细胞因子与膝骨关节炎关节软骨损伤的修复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.36.023

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
软骨细胞：位于软骨陷窝内。幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层，单个分布，体积较小，呈椭圆形，长轴与软骨表面平行，越向深层的软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形，染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴。成熟的软骨细胞多2-8个成群分布于软骨陷窝内，这些软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而成，称为同源细胞群。电镜下，软骨细胞有突起和皱褶，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体。在组织切片中，软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。
关节退行性变：就是指随着时间的流失，年龄的增长，在人体关节处(膝关节、腰椎、颈椎关节等)，尤其是关节软骨会出现轻重不同的衰退、老化、退化现象，严重的成为病变，引发骨刺演化为各种关节疾病，如膝关节炎、髋关节炎、腰椎间盘突出等，并在临床上表现为各种身体不适感，影响工作学习和生活。临床上以中老年人发病多见，特别是50-60岁的老年人，女性多于男性。

摘要
背景：膝骨关节炎以关节及关节软骨退行性病变为主，其细胞生物学变化主要包括软骨细胞增殖和凋亡。关节软骨的再生能力较差，组织工程软骨构建对促进关节软骨缺损修复有重要意义，而细胞因子在组织构建和软骨修复中起到关键作用。
目的：对影响关节软骨损伤修复及影响软骨细胞凋亡的主要调控因子做一综述。
方法：在PubMed和万方数据库检索1999至2016年于关节软骨缺损修复、影响关节软骨损伤修复及影响软骨细胞凋亡的主要调控因子相关的中文和英文文献，对纳入的44篇文献进行归纳分析。
结果与结论：人体各种组织中的细胞因子与关节软骨损伤修复、软骨细胞凋亡及骨关节炎的病理改变有密切关系，这些细胞因子参与了软骨细胞的破坏、软骨基质的降解、滑膜的反应性炎症、骨赘形成等。关节软骨损伤后白细胞介素1β、白细胞介素6 、肿瘤坏死因子α表达升高，阻断这些促炎因子的表达可以抑制软骨损伤。胰岛素样生长因子、转化生长因子等细胞生长因子对软骨细胞增殖和基质合成有重要调节作用，多种因子通过复杂的调节路径发挥作用，参与关节软骨损伤修复和重建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4047-6858(朱瑜琪)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 关节软骨损伤, 修复, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Knee osteoarthritis is a joint and articular cartilage degenerative disease, and its biological changes mainly include proliferation and apoptosis of chondrocytes. Articular cartilage holds poor regeneration ability, and tissue-engineered cartilage is of great significance for the articular cartilage repair, while cytokines is a major concern for this repair process.
OBJECTIVE: To overview the main regulatory factors involved in the articular cartilage repair and chondrocyte apoptosis.
METHODS: PubMed and WanFang databases were retrieved for the literature addressing articular cartilage repair and main regulatory factors involved in articular cartilage repair and chondrocyte apoptosis published from 1999 to 2016. Finally 44 eligible articles were included for analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Various cytokines in different human tissues are closely related to articular cartilage repair, chondrocyte apoptosis and pathological changes of osteoarthritis, which are involved in chondrocyte damage, degradation of cartilage matrix, synovial degeneration and periostosis. There is an increase in the levels of interleukin 1β and 6, and tumor necrosis factor α following articular cartilage injury. Thereafter, blocking the expression of these cytokines can protect the articular cartilage from damage. Insulin-like growth factor and transforming growth factor play an important regulatory effect on the chondrocyte proliferation and matrix synthesis. Furthermore, various cytokines regulate the articular cartilage repair and reconstruction via complicated pathways.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cartilage, Articular, Cytokines, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

朱瑜琪，王智耀，张帅，宁德花. 细胞因子与膝骨关节炎关节软骨损伤的修复[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(36): 5873-5878.

Zhu Yu-qi, Wang Zhi-yao, Zhang Shuai, Ning De-hua. Regulatory factors in the articular cartilage repair of knee osteoarthritis [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(36): 5873-5878.

