粒细胞集落刺激因子对诱导成骨的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (33): 5276-5281.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.005

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粒细胞集落刺激因子对诱导成骨的作用

张滨，吕松岑，陶树青，荣杰生

哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科四病房，黑龙江省哈尔滨市 150086

出版日期:2014-08-13 发布日期:2014-08-13
通讯作者: 张滨，哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科四病房，黑龙江省哈尔滨市 150086
作者简介:张滨，男，1972年生，黑龙江哈尔滨市人，汉族，2003年哈尔滨医科大学毕业，硕士，副教授，副主任医师，主要从事骨与关节损伤的研究。
基金资助:
黑龙江省教育厅项目(11541146)

Granulocyte colony-stimulating factor induces osteogenesis

Zhang Bin, Lv Song-cen, Tao Shu-qing, Rong Jie-sheng

The Fourth Ward, Department of Orthopedic Surgery, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China

Online:2014-08-13 Published:2014-08-13
Contact: Zhang Bin, Master, Associate professor, Associate chief physician, the Fourth Ward, Department of Orthopedic Surgery, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
About author:Zhang Bin, Master, Associate professor, Associate chief physician, the Fourth Ward, Department of Orthopedic Surgery, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Supported by:
a grant from Heilongjiang Provincial Education Department, No. 11541146

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，在特定条件下能够发育成骨、软骨和其他类型的细胞，而粒细胞集落刺激因子可以促进间充质干细胞的再生。
目的：通过动物实验来观察粒细胞集落刺激因子对成骨的诱导作用，以期对临床骨缺损的患者提供一种更好的治疗方法。
方法：取新西兰白兔40只，随机等分为治疗组及模型组，均切除右侧约1 cm长度桡骨及周围骨膜，之后在缺损处植入脱钙骨基质。治疗组选用粒细胞集落刺激因子30 µg/(kg•d)皮下注射，于造模前3 d开始，连续应用7 d；模型组给予生理盐水皮下注射。
结果与结论：治疗组兔骨缺损区间充质细胞、成骨细胞数量和成骨质量上均优于模型组。提示粒细胞集落刺激因子的应用可以明显提高骨缺损区域的间充质干细胞数量，促进成骨，从而可以促进骨缺损的早期修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨缺损, 粒细胞集落刺激因子, 间充质干细胞, 外周血动员, 桡骨, 骨愈合, 脱钙骨

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells are a kind of adult stem cells with the potentials of self-replicating and multi-directional differentiation. Under certain conditions, the cells can develop into bone, cartilage and other types of cells. Granulocyte colony-stimulating factors can promote regeneration of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To observe the osteogenic induction effect of granulocyte colony-stimulating factors by animal experiment, and provide a better treatment method for clinical treatment of bone defect.
METHODS: Forty New Zealand rabbits were randomly divided into treatment group and model group. All animals were removed 2 cm length of the right radial bone and the surrounding periosteum, and then implanted with demineralized bone matrix into the defect. The treatment group was subcutaneously injected with granulocyte colony-stimulating factor 30 μg/kg per day, the injection was started at preoperative 3 days and given for 7 continuous days. In control group, the same dose of physiological saline was injected.
RESULTS AND CONCLUSION: In the treatment group, the number of mesenchymal stem cells, the quantity and quality of bone formation at bone defects were better than those in the model group. The experimental findings indicate that granulocyte colony-stimulating factor can obviously increase the number of mesenchymal stem cells and promote bone formation at the area of bone defect, which can contribute to early repair of bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: granulocyte colony-stimulating factor, mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cell transplantation, radius

中图分类号:

R318

张滨，吕松岑，陶树青，荣杰生. 粒细胞集落刺激因子对诱导成骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(33): 5276-5281.

Zhang Bin, Lv Song-cen, Tao Shu-qing, Rong Jie-sheng. Granulocyte colony-stimulating factor induces osteogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(33): 5276-5281.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 40只新西兰大白兔均进入结果分析，无脱落。2.2 粒细胞集落刺激因子对外周血成分的影响治疗组兔外周血白细胞数量于造模后第5天达峰值，由用药前的(7.15±0.73)×10⁶ L^-1上升至(25.59±0.61)×10⁶ L^-1，显著高于模型组(7.18±0.44)×10⁶ L^-1(P < 0.01，表1)。

