2.1  大鼠角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养体系中的形态以及角膜缘干细胞中β-catenin的表达  对照组角膜缘干细胞在3D-Matrigel微环境中聚集成细胞球生长，实验组角膜缘干细胞在3D-Matrigel微环境中依旧呈球形生长，见图1A。用免疫荧光实验方法检测β-catenin在细胞中的表达，对照组角膜缘干细胞中未见β-catenin在胞浆或者细胞核内聚集，实验组可见β-catenin在角膜缘干细胞的细胞浆和细胞核内聚集，见图1B。

2.2  Wnt信号通路激活对于角膜缘干细胞干性及增殖能力的影响  实验组和对照组角膜缘干细胞中反映细胞干性的指标(P63α，CK12)以及反映细胞功能的指标(CEBPδ)差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图2A；实验组角膜缘干细胞中Ki-67表达明显升高，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2B；克隆形成实验的数据显示，实验组总克隆形成率较对照组明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，其中实验组全克隆形成率较对照组多，实验组旁克隆形成率较对照组少，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图2C。

2.3  治疗组与对照组角膜缘干细胞缺乏症大鼠角膜修复情况以及形态学变化  裂隙灯观察发现对照组大鼠角膜组织水肿明显，而治疗组大鼠角膜组织在治疗后第2天达到水肿高峰后逐渐减轻；在治疗第4天，治疗组与对照组相比角膜混浊程度明显减轻，同时上皮修复较对照组明显好转。荧光染色后显示治疗组角膜上皮染色阴性，上皮完整修复较好，而对照组大鼠角膜荧光染色阳性，见图3A；在细胞治疗后第4天临床混浊评级结果显示：治疗组大鼠较对照组大鼠角膜混浊评分明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05) (n= 12)，见图3B。治疗第4天处死大鼠，取角膜组织行苏木精-伊红染色，对照组角膜上皮细胞形态大小不一，排列紊乱，同时可见杯状细胞增生；而治疗组大鼠角膜上皮细胞形态一致，大小较均一，排列整齐，未见杯状细胞增生，见图3C。

2.4  治疗组与对照组角膜缘干细胞缺乏症大鼠角膜组织中β-catenin的表达  为了进一步证明Wnt信号通路在角膜修复过程中的作用，在治疗第4天处死大鼠后，使用免疫荧光染色检测β-catenin在角膜组织中的表达，发现治疗组大部分角膜上皮细胞中β-catenin在细胞浆以及细胞核内聚集，而对照组角膜上皮细胞中β-catenin仅是弱阳性，未见在胞浆聚集或者进核，见图4。

干细胞是一群具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞^[1]，通常以静止和激活2种状态存在于机体内^[2]，通过自我更新和定向分化从而维持组织细胞的动态平衡。角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)位于角膜缘上皮基底层的特殊结构“Vogt栅栏”处^[3]，属于单能干细胞，其增殖和移行对于维持角膜上皮的完整和正常功能至关重要^[4]。临床上角膜直接损伤或者角膜干细胞微环境破坏都有可能导致角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cells deficiency，LSCD)的发生，例如化学烧伤、长时间使用角膜接触镜^[5]、先天性无虹膜等^[6]。现阶段临床上角膜缘干细胞缺乏症的治疗方法仍以手术为主，虽然以细胞为基础的治疗策略被推荐用于角膜缘干细胞缺乏症的治疗^[7-8]，但是其远期效果并不明确^[9]，仍然是棘手的医学难题。现阶段大家之所以热衷于将干细胞用于角膜缘干细胞缺乏症的治疗，主要是由于角膜干细胞能通过自我更新、定向分化从而修复角膜，远期效果不明确主要是干细胞在自我更新、定向分化中的调控机制尚未完全研究清楚。对于角膜缘干细胞信号通路的研究或许能够为解决角膜缘干细胞缺乏症的治疗难题提供理论基础和新的思路^[10]。