图/表（结果） 2

2.1 关节软骨细胞凋亡软骨细胞凋亡在软骨退变过程中发挥重要作用，与骨关节炎的发生密切相关。凋亡是有核细胞在一定条件下，启动自身内部机制，通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程。软骨细胞凋亡的途径有一氧化氮途径和Fas途径。关节软骨损伤发生发展过程中，炎症反应细胞如巨噬细胞和受损靶细胞如软骨细胞在细胞因子诱导下可产生一氧化氮，一氧化氮通过细胞毒作用或细胞凋亡造成组织损伤^[10]。一氧化氮是一个无机的、气体性自由基团，已被证明是生物体内很重要的生物活性物质，参与了体内一系列生理和病理过程。它对不同细胞的细胞凋亡的影响是不同的。它能促进巨噬细胞细胞凋亡的发生，而对其他细胞的细胞凋亡起抑制作用，但它都是通过一氧化氮－GTP环化酶－环磷鸟苷途径发挥作用。一氧化氮因具有多种生物活性而成为近些年来生物学研究中的热点，在细胞信号传导过程中，一氧化氮通过开启或封闭细胞凋亡通路影响着细胞的存活。一氧化氮在骨与软骨的代谢中起着重要的作用。较高浓度的一氧化氮抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡；抑制软骨细胞合成软骨基质；促进软骨细胞糖酵解。因此，研究认为高浓度的一氧化氮可以造成关节软骨的退行性变而导致关节的膝骨关节炎病变。高浓度的一氧化氮可诱导兔关节软骨细胞凋亡，过高浓度的一氧化氮可引起细胞坏死。关节软骨损伤修复过程中细胞凋亡异常增高可能是影响软骨修复的原因之一。

软骨细胞凋亡受Bcl-2基因家族调控，Bcl-2蛋白家族在凋亡通路中起重要的调节作用。Bcl-2家族是一类基因结构相似的参与细胞程序性死亡或称之为凋亡调节的基因，其成员可分为两类，一类能促进细胞的程序性死亡，另一类能抑制细胞的程序性死亡。家族中各成员间可形成同源或异源二聚体，共同调节细胞内死亡和存活信息的平衡状态，最终决定细胞的命运。Bcl-xL是细胞程序性凋亡调节基因家族Bcl-2基因蛋白家族的重要成员之一。研究表明Bcl-xL可通过多条途径来抑制各种凋亡诱导因素，较Bcl-2具有更好的抗凋亡作用。除了抗凋亡作用，Bcl-xL还具有一定的抗炎作用。李志等^[11]的研究证实骨关节炎组关节软骨细胞凋亡调控基因Bcl-2表达较正常对照组明显增强，Bcl-2的调节作用可能与关节软骨损伤修复相关，抑制Bcl-2的表达改善软骨变性。研究表明在关节软骨损伤早期^[12]，关节软骨的Bcl-2蛋白和mRNA表达就开始发生明显改变，而且在骨关节炎关节软骨中p53基因表达的上调与骨关节炎关节软骨损伤进程密切相关，而Bcl-2 mRNA表达的下调随骨关节炎进程无明显差异，说明骨关节炎关节软骨中凋亡和抗凋亡的平衡被破坏，凋亡因素占支配地位，可能是骨关节炎的发病机制之一。

2.2 白细胞介素家族与关节软骨损伤修复白细胞介素1在关节软骨损伤修复和软骨细胞凋亡过程中发挥了重要作用，而作为白细胞介素1特异性的天然拮抗物白细胞介素1受体拮抗剂越来越受到广泛的重视。近年研究发现，白细胞介素1受体拮抗蛋白能延缓膝骨关节炎关节软骨损伤进程，通过转基因方法可以使白细胞介素1受体拮抗蛋白表达的增加。已有研究将白细胞介素1RⅡ和白细胞介素1Ra作为目的基因，通过调控白细胞介素1活性来达到保护软骨和修复关节软骨损伤的作用^[13-14]。有研究显示将白细胞介素1受体拮抗剂蛋白(IL-1Ra)结合胰岛素样生长因子1转染软骨细胞或注入关节腔^[14]。培养7周后在关节滑液中可以检测到高表达的白细胞介素1受体拮抗剂和胰岛素样生长因子1。在体外，白细胞介素1受体拮抗剂蛋白结合胰岛素样生长因子1可以促进软骨细胞增殖，促进葡萄糖胺聚糖和Ⅱ型胶原合成，抑制软骨细胞凋亡和一氮化氮合成。同样在体外白细胞介素1受体拮抗剂蛋白结合胰岛素样生长因子1可以诱导Ⅱ型胶原合成增加，减少关节滑液中一氮化氮和葡萄糖胺聚糖的浓度。二者共同表达对软骨缺损修复。

