许旺细胞及小肠黏膜下层复合生长因子缓释微球修复周围神经缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.03.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (3): 457-464.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.03.013

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许旺细胞及小肠黏膜下层复合生长因子缓释微球修复周围神经缺损

张开伟¹，段宏²，项舟²，肖睿³，陈久毅¹

1贵阳中医学院第一附属医院骨科，贵州省贵阳市 550001
2四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041
3宜宾市第一人民医院，四川省宜宾市 644000

收稿日期:2012-07-02 修回日期:2012-10-19 出版日期:2013-01-15 发布日期:2013-01-15
通讯作者: 段宏，博士，副主任医师，四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041 duanhong1970@yahoo.com.cn
作者简介:张开伟☆，男，1973年生，贵州省贵阳市人，2010年四川大学华西临床医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事骨与关节损伤方面的研究。 zkw1973@yahoo.com.cn

Combination of Schwann cells, small intestinal submucosa and growth factor sustained-release microspheres for repair of peripheral nerve defects

Zhang Kai-wei¹, Duan Hong², Xiang Zhou², Xiao Rui³, Chen Jiu-yi¹

1 Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China
2 Department of Orthopedics, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
3 Department of Orthopedics, First People’s Hospital of Yibin, Yibin 644000, Sichuan Province, China

Received:2012-07-02 Revised:2012-10-19 Online:2013-01-15 Published:2013-01-15
Contact: Duan Hong, Doctor, Associate chief physician, Department of Orthopedics, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China duanhong1970@yahoo.com.cn
About author:Zhang Kai-wei☆, Doctor, Associate chief physician, Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China zkw1973@yahoo.com.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验已初步证实许旺细胞复合小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子构建的人工神经具有体外神经活性、趋化性。
目的：观察许旺细胞及小肠黏膜下层复合碱性成纤维细胞生长因子缓释微球修复周围神经缺损后神经传导的再通情况。
方法：制作SD大鼠坐骨神经缺损模型，随机分组：实验组以许旺细胞及小肠黏膜下层复合碱性成纤维细胞生长因子缓释微球修复，阳性对照组以许旺细胞及小肠黏膜下层复合游离碱性成纤维细胞生长因子修复，阴性对照组以许旺细胞及小肠黏膜下层修复，空白对照组以自体神经修复。
结果与结论：术后16周实验组再生神经纤维数目，DiI示踪标记的阳性神经元数量、S-100及神经细丝蛋白的阳性表达率、髓鞘及再生轴突的超微结构恢复、神经传导速度及复合动作电位的改善均优于阳性对照组与阴性对照组(P < 0.05)。表明许旺细胞复合小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子缓释微球构建的人工神经可重建坐骨神经缺损后的神经传导通路。

关键词: 生物材料, 生物材料与药物控释, 碱性成纤维细胞生长因子, 小肠黏膜下层, 许旺细胞, 周围神经缺损, 神经传导, 缓释微球, 省级基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: To combine Schwann cells (SCs) and small intestinal submucosa (SIS) with basic fibroblast growth factor (bFGF) is a feasible way to construct artificial nerve that possesses nerve activity and chemotaxis in vitro.
OBJECTIVE: To observe the recanalization of neural pathways after repairing peripheral defects with bFGF controlled release microspheres combined with SCs and SIS.
METHODS: Models of sciatic nerve defects were established in Sprague-Dawley rats, and then randomized into: experimental group repaired with bFGF controlled release microspheres combined with SCs and SIS, positive control group with SCs and SIS combined with free bFGF, negative control group with SCs and SIS, and blank control group with autologous nerve.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of regenerated nerve fibers, number of DiI tracer-positive neurons, positive expression rate of S-100 and neurofilament protein, ultrastructure of regenerated myelin and axons, nerve conduction velocity and composite action potential in the experimental group were superior to those in the positive and negative control groups at 16 weeks after operation (P < 0.05). These findings indicate that bFGF controlled release microspheres combined with SCs and SIS can reconstruct the neural pathways following sciatic nerve injury.

Key words: biomaterials, biomaterials and drug-controlled release, basic fibroblast growth factor, small intestinal submucosa, Schwann cells, peripheral nerve defects, nerve conduction, sustained-release microspheres, provincial grants-supported paper, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

张开伟，段宏，项舟，肖睿，陈久毅. 许旺细胞及小肠黏膜下层复合生长因子缓释微球修复周围神经缺损[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(3): 457-464.

