1.1 设计 体外细胞实验+随机对照动物实验，两组组间比较行独立样本 t检验；单一指标组间整体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点 实验于2022年10月至2023年6月在内蒙古医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 成年雄性新西兰大白兔30只，6月龄，体质量(3.8±0.6) kg，购自内蒙古医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(蒙)2020-0001。实验方法已通过内蒙古医科大学实验动物中心伦理委员会批准(伦理审批号：IACUC202212120-06)。
1.3.2 材料、试剂与仪器 新西兰大白兔骨髓间充质干细胞购自上海启达生物科技有限公司；新鲜猪小肠来自经过检疫的市售健康成年猪；脐静脉内皮细胞及专用细胞培养基购自长沙艾碧维生物科技有限公司；AE1/AE3抗体购自艾美捷科技有限公司；ɑ-平滑肌肌动蛋白抗体购自北京拜尔迪生物技术有限公司；CD31抗体购自武汉华美生物工程有限公司；CD9、CD63单克隆抗体购自上海宇劲生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM/F12培养基购自苏州阿尔法生物实验器材有限公司；Elisa检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；纳米粒子跟踪分析仪购自天津瑞利光电科技有限公司；透射电镜购自北京欧波同光学技术有限公司；扫描电镜购自北京天耀科技有限公司。
1.4 方法
1.4.1 外泌体的提取与鉴定
分离提取外泌体：将胎牛血清在4 ℃环境下10 000×g离心12 h，去除白色絮状沉淀，配置含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基备用。观察第3代骨髓间充质干细胞融合至70%后，更换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养48 h，收集培养基保存在-80 ℃冰箱备用。将培养基转移至离心管内300×g离心10 min，弃沉淀保留上清；2 000×g离心10 min，弃沉淀保留上清；10 000×g离心30 min，弃沉淀保留上清；使用0.22 μm滤膜过滤后100 000×g离心2 h，弃上清保留沉淀；加入PBS混合均匀，100 000×g离心2 h，弃上清保留沉淀，沉淀即为外泌体。将外泌体加入100 μL PBS中，保存在-80 ℃冰箱备用。
鉴定外泌体：取10 µL外泌体-PBS溶液滴加到2 mm载样铜网上室温静置1 min，使用滤纸轻轻吸去多余的液体，再使用30 g/L磷钨酸钠溶液(pH=6.8)室温负染5 min，使用双蒸水轻柔清洗1遍后室温晾干，置于透射电镜下观察并拍照。使用纳米粒子跟踪分析外泌体的尺寸分布。利用Western blotting检测外泌体的特性蛋白表达，将外泌体-PBS的混悬液与5×SDS的混合液加于凝胶上样孔内(15%分离胶与5%浓缩胶)，浓缩胶恒压80 V，分离胶恒压120 V，跑胶1 h，再进行转膜，加入CD9、CD63单克隆抗体在4 ℃下孵育过夜，洗脱后加入二抗室温孵育1 h，用1×TBS洗脱3次，进行化学显影检测。
1.4.2 小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物的制备
制备小肠黏膜下层脱细胞基质：选用新鲜猪小肠，用无菌生理盐水反复冲洗以清除小肠内外壁黏附的物质。挑选粗细均匀、管壁无破损、无淋巴结的部位，用钝性刀具沿管腔纵向刮除浆膜、肌层和黏膜，当出现半透明状、乳白色薄膜时即为小肠黏膜下基质，用纯水反复冲洗基质，备用。将小肠黏膜下层放入玻璃烧杯中，加入氯仿/甲醇脱脂液后封口，置于恒温摇床中(4 ℃，100 r/min)振荡12 h，观察液体分层后更换脱脂液，重复上述步骤1次；用纯水反复冲洗后置入0.05%胰蛋白酶和0.05%EDTA溶液中，置于恒温摇床中(4 ℃，100 r/min)振荡12 h，观察液体浑浊发白后更换溶液，重复上述步骤1次；用纯水反复冲洗后置于MES缓冲液中，与30 mmol/L EDC溶液、15 mmol/L NHS溶液按照8∶1∶1的体积比混合，置于恒温摇床(4 ℃，100 r/min)中振荡12 h，滤网筛出后重复上述步骤1次。25 kGy γ射线照射消毒灭菌后置于4 ℃保存备用。苏木精-伊红染色观察处理前后小肠黏膜下层脱细胞基质的形态。扫描电镜观察处理后小肠黏膜下层脱细胞基质的微观形态。
制备小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物：将处理后的小肠黏膜下层脱细胞基质置入外泌体-PBS溶液中，溶液中外泌体的质量浓度为10 mg/mL，置于37 ℃环境中振摇孵育24 h，使外泌体充分浸润在小肠黏膜下层脱细胞基质内。
1.4.3 小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物的体外促血管生成作用
外泌体示踪实验：首先，利用PK H26染料标记外泌体，然后制备小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物；将小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物与脐静脉内皮细胞在37 ℃环境中共培养12 h，加入40 g/L多聚甲醛固定细胞20 min；用PBS漂洗3次，每次 5 min；加入 DAPI避光孵育10 min；用PBS漂洗3次，每次 5 min；加入适量PBS，荧光倒置显微镜下观察。