虽然白细胞介素1在膝骨关节炎发病机制中具有重要作用，而白细胞介素1β在整个致炎过程中处于核心地位。沈鹏飞等^[15]证实滑膜细胞自发分泌白细胞介素1β可能与关节的炎症发生、发展密切相关，可能是关节滑液中白细胞介素1β的主要来源。在众多的细胞因子中，白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α是介导炎症最重要的细胞因子^[16]。何飞宇等^[17]研究发现肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β可能在炎症的不同时期发挥作用，其中肿瘤坏死因子α主要作用于炎症早期。白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α可以明显减少基底细胞迁移，并且抑制生长因子的促进作用，减少了软骨的潜在再生可能。抑制白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的分泌可以促进软骨基质的合成和软骨修复。

炎性细胞因子白细胞介素6是一种多肽，属于白细胞介素的一种。最早发现在白细胞中表达作为细胞间信号传递的手段。白细胞介素6由2条糖蛋白链组成；1条为α链，相对分子质量80 000；另1条为β链，相对分子质量130 000。α链缺少胞内区，只能以低亲合性与白细胞介素6结合，所形成的复合物迅即与高亲和性的β链结合，通过β链向细胞内传递信息。白细胞介素6作为一种来源广泛的多功能细胞因子，在关节软骨损伤修复过程中也起关键作用(表1)。

2.3 肿瘤坏死因子与关节软骨损伤修复肿瘤坏死因子是引起膝骨关节炎关节软骨损伤最主要的因子之一。肿瘤坏死因子α是一类促炎症细胞因子，通常由全身各组织中的巨噬细胞产生。生理条件下具有生物学活性的人肿瘤坏死因子α是一个紧密的三聚体，其活性位点位于两个相邻亚基之间的V型结构域，肿瘤坏死因子α两种不同的受体，分别介导不同的生物学活性，在对肿瘤坏死因子α结构与功能研究的基础上，人们对其N末端、C末端和p75受体结合位点进行基因改造。邓廉夫等^[21]研究发现骨关节炎滑液中高水平的肿瘤坏死因子α与其血清中异常升高的肿瘤坏死因子α和滑膜细胞变性有关，而急性关节内创伤的滑液中高水平的肿瘤坏死因子α可来源于变性的滑膜细胞。滑液中肿瘤坏死因子α的异常升高和滑膜细胞变性相关，是骨关节炎发生、发展的重要介导因素。此外，肿瘤坏死因子α在软骨组织中的表达显著高于滑液。肿瘤坏死因子α通过抑制软骨基质合成、诱导基质金属蛋白酶产生而在膝骨关节炎的软骨破坏中发挥重要作用^[22-23]。目前已发现肿瘤坏死因子受体存在两种形式即P55和P75。但对于该两种受体在膝骨关节炎软骨细胞中的分布，及在肿瘤坏死因子α诱导基质金属蛋白酶产生中的作用尚不清楚。膝骨关节炎中度严重程度以上患者关节滑液中肿瘤坏死因子α水平随膝骨关节炎严重性指数的增加而升高^[24]。骨髓间充质基质干细胞具有分化成软骨细胞的能力，有研究将来自滑液的骨髓间充质干细胞与肿瘤坏死因子α共培养，结果显示经肿瘤坏死因子α处理后，骨髓间充质干细胞糖胺聚糖(GAG)的产生减少^[25]，SOX-9，转化生长因子β1，聚集蛋白聚糖和II型胶原的水平减少，肿瘤坏死因子α可以抑制骨髓间充质基质干细胞成软骨分化。肿瘤坏死因子α直接参与了膝骨关节炎的发病，抑制肿瘤坏死因子α的表达水平可以有效促进软骨损伤的修复^[26]。

以往研究表明早期受损的软骨细胞在体外培养时容易产生去分化，在软骨细胞增殖过程中快速衰老或去分化不仅可以使其丢失软骨细胞表型，并可增加多种炎症介质产物^[27-29]。分子信号通路在关节损伤细胞增殖和分化过程中起重要作用，近年来，有关p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路在与骨代谢相关的破骨细胞、成骨细胞、软骨细胞生长、代谢及功能方面的研究倍受关注。通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性，减少磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)可以抑制软骨细胞凋亡，改善软骨退化。p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在骨关节炎关节软骨细胞凋亡和促炎性因子表达中起重要作用，将软骨细胞与白细胞介素1β和p38丝裂原活化蛋白激酶共培养后软骨细胞增殖减少，细胞凋亡明显增加，白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA表达增加，而经p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂处理的软骨细胞、白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA表达明显减少，说明抑制p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路可以抑制骨关节炎软骨细胞凋亡，减少骨关节炎软骨细胞促炎因子的表达。