Zhang Kai-wei, Duan Hong, Xiang Zhou, Xiao Rui, Chen Jiu-yi. Combination of Schwann cells, small intestinal submucosa and growth factor sustained-release microspheres for repair of peripheral nerve defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(3): 457-464.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 60只成年SD大鼠均进入结果分析。

2.2 各组神经移植体外观观察结果术后16周取材时见阳性对照组与阴性对照组神经移植体两端出现了明显的神经瘢痕，而空白对照组神经吻合端出现轻度的膨大现象，神经周围血管化良好，实验组无明显神经瘤形成，神经连续性良好，但神经较空白对照组相对细。

2.3 各组神经移植体苏木精-伊红染色及髓鞘染色观察结果术后16 周，空白对照组有髓神经纤维数量较多，髓鞘致密，排列规则；实验组神经纤维排列较整齐，呈板层状，髓鞘化不均匀，有髓神经纤维比空白对照组相对较少，但有较丰富的毛细血管增生；阴性对照组再生神经纤维较少，神经束间空泡形成，纤维结缔组织充填于膜管内；阳性对照组再生轴突数量较少，神经纤维直径不均匀，与纤维组织混合生长，血管化及髓鞘化均不明显，见图1。

2.4 各组神经移植体 S-100及神经细丝蛋白免疫组织化学观察结果空白对照组沿轴突周围阳性表达率最高；实验组次之，表达的范围也较广，其纵切面可见有较多周围阳性染色的神经纤维，波浪形排列整齐、较规则，连续性较好；阴性对照组和阳性对照组再生神经纤维周围中阳性表达相对较少，阴性对照组的阳性表达较散在。神经移植体 S-100阳性表达，见图2。

2.5 各组神经移植体神经电生理检测结果见表1。

术后第8周时，空白对照组及实验组已能记录动作电位，但实验组神经传导速度及动作电位波幅低于空白对照组，而阴性对照组、阳性对照组虽然也可记录到传导时限长、电压低的动作电位，但与实验组相比其数值明显较低(P < 0.05)；到术后第 16周时，空白对照组与实验组均能记录到波幅较高、传导速度较快的动作电位，两组动作电位的波形相似，但实验组波幅和神经传导速度相对较低(P < 0.05)；阴性对照组、阳性对照组神经传导速度和复合动作电位波幅均较第8周时有所提高，但与空白对照组、实验组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 各组神经移植体DiI逆行示踪结果见图3。

术后16周，空白对照组及实验组脊髓灰质前角或背根神经节细胞膜上中能见到明显呈玫瑰花环样DiI标记的阳性神经元，其中空白对照组的阳性表达强度及数量多于实验组，而阴性对照组神经元的DiI标记不明显，只有散在的阳性标记细胞，阳性对照组的阳性标记强度及标记率明显低于实验组。

2.7 各组神经移植体扫描电镜及透射电镜观察结果见图4。

术后第16周，空白对照组的再生神经轴索较粗，呈板层状排列，髓鞘排列致密，髓鞘较厚且均匀，内可见微管、微丝等结构；阴性对照组的再生轴突少，排列不规则，有髓纤维的髓鞘极薄，束间纤维结缔组织较多，细胞器结构不明显；阳性对照组的神经纤维较阴性对照组相对较多，排列紧密但不规整，并与纤维组织混合生长，新生轴突的髓鞘较薄，细胞器不丰富；实验组神经纤维数量相对较多，且排列规整，基本呈板层状排列，但髓鞘状结构不均匀，轴浆内富含神经微丝、微管及线粒体。

2.8 各组神经移植体再生神经纤维形态计量分析结果见表2。

术后16周时，实验组再生神经组织面积百分比、有髓纤维密度和髓鞘厚度均明显高于阴性对照组、阳性对照组的相应值(P < 0.05)，但实验组的以上指标又低于空白对照组(P < 0.05)，而阳性对照组的再生神经计量指标均高于阴性对照组(P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2009年10月至12月在四川大学华西医院干细胞及组织工程实验室完成。
材料：
实验动物：出生两三天的清洁级SD乳鼠；成年SD大鼠，体质量250-300 g，雌雄各半，均由四川大学华西医学中心动物中心提供。小肠黏膜下层来自健康成年猪的小肠。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》^[4] 。
许旺细胞及小肠黏膜下层复合生长因子缓释微球修复周围神经缺损后神经传导再通实验的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments used in the experiment of repairing peripheral nerve injuries with basic fibroblast growth factor controlled release microspheres combined with Schwann cells and small intestinal submucosa:

实验方法：
许旺细胞的分离与鉴定：按Fansa等^[5]的双酶消化法行许旺细胞的培养、分离及鉴定。取出生两三天SD乳鼠双侧坐骨神经，去除神经外膜，用含双抗的DMEM及PBS清洗后，分别予0.25%胰酶、0.2%Ⅱ型胶原酶消化10 min后终止消化，1 500 r/min离心5 min，弃其上清液，予含体积分数10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，差速贴壁20 min后移入到培养瓶中，于体积分数5%CO₂、37 ℃ 培养箱中培养24 h后，加入10^-5 mol/L阿糖胞苷作用24 h以纯化细胞，隔日换液，培养6-8 d细胞铺满瓶底后进行传代。取第2代培养的许旺细胞制成细胞爬片，培养5 d行S-100荧光免疫细胞化学染色鉴定，并在电镜下随机选取10个视野计数阳性细胞数，以阳性细胞百分比表示细胞的纯度。
小肠黏膜下层的制备：取成年猪的新鲜空肠，刮除黏膜层、浆膜层和肌层。按Abraham的化学方法进行去垢及脱细胞处理后，于-70 ℃冻干，铝塑袋封装，环氧乙烷消毒备用。
实验材料的制备：参照实验前期方法制备20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子缓释微球^[3]，用生理盐水配制质量浓度均为20 μg/L 的碱性成纤维细胞生长因子溶液及缓释微球悬液；将小肠黏膜下层制备成1.0 cm×1.5 cm的规格消毒备用。体外分离、培养、纯化获取许旺细胞并冻存，取第2代许旺细胞进行复苏后培养3 d，以1×10⁶接种于预湿处理的小肠黏膜下层上共培养2 d以构建体外人工神经。术前用苏木精-伊红染色、相差显微镜观察许旺细胞在小肠黏膜下层上的贴附及生长状态良好后再进行体内移植。
实验分组：将60只SD大鼠随机分配为4组，空白对照组、阴性对照组、阳性对照组及实验组，每组15只。
大鼠坐骨神经缺损模型的建立：将成年SD大鼠麻醉并消毒后，取右臀部约2 cm的斜行切口，钝性分离肌肉并显露坐骨神经，距其出口1 cm处切取约12 mm长度的坐骨神经，造成神经缺损模型。空白对照组将切取下的自体神经段倒转后原位缝合于神经断端间，其余3组在手术显微镜下将人工神经复合体制备成膜管状，用9-0无损伤线缝合缺损神经的两端，其中阳性对照组注入游离碱性成纤维细胞生长因子溶液于膜管内，实验组注入碱性成纤维细胞生长因子微球悬液。根据动物体质量，以90 μg/kg为两组碱性成纤维细胞生长因子的用药量^[3] 。
电生理检查：术后8，16周，每组各取3只动物麻醉后，沿原手术切口暴露移植的人工神经段，记录电极插入到同侧腓肠肌肌腹中部，将刺激电极先钩住移植体的近端，先刺激近端(电压2-5 mV，刺激强度1-10 mA)，然后再刺激移植体远端。测量两刺激点的距离(S)，分别记录各潜伏期(T1、T2)、复合肌肉动作电位波幅，根据公式计算出两点间的运动神经传导速度：

讨论

目前以组织工程方法构建的人工神经依然是修复周围神经缺损的一个重要途径。许旺细胞是较常用的人工神经种子细胞，其参与诱导轴突再生^[6-8]，并实施着对轴突再生方向性的趋动作用。小肠黏膜下层可作为多种组织工程材料的支架，由于其具有与神经外膜相似的结构及力学强度，也可分泌微量的神经生长因子，为细胞迁移、增殖提供铺垫支架及良好的营养^[9-10]，因此正日益被运用于人工神经的支架材料进行研究。因此以许旺细胞为种子细胞、小肠黏膜下层为支架材料构建的人工神经理具有良好的神经再生协同作用，其可行性已得到了文献^[11-12]的证实。课题前期研究也已表明，许旺细胞可贴附于小肠黏膜下层实现细胞的增殖、迁移，能达到人工神经体外构建的要求^[3]。碱性成纤维细胞生长因子是一种对神经及血管具有双向调节的神经生长因子，可促进许旺细胞增殖、神经趋化及诱导功能，因此已被广泛地运用于调节人工神经构建的活性。为了提高其生物可利用度，已有部分学者将碱性成纤维细胞生长因子制备成缓释微球作用于人工神经以期提高神经再生的效应，并保持人工神经导管内的持续生物活性^[13-18]。