治疗组血液涂片在造模后第3天开始出现大量单个核细胞，主要为单核细胞，早期粒细胞以及淋巴细胞，并且还有少量原始细胞。而对照组第5天血液涂片基本未发生变化(图1)。

2.3 粒细胞集落刺激因子对骨缺损兔组织学的影响治疗组有3只兔子于造模后3 d出现切口红肿，少量渗出，临时加用2次抗生素，并对切口及时更换敷贴以及清理，得到控制，并于造模后5 d及7 d分别消肿，最终顺利拆线；而模型组未出现切口渗出改变，切口虽有不同程度红肿，但愈合满意。

造模后第6-11天，治疗组内兔骨缺损部位可见成骨活动：大量间充质细胞、成骨细胞、成软骨细胞及新生软骨成片状分布于脱钙骨基质周围，并且在细胞间可见到有丰富的毛细血管分布，新生软骨生长活跃，向骨缺损周围扩展，此时肌纤维间仍可见较多间充质细胞。模型组也可见成骨细胞、成软骨细胞及新生软骨，但数量不多，主要集中于周边与肌肉相接触的脱钙骨基质周围，新生血管少见，未见到新生软骨向外扩展现象发生。造模后第21天，治疗组可见基本为软骨与编织骨构成，向周围扩展增生的软骨开始被编织骨替代，镜下很少见到植入的脱钙骨基质，新生血管也基本消失。模型组在周边也可见到编织骨形成，在植骨的中央区仍可见成骨的早期形态，植入的脱钙骨基质多见，吸收不完全，新生骨数量远少于治疗组。造模后第28天，治疗组基本为编织骨构成，周边骨质已开始吸收塑性，有向板层骨转变趋势。模型组周边也可见骨塑性改变，但植骨中央仍可见少量软骨。造模后第56天，治疗组编织骨塑形基本完成，被板层骨替代。模型组周边也已向板层骨转化，但在髓腔内仍有明显的编织骨存在(图2)。

2.4 粒细胞集落刺激因子对骨缺损兔骨结构的变化 X射线显示，造模后11 d治疗组植入脱钙骨基质少部分吸收，断端少量骨痂形成，模型组兔造模后植入脱钙骨基质也有少部分吸收，断端未见明显骨痂形成。28 d时治疗组大量骨痂基本连续，模型组断端模糊，明显骨痂形成，但明显少于治疗组。56 d时断端连接，新骨进入塑形阶段，髓腔基本再通(图3)。60 d时断端连接，有板层骨形成，但髓腔未通。造模后不同时间点各组改进Gary X射线评分结果见表2。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年1至6月在哈尔滨医科大学附属第二医院完成。

材料：健康成年新西兰大白兔40只，雌雄不限，体质量2.0-2.5 kg，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(黑)2009-002。实验选用开放系统实验室，室温，自然光，相对湿度为40%左右。实验经哈尔滨医科大学实验动物伦理委员会审议批准。

方法：

动物分组：将40只实验兔随机分为治疗组和模型组，各20只。2组实验兔均分笼饲养。

脱钙骨的制备：另取新西兰白兔6只，耳缘静脉注射 10 mL空气栓塞处死。取出股骨干，切除两侧干骺端，剔尽附丽的软组织和骨膜，刮净髓腔，用生理盐水反复冲洗3遍，制成脱钙骨备用^[8-9]。造模前30 min置于生理盐水中。

骨缺损模型的建立及治疗：以3%戊巴比妥钠1 mL/kg，麻醉实验兔，仰卧位固定，备皮、常规消毒铺巾，切除右侧2 cm长度桡骨及周围骨膜，之后在缺损处植入脱钙骨基质约1.2 g。之后选用粒细胞集落刺激因子(北京四环生物制药有限公司，国药准字S20020050)作为动员药物，体表面积计算用药剂量，以正常人骨髓动员剂量10 µg/(kg•d)为标准^[10]，换算兔的用药剂量为 30 µg/(kg•d)，用生理盐水稀释后于实验动物皮下注射，治疗组于造模前3 d开始，连续应用7 d；模型组给予相同剂量30 µg/(kg•d)的生理盐水注射。

瑞氏染色观察兔外周血白细胞的变化：造模前和造模后第3，5，7，9天，取2组兔耳缘静脉血20 μL，进行白细胞计数和涂片，甲醇固定2.0-3.0 min。将血涂片放置姬姆萨使用液15-30 min。涂片用自来水冲洗，在室温中干燥待查。

苏木精-伊红染色观察大鼠骨缺损部位组织学变化：造模后6，11，21，28，56 d，每组随机取3只动物，动物空气栓塞处死，将植入骨及周围组织合并取下，用40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，放入体积分数15%乙二胺四乙酸二钠中4 ℃脱钙两三周。常规石蜡切片，苏木精染液染色5-15 min。水洗玻片上多余染液，体积分数0.5%-1.0%盐酸乙醇分色。流水冲洗15-30 min。蒸馏水洗。体积分数0.1%-0.5%伊红染液染色1-5 min。梯度乙醇脱水。二甲苯透明。中性树胶封固。光镜(Nikon公司)观察。