2.4 转化生长因子与关节软骨损伤修复转化生长因子β在维持关节软骨正常和关节修复中有重要意义。转化生长因子β是由112个氨基酸残基组成的相对分子质量为25 000的双聚体活性多肽。转化生长因子β是转化生长因子超家族成员之一，分布于多种细胞组织中，在调节细胞增殖与分化、机体生长与发育、细胞外基质形成、免疫功能等方面均有重要作用^[30-32]。转化生长因子β具有广泛的生理效应，它在软骨细胞代谢中起着十分重要的作用，在体外，转化生长因子β可促进软骨基质分泌、细胞增生、骨软骨生成分化；在体内，短期关节腔内注射可增加骨和次级软骨细胞生成、骨软骨发生。体内转化生长因子β的诱导表达和基因转移给膝骨关节炎带来了新的治疗手段^[33-34]。软骨细胞中存在转化生长因子β蛋白及基因的表达，而外源性转化生长因子β的参与也刺激了成骨细胞的恢复和增殖。

转化生长因子β1是一个参与细胞生长、细胞增殖、分化和凋亡的分泌蛋白，并编码TGFB1基因。樊志强等^[35]证实转化生长因子β1关节腔内注射均能有效抑制骨性关节炎关节软骨的退变并增加软骨细胞再生，促进软骨基质合成，促进关节软骨损伤的修复。转化生长因子β1可以积极调节多种软骨细胞蛋白的表达，经转化生长因子β1处理的软骨细胞可以增加骨涎蛋白、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶13、组织金属蛋白酶抑制剂3、血管内皮生长因子和SMAD7的蛋白及mRNA水平，增强碱性磷酸酶活性。转化生长因子β1在软骨组织中的高表达可以促进损伤修复，改善骨组织结构和胶原沉积。有研究用酶联免疫吸附测定(ELISA)法观察了经白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)和转化生长因子β1转染的关节软骨滑液中骨关节炎关节滑液中白细胞介素1Ra和转化生长因子β1的表达，结果显示注射白细胞介素1Ra和转化生长因子β1后关节滑液中的白细胞介素1Ra和转化生长因子β1表达升高，说明注射白细胞介素1Ra和转化生长因子β1可以抑制软骨基质降解^[36]。骨形态发生蛋白和转化生长因子β3联合作用可增加Ⅱ型胶原蛋白，并诱导软骨再生，修复缺损的关节软骨^[37]。滑膜来源的间充质干细胞被认为是软骨再生有吸引力的细胞来源，三维环境对细胞的生长非常重要，滑膜外植体符合细胞生长的生理微环境，经转化生长因子β1和骨形态发生蛋白7处理后的滑膜外植体能够分泌和合成浅表层蛋白质(SZP)分泌，并促进其软骨形成分化。

转化生长因子β1在促进软骨生成中起到非常重要的作用，但其固有蛋白质不稳定，为了使转化生长因子β1表达稳定，研究将转化生长因子β1与生物材料如壳聚糖水凝胶，壳聚糖/聚乙烯醇复合构建的支架材料，不仅可以控制其释放，还可以为细胞黏附和生长提供环境，将经转化生长因子β1处理软骨细胞接种于经羟基磷灰石支架上构建组织工程软骨可以促进骨生长。