Wnt信号通路经典途径是以β-catenin作为核心分子完成信号转导^[11]，在多种干细胞的增殖和分化中起到至关重要的调节作用^[12]。该研究通过在角膜缘干细胞培养体系中加入氯化锂激活Wnt信号通路从而研究Wnt信号通路对角膜缘干细胞干性及功能的影响^[13]，为解决角膜缘干细胞缺乏这一难题提供理论基础及新途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  体外细胞分子生物学及体内动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2016年2月至2017年12月在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室和华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  健康SPF级雄性SD大鼠50只(用于细胞培养30只，用于体内实验20只)，七八周龄，体质量180- 220 g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。经裂隙灯筛查确认角膜透明无活动性炎症。动物实验过程中的设计、方法和实施符合美国视觉与眼科研究协会(ARVO)声明以及华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委员会的批准(批准号：[2014]伦审字037号)，实验动物均在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

1.3.2  实验试剂及仪器  DMEM/F12培养基、Knockout血清代替物、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶/EDTA(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；Matrigel^TM Basement Membrane Matrix(美国BD公司)；中性蛋白酶Ⅱ(美国Roche公司)；氯化锂(美国Sigma-Aldrich公司)； Anti-beta Catenin抗体(美国Abcam公司)；显微镜(日本奥林巴斯公司)；细胞培养板、培养皿、培养瓶(美国Corning公司)；实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  细胞分离及培养  取SD大鼠角膜缘组织置于含有Dispase Ⅱ(10 g/L)的改良胚胎干细胞培养基(MESCM)中放入培养箱30 min，在显微镜下机械分离获得完整的角膜缘上皮细胞片。将角膜缘上皮细胞片置于0.25%胰蛋白酶/ 1 mmol/L EDTA中放入培养箱15 min，中止消化得到单个角膜缘干细胞。将单个角膜缘干细胞以1.2×10⁵/cm²密度接种于提前孵育好的3D-Matrigel培养体系中，实验组培养体系中加入Wnt信号通路激活剂氯化锂(500 μmol/L)，对照组不加氯化锂，每隔2 d换液1次。培养第7天，收集角膜缘干细胞备用。

1.4.2  实时定量PCR检测p63α、CK12、Ki-67和CEBPδ基因表达  采用实时定量PCR检测实验组和对照组干性指标p63α、CK12，增殖水平指标Ki-67以及细胞功能指标CEBPδ的表达。提取各样本RNA，反转录成cDNA，-20 ℃保存，引物信息见表1。循环条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火并延伸30 s，共40个循环，按2^-ΔΔCt 法计算各目的基因的相对表达量。

1.4.3  免疫荧光染色检测Wnt信号通路  将收集的细胞悬液利用细胞甩片机制作成细胞甩片，40 g/L多聚甲醛固定15 min后使用山羊血清封闭，随后加入Anti-β-Catenin抗体，放入湿盒4 ℃孵育过夜，第2天加入荧光二抗，放入湿盒37 ℃避光1 h，复染核后封固，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.4.4  克隆形成实验  首先制备3T3滋养细胞层，在3T3-J2细胞中加入4 mg/L丝裂霉素C，37 ℃处理2 h，按2×10⁴/cm²密度接种于6孔板中，加入DMEM培养基培养 24 h后备用。收集培养第7天的角膜缘干细胞接种于预先准备的已接种3T3滋养层细胞的6孔板中，每孔接种1 000个角膜缘干细胞，每5 d换液1次，2周后使用罗丹明B染色后，在显微镜下计数克隆数量，克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.4.5  角膜缘干细胞缺乏症动物模型的建立及治疗  20只SD大鼠麻醉起效后，将浸有1 mol/L NaOH溶液的无菌滤纸环(外径8 mm，内径4 mm)覆盖于双眼角膜缘30 s，取下滤纸，生理盐水反复冲洗2 min，刮除角膜中央及角膜缘处的上皮。术后每天给予可乐必妥滴眼液滴眼(4次/d)，隔日使用裂隙灯观察眼表情况。术后2周对角膜缘干细胞缺乏动物模型进行评分，同时满足角膜荧光染色评分≥2分、角膜混浊度≥2分以及角膜新生血管≥3分者纳入后续实验^[14]，见表2。将满足条件的大鼠分为2组，其中治疗组结膜下注射激活Wnt信号通路后的异体角膜缘干细胞(3×10⁵/200 μL)，对照组注射等量PBS。治疗后隔日观察大鼠眼表情况。