X射线观察兔骨缺损部位的变化：造模后11，28，56 d行X射线摄片，应用改进的Gary X射线评分^[11]。根据原植骨组织吸收情况及骨缺损两端连接情况分别计分：原植骨组织分为完全吸收、大部分吸收、少部分吸收、新生骨再生塑形差及新生骨再生塑形好髓腔再通5种情况，分别计为0，1，2，3，4分；两端连接情况分为无连接、断端有少量骨痂，断端模糊有骨痂，断端连接消失不见及髓腔再通5种情况，分别计为0，1，2，3，4分，且断端两侧分别计分。

主要观察指标：观察外周血白细胞计数，对骨缺损兔组织学的影响及对骨缺损兔骨结构的变化

统计学分析：数据采用Excel进行数据录入整理，采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，所得数据以x(_)±s表示，组间比较采t 检验及秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

通常在骨缺损的治疗中，尤其是在非外伤性骨缺损的治疗，倾向于取自体骨或者人工同种异体骨进行骨缺损处的植骨，一种新的促进骨诱导分化而表达的方法势必会对这一问题有个很好的解决，以获得更好的临床治疗效果。在骨形态发生蛋白的作用下间充质细胞聚集并分化为成骨细胞并最终形成骨组织的过程称作骨诱导。诱导成骨有3个必要条件^[12-13]：①诱导因子——骨形态发生蛋白的存在。②骨形态发生蛋白的靶细胞群。③允许骨生长的正常环境。间充质干细胞广泛存在于多种成体和胚胎组织中，在适宜条件下具有多向分化能力和具有体外扩增能力强抗原性弱的特点，被认为是组织损伤性疾病治疗中理想的种子细胞来源^[14-16]。1976年，Freidenstein等^[17]首次发现在骨髓里存在一群不纯一的细胞群体，这种细胞在体外培养时贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，呈克隆性增殖，并提出“骨髓间充质干细胞的概念。后经过深入和广泛的研究，发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。人类对间充质干细胞的生物学特性、来源、诱导分化、前期临床应用等取得了长足的进展^[18-24]。

目前已有多篇文章报道，在多种哺乳动物的外周血中分离出具有间充质干细胞特定的细胞，称为外周血间充质干细胞^[25-30]。Reading等^[31]用间充质干细胞特异的单克隆抗体STRO-1结合免疫磁珠分选方法从健康成人血中分离间充质干细胞，用MEM培养液培养得到间充质干细胞集落，而早些时候Kuznetsov等^[32]用体外细胞培养方法证实健康成人外周血中亦存在间充质干细胞，其细胞表型与骨髓间充质干细胞相似，均表达CD44，CD106，α-SMA，不表达与造血系相关的CD14，CD34和CD45，且均合成纤维粘连素、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原。最近，刘小慧等^[33]研究报道证实了在家兔外周血中存在具有多向分化能力的间充质干细胞，并将分离得到的外周血间充质干细胞进行成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化，最终确认外周血间充质干细胞具有向成骨分化的能力。在外周血中间充质干细胞虽然含量很少，但是其组织来源丰富，人们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。实验采用的粒细胞集落刺激因子是骨髓造血干细胞强有力的动员剂，临床主要用于外周血造血干细胞移植。 Kocher等^[34]证实粒细胞集落刺激因子动员造血干细胞的同时，也可以动员间充质干细胞到外周血中。治疗组在造模后第5天的血涂片中单个核细胞大量出现，其中可发现少量原始细胞，呈圆形，细胞质量少，呈透明蓝色，核染色质细致，部分可见核仁，这些形态符合间充质干细胞的特征。同时的骨髓涂片示骨髓增生明显活跃，粒细胞系和红细胞系比例明显升高，原粒细胞和早幼粒细胞比例也明显升高。而在模型组中并未见到原始细胞。这说明外周血中存在间充质干细胞，但数量稀少，正常的血液涂片很难发现其存在，只有经过粒细胞集落刺激因子动员后，才可以在血液中大量出现。同时也说明这些间充质干细胞很可能来自于骨髓，是骨髓中的间充质干细胞经过分裂增殖后进入外周血。本次实验的结果与刘小慧等^[33]的研究具有相似性，都可以验证在外周血中存在间充质干细胞，在经过粒细胞集落刺激因子动员后可以大量增殖出现在外周血液中，在特定的条件下具有向成骨细胞方向分裂的能力。