本课题充分整合了许旺细胞、小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子微球的各自优势，将许旺细胞体外复合小肠黏膜下层构建的人工神经制备成导管以桥接缺损神经，再将碱性成纤维细胞生长因子微球注入到导管中以长期维持再生室中的活性微环境，因此神经传导通路再通的标志是再生轴突的数量、形态及功能的恢复。本实验通过组织染色、免疫组织化学及神经微观结构观测发现，术后8，16周时，实验组再生神经轴突数量、髓鞘厚度、再生神经面积比、有鞘神经纤维密度明显多于阳性对照组、阴性对照组，说明在轴突再生过程中许旺细胞的增殖、神经元形态的维持及轴浆的运输功能持续得到了碱性成纤维细胞生长因子微球的保障。而这一切得利于小肠黏膜下层复合许旺细胞构建的神经导管为轴突再生提供了一个相对密闭的微环境，在神经再生过程中还有效避免了神经误长入周围组织中^[19-20]，并可通过形成纤维桥而为轴突的再生提供支架^[21-22]，允许管内外的物质进行交换^[23-24]，从而为小肠黏膜下层制备的半通透性神经导管参与维持再生通道中的微环境提供了有利条件。碱性成纤维细胞生长因子微球所构建的人工神经导管内较恒定的微环境确实持续地促进轴突再生的数量及质量，碱性成纤维细胞生长因子微球在导管内的释放过程可能与Lundborg等^[25]阐述的神经再生室模型中神经再生的5个时期基本相符，神经再生室内持续释放的碱性成纤维细胞生长因子的神经趋向性引导、诱导并趋动轴突的方向性再通^[26]。神经电生理是评估神经传导功能恢复最敏感的指标，复合动作电位中的运动神经传导速度及动作电位波幅均与靶器官的传导功能有良好的线性相关关系^[27]，前者反映了再生轴突的髓鞘化程度，而动作电位波幅则反映了再生神经纤维的质量及数量。本实验电生理观察表明：阴性对照组、阳性对照组、实验组均可诱发出动作电位，表明小肠黏膜下层复合许旺细胞的人工神经均可实现对神经传导功能的再通，这与其他学者的报道相吻合^[9]，但实验组神经传导速度及波幅均明显大于阴性对照组、阳性对照组，证实小肠黏膜下层复合许旺细胞及碱性成纤维细胞生长因子微球制备的神经导管实现了轴突再生数量及髓鞘生成的最大化。

神经的再通性是轴突再生及胞浆输送营养物质性能的体现，而神经的再通性通常由神经通路的示踪来实现，运用各种示踪剂在神经通路中的动态变化规律来反映再生神经的轴浆流^[28-29]。DiI是一种被广泛用于神经细胞示踪的亲脂性膜染料，具有使用简便、阳性标记时间长、表达稳定、标记细胞形态良好等特点^[30-31]。本实验术后16周时 DiI的逆行示踪结果显示：空白对照组脊髓前角及背根神经节内DiI阳性表达率最高，实验组的表达率及表达强度也仅次于空白对照组，但明显强于阳性对照组、阴性对照组，由此表明实验组人工神经修复后其运动及感觉神经纤维的再通过性良好，表明碱性成纤维细胞生长因子微球可能通过缓慢释放的碱性成纤维细胞生长因子的神经诱导及趋化作用促进了再生轴突的胞浆运输功能，且将神经营养因子经轴突逆行运输至胞体，与其受体特异性结合，通过控制Na⁺-K⁺泵活动等复杂机制，促进受损神经元存活，促进蛋白质、微丝、微管的生物合成^[32]，为实现再生神经纤维与靶肌肉建立功能性联系奠定了物质基础。

通过碱性成纤维细胞生长因子微球复合小肠黏膜下层及许旺细胞建立的人工神经导管修复缺损神经体内实验，初步证实了碱性成纤维细胞生长因子微球促进了许旺细胞的增殖，在膜管的机械引导作用下，通过持续的神经诱导作用促进轴突及微血管在导管内的再生，在小肠黏膜下层的协同下，通过神经趋化作用持续地促进再生轴突与靶器官的功能连接，通过本身释放的碱性成纤维细胞生长因子并协同增殖许旺细胞的神经诱导、趋化功能，最终实现了神经传导通路的再通。但关于碱性成纤维细胞生长因子微球内确切的作用机制、碱性成纤维细胞生长因子在体内如何维持较稳定的微环境、导管内微环境的影响因素及人工神经促进神经传导再通的确切机制等问题尚有待于进一步的深入研究。

基金资助：四川省宜宾市重点科技计划项目(200803010)。
作者贡献：设计为第一、四及通讯作者，实施为第一、四、五作者，评估为第三作者。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

许旺细胞及小肠黏膜下层复合生长因子缓释微球修复周围神经缺损

Combination of Schwann cells, small intestinal submucosa and growth factor sustained-release microspheres for repair of peripheral nerve defects

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