1.4.6  苏木精-伊红染色观察角膜缘干细胞缺乏模型大鼠角膜上皮形态  细胞治疗后第4天处死大鼠，分别获取治疗组和对照组大鼠角膜缘组织，用40 g/L多聚甲醛在4 ℃条件下固定24 h，脱水进行石蜡包埋；切片机制作4 μm切片，烤片及脱蜡，加入苏木精染色5 min，1%的盐酸乙醇分化  4 s，加入1%水溶性伊红2 min，无水乙醇脱水，风干封固，倒置显微镜下观察并采集图像。

1.4.7  石蜡切片免疫荧光染色检测角膜组织中Wnt信号通路状态  取上述石蜡切片进行烤片及脱蜡后进行抗原修复，随后加入Anti-β-Catenin抗体，放入湿盒4 ℃孵育过夜，第2天加入荧光二抗，放入湿盒37 ℃避光1 h，复染核后封固，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.5  主要观察指标  ①大鼠角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养体系中的形态以及β-catenin的表达；②Wnt信号通路激活对于角膜缘干细胞干性及增殖能力的影响；③结膜下注射角膜缘干细胞后，大鼠角膜恢复情况以及形态学变化；④结膜下注射角膜缘干细胞后，大鼠角膜组织中β-catenin的表达。

1.6  统计学分析  使用SPSS 20.0统计软件处理，数据以x(_)±s表示，比较组间差异采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

角膜缘干细胞是角膜上皮细胞自我更新以及角膜损伤修复的细胞基础。与其他成体干细胞相同，部分角膜缘干细胞进入自我更新状态，维持其干细胞特性，保持干细胞池的稳定，另一部分角膜缘干细胞则转化成为短暂扩充细胞^[15]，最终增殖和终末分化成为角膜上皮细胞，完成角膜上皮细胞的更新修复。成体干细胞通常都是以静止和激活2种状态同时存在于体内^[2，16]，从而维持干细胞的动态平衡。临床上角膜缘干细胞缺乏症患者，角膜组织由于缺乏干细胞，导致角膜透明性无法维持，明显影响患者视力及生活质量，使得治疗角膜缘干细胞缺乏症成为急需解决的临床难题。体外培养具有特殊功能的角膜缘干细胞有望为解决角膜缘干细胞缺乏症这一难题提供新手段^[17]。

Matrigel是由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等成分构成的一种基质胶，可用来模拟体内细胞的基底膜，而基底膜是多种干细胞生存所需的重要微环境。因此该研究使用3D-Matrigel体外培养体系模拟角膜缘上皮干细胞生长微环境。

既往研究表明，当干细胞相互聚集成球样生长时，通过细胞间紧密接触能有效减少干细胞自身分化，使干细胞的干性得以维持^[18]。研究结果显示：在3D-Matrigel体外培养体系中，角膜缘干细胞聚集成球形生长，实验组和对照组之间细胞球形态大小以及松散程度均无明显差异。由此作者推测3D-Matrigel培养体系有利于角膜缘干细胞干性的维持，是一种理想的角膜缘干细胞培养体系。

Wnt信号通路在维持多种干细胞特性中起重要作用，与此同时还参与调控干细胞分化^[19]。对于角膜缘干细胞，Wnt信号通路是否亦能对其细胞特性及分化产生重要的调控作用呢？作者通过在实验组培养体系中加入氯化锂(Wnt信号通路激活剂)^[20]，激活角膜缘干细胞中Wnt信号通路，观察Wnt信号通路对角膜缘干细胞特性及分化的影响，结果显示：实验组角膜缘干细胞中β-catenin在细胞浆和细胞核内聚集，表明实验组角膜缘干细胞的Wnt信号通路被激活，而对照组角膜缘干细胞中Wnt信号通路处于未激活状态。Wnt信号通路激活后角膜缘干细胞的干性及功能发生了哪些变化呢？qRT-PCR实验结果显示：角膜缘干细胞干性标志物p63α^[21]、分化标志物CK12^[22]、细胞功能指标CEBPδ^[23]，三者在实验组和对照组之间差异均无显著性意义(P > 0.05)，说明当Wnt信号通路激活后，角膜缘干细胞干性得到维持。通过对反映细胞增殖能力的指标Ki-67进行检测^[24]，发现实验组角膜缘干细胞的Ki-67水平明显升高 (P < 0.05)，说明Wnt信号通路激活后角膜缘干细胞的增殖能力明显增强。干性得到维持同时增殖能力增强是否说明Wnt信号通路的激活使得角膜缘干细胞进入到自我更新状态呢？于是进一步行克隆形成实验，克隆形成实验是检测干细胞功能常用的实验方法，结果显示：总克隆形成率实验组较对照组明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，其中实验组全克隆形成率较对照组多，实验组旁克隆形成率较对照组少，差异均有显著性意义(P < 0.05)。众所周知，全克隆是由年轻的干细胞形成，而旁克隆多由暂时放大细胞(TAC)形成，此处实验组产生较多的全克隆，较少的旁克隆，说明实验组角膜缘干细胞相对于对照组属于较年轻的干细胞，同时具有相对较强的增殖能力，这种状态类似于干细胞的自我更新。