脱钙骨基质作为一种骨移植材料，其具有骨传导性、骨诱导性及促进成骨能力，1965年，Urist首次明确提出了脱钙骨基质具有诱导成骨的能力，这一研究具有里程碑式的意义。随后，在1979年Urist等^[35-36]由兔骨中提纯出骨形态发生蛋白，并提出骨形态发生蛋白学说。

现在多数学者认为脱钙骨基质诱导成骨能力是由于其中含有与骨基质胶原紧密结合的骨形态发生蛋白。骨形态发生蛋白诱导成骨包含有3步^[13]：①诱导趋化。②诱导有丝分裂。③诱导分化。其中诱导趋化是指细胞对于化学信号分子浓度梯度变化所做出的方向性移行，在骨形态发生蛋白趋化下，血浆纤维连接蛋白与产胶原的骨基质连接，促进间充质干细胞黏附其上发生增殖。Du等^[37]证实在动物活体实验移植混合骨髓间充质干细胞的脱钙骨基质成骨率明显高于单纯脱钙骨基质移植。在术后第6-11天，治疗组内间充质细胞、成骨细胞、成软骨细胞及新生软骨数量上多于模型组，并且出现了新生的软骨向周围的扩散的现象。这说明间充质干细胞数量越多，那么成骨作用越明显。类似的报道采用粒细胞集落刺激因子动员外周血干细胞后在基质细胞衍生因子1促进下能提高外伤性创伤的愈合，从另一个方面说明间充质干细胞的数量影响伤口愈合的速度和质量^[38]。

造模后第6天开始，治疗组兔损伤部位脱钙骨基质周围可见较多新生毛细血管分布，并且在数量上明显的多于模型组，在造模后第28天，治疗组新生骨数量明显增多，并且明显多于模型组，此外已很少见到植入的脱钙骨基质，而模型组在植骨部分的中央仍可见的未被吸收脱钙骨基质。这说明骨髓动员可以改善骨质缺损部分的血液灌注，而血液循环环境决定了脱钙骨基质的吸收，并且释放骨形态发生蛋白，并且呈正相关性，这样可以促使诱导成骨过程更好的发展。其原因可能由于骨缺损局部的缺氧状态促进多种细胞分泌血管内皮生长因子^[39]，而血管内皮生长因子具有特异地作用于内皮细胞，促进其增殖和生长血管，并且相关实验还证实其可以诱导间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞^[24]，并且Emad等^[40]证实有血管内皮生长因子条件下，脱钙骨基质移植会得到更好的愈合，因此治疗组在植入骨周围的细胞间可以见到比模型组明显增多的新生血管。

随着对间充质干细胞研究逐步深入，其应用价值得到广泛的认同，并且成为骨科组织工程学中的热点。但同样也存在这尚未解决的难题：间充质干细胞分离数量有限、体外诱导分化效率不高、多次扩增后发生突变的概率以及在植入细胞内环境后环境改变致使存活率低等情况，使其进行大范围的推广非常困难，现阶段仅仅处于试验阶段。现在段临床上使用的促进骨折愈合的药物比较多，但其药理机制等并没有被很好的阐释，而且疗效并不确切。作者认为促进骨愈合的药物的机理可能是从不同方法增加了骨折部位的干细胞的数量，间接的提供了诱导过程中的成骨细胞，因为这些药物既不可能给骨折局部提供诱导因子，更不可能直接提供成骨细胞。因此通过骨髓动员提高外周血间充质干细胞数量，借助于骨形态发生蛋白的趋化作用使间充质干细胞进入骨缺损区，从而间接增加了局部的骨形态发生蛋白的靶细胞数量，在正常生理条件下使其分化并生成新生，这样可以免体外培养的弊端，同时避免了复杂的程序，希望此实验可以为骨缺损的治疗及新生药物的生产提供一个新的思路。

由于实验时间以及实验条件的限制，没有对血液和组织中的间充质干细胞表型进行鉴定，只是通过其组织学特点判定；同时粒细胞集落刺激因子在于骨缺损方面上使用的剂量以及使用的时间上并没有相关文献的支持，因此采用了血液科进行骨髓移植时所应用的方案，而这可能并不是最佳的动员方案，这也需要以后的实验进一步研究。但实验结果显示治疗组中出现了非常好的成骨现象，这说明其对于骨缺损的治疗是有效的，也需要日后进一步的探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
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[4]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[5]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[6]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[7]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
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[9]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
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[11]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
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[13]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[14]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
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