血间充质干细胞向神经细胞分化检测：每组脐血间充质干细胞以1×10⁵/孔接种于预先用0.1%多聚赖氨酸包被过的48孔板中，培养24 h后换成神经细胞培养液(DMEM/F12+2%B27添加剂+1%N2添加剂+20 μg/L表皮生长因子+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+200 U/L青霉素钠+100 U/L链霉素)培养。分别以NeuN/DAPI、GFAP/ DAPI和Nestin/DAPI双染标记神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元干细胞，观察计数百分比。每组细胞分别重复4次。

主要观察指标：①MTT法检测脐血间充质干细胞活性。②Western blot法检测增殖期脐血间充质干细胞中ERK1/2磷酸化水平。③免疫荧光法检测NeuN/DAPI、GFAP/DAPI和Nestin/DAPI双染细胞比例，观察细胞分化能力。

统计学分析：数据均以x(_)±s形式表示，应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，多样本均数比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

右美托咪定是一种新型高选择性α₂受体激动剂，与α₂、α₁受体结合的比例为1 620∶1^[21]，其与脑干蓝斑核(负责调解觉醒与睡眠)的α₂受体结合可产生剂量依赖性镇静、催眠、抗焦虑作用；与脊髓后角α₂受体结合，可抑制疼痛信号向脑的传导或抑制感觉神经递质的释放而产生镇痛效应^[22]。动物研究还表明右美托咪定可以减少海马的长时程增强^[23]，鞘内注射右美托咪定改变学习和认知能力。另有研究还证实右美托咪定能抑制发育期大鼠神经细胞凋亡^[24]。因此本实验观察右美托咪定对脐血干细胞增殖和分化能力的影响。

MTT法检测右美托咪定对脐血间充质干细胞活力的影响，实验结果显示低浓度右美托咪定组(1 μg/L)可以提高脐血间充质干细胞活力而高浓度右美托咪定组(10 μg/L)则抑制脐血间充质干细胞活性，从而为获得大量稳定的间充质干细胞提高依据和参考。

ERK-CREB信号调节在神经干细胞存活方面具有重要作用^[25-26]，在神经发育初期可影响神经细胞增殖。杜婷^[27]证实，肾上腺能受体激动剂可引起星形胶质细胞和小鼠脑内ERK1/2磷酸化。另有研究证实右美托咪定可以通过调节ERK通路减轻短暂局灶性脑缺血再灌注损伤^[28-30]。那么作为肾上腺素受体激动剂的右美托咪定是否通过ERK-草药CREB信号调节影响间充质干细胞增殖未见报道。本实验通过蛋白免疫印迹法检来测增殖期脐血间充质干细胞中ERK1/2磷酸化水平，结果显示低浓度右美托咪定组 (1 μg/L)中ERK1/2磷酸化较对照组显著增加，而高浓度右美托咪定组(10 μg/L)ERK1/2磷酸化较对照组显著下降，提示右美托咪定对间充质干细胞增殖影响与ERK1/2磷酸化密切相关。

为检测右美托咪定对脐血间充质干细胞分化的影响，通过免疫荧光法以NeuN、GFAP分别标记成熟的神经元和星形胶质细胞，研究结果显示低浓度右美托咪定组(1 μg/L)和高浓度右美托咪定组(10 μg/L)中神经元、星形胶质细胞比例均较对照组明显提高，Nestin标记的脐血间充质干细胞比例则显著降低，而低浓度右美托咪定组(1 μg/L)和高浓度右美托咪定组(10 μg/L)间则无显著差异，提示低、高浓度右美托咪定均可诱导脐血间充质干细胞分化，且这种分化是非选择性的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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