综合以上数据，Wnt信号通路对角膜缘干细胞干性并没有表现出明显的调控作用，但是Wnt信号通路的激活明显增强了角膜缘干细胞的增殖能力。因此作者推测Wnt信号通路的激活促使角膜缘干细胞处于一个并未分化的高增殖能力状态，类似干细胞的自我更新状态。作者猜想Wnt信号通路激活的角膜缘干细胞可能是治疗角膜缘干细胞缺乏症的理想细胞，为临床角膜缘干细胞缺乏症的治疗提供了新的思路。

为了进一步验证作者的猜想，首先建立大鼠角膜缘干细胞缺乏症模型(化学烧伤法^[25-26])，然后以激活了Wnt信号通路的角膜缘干细胞为治疗材料，以结膜下注射的方式对角膜缘干细胞缺乏症大鼠进行治疗。实验结果显示经过细胞治疗后大鼠角膜上皮修复良好，角膜混浊程度评分较对照组明显降低。治疗组大鼠角膜组织中发现β-catenin在上皮细胞的胞浆和细胞核中聚集，说明起到修复作用的正是Wnt信号通路激活了的角膜缘干细胞，再次验证Wnt信号通路激活后的角膜缘干细胞在角膜缘干细胞缺乏症大鼠角膜上皮修复过程中起到了关键性的作用。

虽然Wnt信号通路调控和影响细胞生长和分化的机制尚未明确，但是该信号通路对干细胞的调控起到非常重要的作用已取得广泛共识^[27-28]。因此对于Wnt信号通路如何促进角膜缘干细胞增殖同时保持细胞干性的具体机制，值得进一步深入研究。

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文题释义：

Wnt信号通路：Wnt信号通路是一条高度保守的信号通路，在干细胞调控中发挥重要作用。当细胞外Wnts与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合导致GSK3β失活，β-catenin在胞质中积累继而向胞核转位，标志着Wnt通路被激活。β-catenin在细胞核中与转录因子Tcf /LEF结合启动下游基因而发挥功能。

角膜缘干细胞：角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，角膜缘干细胞存在于角膜缘的Vogt栅栏结构中，属于单能干细胞，在角膜损伤修复中发挥重要作用。角膜缘干细胞缺乏是由于眼表各类损伤(化学伤、严重的感染等)或者基质微环境异常(先天性无虹膜、放射线所致角膜病)导致角膜上皮被结膜上皮侵犯和替代。

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角膜缘干细胞是正常角膜上皮细胞增殖和分化的源泉，是维持角膜透明性及正常功能的基础条件。临床上各种眼表损害或者感染均可引起角膜缘干细胞缺乏从而导致角膜上皮不能正常更新，最终造成角膜结膜上皮化、新生血管长入以及上皮大片脱落，患者出现明显眼部刺激症状，视力严重下降。目前由于传统的穿透角膜移植对这类疾病治疗无效，临床上主要是采用自体或者异体角膜缘移植或体外角膜缘干细胞培养移植，并且取得一定的疗效。体外培养角膜缘干细胞并进行移植已成为治疗此类疾病的主要方法，因此发展和完善角膜缘干细胞培养技术有着重要的意义。Wnt信号通路是一条高度保守的信号通路，在干细胞调控中发挥重要作用。因此利用Wnt信号通路对角膜缘干细胞体外培养系统进行改良，有助于提高角膜缘干细胞的体外培养效率，为临床治疗角膜缘干细胞缺乏提供新思路。

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