脐静脉内皮细胞迁移实验：取生长状态良好的脐静脉内皮细胞，胰酶消化后配置成细胞悬液。将细胞悬液加入6孔板内贴壁培养，细胞密度为1×105/孔，观察细胞融合至80%后用PBS清洗2次，用1 mL无菌枪头垂直于培养板紧贴无菌尺进行划痕，拍照记录0 h的划痕情况。然后分3组处理：空白组加入细胞培养基，对照组加入细胞培养基与小肠黏膜下层脱细胞基质，实验组加入细胞培养基与小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物，使材料浸没于培养基中，置入细胞培养箱内培养48 h。48 h后弃培养基与材料，用PBS清洗细胞1次，显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。
脐静脉内皮细胞成管实验：取生长状态良好的脐静脉内皮细胞，胰酶消化后配置成细胞悬液。将细胞悬液加入6孔板内贴壁培养，细胞密度为1×105/孔，观察细胞贴壁后分3组处理：空白组加入细胞培养基，对照组加入细胞培养基与小肠黏膜下层脱细胞基质，实验组加入细胞培养基与小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物，使材料浸没于培养基中。培养48 h后去除培养基与材料，用PBS清洗细胞1次，加入胰酶消化并收集细胞，用PBS清洗细胞1次，1 500 r/min离心5 min后用细胞培养基重悬细胞，采用细胞计数板计数。将100 µL细胞悬液加入铺好基质胶的96孔板内，置于细胞培养箱内培养6 h，显微镜下观察并拍照。
脐静脉内皮细胞分泌血管生成因子实验：取生长状态良好的脐静脉内皮细胞，胰酶消化后配置成细胞悬液。将细胞悬液加入6孔板内贴壁培养，细胞密度为1×105/孔，观察细胞贴壁后分3组处理：空白组加入细胞培养基，对照组加入细胞培养基与小肠黏膜下层脱细胞基质，实验组加入细胞培养基与小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物，使材料浸没于培养基中。培养48 h后，3 000 r/min离心15 min，取上清，采用Elisa检测血管内皮生长因子、肝细胞生长因子与白细胞介素8的质量浓度，严格按照试剂盒说明书操作。
1.4.4 小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物修复兔尿道缺损实验
制作兔尿道缺损模型：取30只新西兰大白兔，耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，仰卧位固定在手术台上，暴露腹部及会阴，常规消毒、铺巾，将F18普通硅胶管留置于膀胱内，充分引流排空膀胱内残余尿液，然后将导尿管注射16×104 U的庆大霉素、250 mL生理盐水灌洗清洁膀胱。在阴茎头前断缝牵引线，以尿管做支撑，自阴茎腹侧中部取纵行切口约3.5 cm，依次切开后暴露尿道。沿尿道壁钝性分离至尿道后壁，完全游离出中段尿道，切除约3 cm尿道，止血。切除尿道后，采用随机数字表法分3组干预：单独材料组(n=10)将单独的小肠黏膜下层脱细胞基质缝合成管状，利用可吸收缝合线与尿道断端缝合；对照组(n=10)将接种骨髓间充质干细胞的小肠黏膜下层脱细胞基质缝合成管状(将骨髓间充质干细胞接种于小肠黏膜下层脱细胞基质在体外共培养48 h后进行修复实验，细胞数量为4×106个)，利用可吸收缝合线与尿道断端缝合；实验组(n=10)将小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物缝合成管状，利用可吸收缝合线与尿道断端缝合。术后1周肌注青霉素抗感染治疗，2周后拔除导尿管。
尿道造影与尿动力学检查：材料植入后12周，麻醉实验动物后进行逆行尿道造影与尿动力学检查，检测尿道通畅情况与尿道压力。
重建尿道标本病理切片观察：造影及尿动力学检查后处死实验动物，去除重建尿道组织，纵行切开尿道，置入多聚甲醛中固定后石蜡包埋，分别进行苏木精-伊红染色、Msson染色、AE1/AE3免疫组化染色、ɑ-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色与CD31免疫组化染色。①苏木精-伊红染色方法：切片脱蜡后，置于梯度乙醇中各处理1 min，苏木精染色5 min，1%盐酸乙醇分化20 s，稀氨水返蓝5 s，伊红染色5 min，梯度乙醇处理脱水，二甲苯透明处理后封固。②Masson染色方法：切片脱蜡，苏木精染色5 min，1%盐酸乙醇分化20 s，丽春红染色5 min，磷钼酸染色1 min，苯胺蓝染色5 min，二甲苯透明后封固。③免疫组化染色方法：切片脱蜡，梯度乙醇处理，置入pH=6柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复，滴加体积分数3%过氧化氢阻断内源性过氧化氢酶，滴加一抗室温孵育1.5 h，伊红染色3 min，滴加酶标二抗室温下孵育25 min，滴加DAB显色剂孵育4 min，苏木精复染，盐酸乙醇分化，二甲苯透明后封固。利用Image J软件测量免疫组化染色阳性区域面积。
1.5 主要观察指标 各组脐静脉内皮细胞的迁移、成血管及血管生成因子分泌情况，各组兔的尿道造影、尿动力学检查及重建尿道切片病理观察结果。
1.6 统计学分析 采用 SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以x±s表示。两组组间比较行独立样本 t检验；单一指标组间整体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经内蒙古医科大学附属医院院生物统计学专家审核。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