2.5 胰岛素样生长因子1 胰岛素样生长因子1是关节软骨生长发育的重要调节因子，可以促进软骨细胞合成软骨中的细胞外基质合成。胰岛素样生长因子1及其受体在软骨的发育及成年后重塑阶段均具有重要功能，并可能与膝骨关节炎关节软骨损伤具有促进作用。胰岛素样生长因子系统是一个复杂的体系，其构成主要包括胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子Ⅱ等成分。胰岛素样生长因1是在软骨发育和软骨自稳态调节中最重要的生长因子之一，以胰岛素样生长因子1作为研究对象也是近些年针对关节软骨损伤修复研究的热点^[38-39]。同时解志杰等^[40]也发现关节软骨细胞增殖和合成软骨基质的能力随着年龄增加而降低，伴随骨细胞凋亡发生率升高。并且随年龄增长，软骨细胞对胰岛素样生长因子1的反应性呈年龄相关下降，胰岛素样生长因子1仍可在一定程度上刺激软骨细胞增殖和蛋白多糖的合成^[41]。在衰老和去分化软骨细胞中转化生长因子β和胰岛素样生长因子1的水平减少，因此下调转化生长因子β和胰岛素样生长因子1的水平可以诱导软骨去分化，软骨修复能力减弱^[42]。有研究将软骨细胞在胶原支架上培养，并加入胰岛素样生长因子1，结果显示软骨细胞的代谢活性增加，减少了Ⅰ型胶原的表达，增加了Ⅱ型胶原的表达，生物支架材料结合胰岛素样生长因子1的作用可以靶向治疗关节软骨损伤^[43]。不同剂量的胰岛素样生长因子1对关节软骨全层缺损修复中软骨层和软骨下骨(SB)的影响，将负载胰岛素样生长因子1的胶原膜植入到软骨缺损处，结果显示高剂量的胰岛素样生长因子1有助于细胞存活，促进新生软骨形成和软骨完整性，低剂量的胰岛素样生长因子1可以促进软骨下骨修复和重建^[38]。有研究应用重组腺相关病毒介导的胰岛素样生长因子1载体观察其关节软骨损伤的早期修复，结果显示在软骨缺损区可以检测到胰岛素样生长因子1的高表达，重组腺相关病毒介导的胰岛素样生长因子1高表达可以刺激细胞增殖和基质合成，胰岛素样生长因子1的高表达可以减缓新生成软骨的终末分化和肥大，胰岛素样生长因子1可以增加软骨下骨RUNX2的表达，促进软骨下骨缺损的修复重建^[44]。胰岛素样生长因子1在关节软骨细胞中的稳定表达，可以通过募集软骨细胞，刺激软骨细胞增强软骨基质合成在软骨内环境稳定中起关键作用。

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引言

关节软骨作为关节的重要组成部分，与人的其他体细胞相比，处于关节内特殊的压力环境之中，具有独特的结构与力学特性，致使其代谢和功能也必然受到压力的影响和调控。关节软骨损伤主要与软骨细胞营养代谢、细胞外基质异常降解、生物力学平衡有关^[1]。经过软骨细胞外基质传导压力，软骨细胞暴露于各种各样的生物、力学信号。因此，导致关节软骨降解的过程比预期的更加复杂，分析单独一个因素的影响是非常困难的，但可以确定的是生物力学的加载对维持软骨的稳态是非常必要的。在关节软骨的生长发育中，生理性的生物应力刺激起到关键作用。超过生理水平的高强度静水压力不仅可直接影响软骨细胞新陈代谢，造成细胞损伤，引起细胞凋亡，还能通过抑制Ⅱ型胶原合成，促进白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶13的分泌表达，从而间接的导致软骨支撑作用和保护机制的减弱，加快关节软骨的退变，使正常的软骨细胞向骨关节炎样细胞转化，或加重膝骨关节炎的病理改变^[2]。膝骨关节炎其主要病理特征为受累关节的软骨细胞数量减少、关节软骨基质遭到破坏。病变涉及滑膜细胞、软骨、软骨下骨以及周围肌肉韧带等软组织，最终导致患者关节变形，关节功能障碍。

关节软骨损伤后修复能力较差，可以导致进行性的关节损伤，修复关节软骨损伤常用的方法包括骨移植和同种异体骨移植，常规治疗或关节软骨植入不能修复损伤的软骨，因此组织工程软骨移植物在软骨修复中广泛研究。有研究将鼻中隔软骨置于胶原膜上共培养制作组织工程软骨移植物，移植到骨缺损区后发现该移植物可以用于关于软骨损伤的修复。有研究比较了鼻中隔软骨和软骨细胞，将鼻中隔软骨和软骨细胞分别置于将Ⅰ/Ⅲ 胶原膜上培养，移植到软骨缺损区后鼻中隔软骨可以形成关节软骨结构并减少软骨下骨损伤区域，相对于软骨细胞，鼻中隔软骨对早期软骨缺损有修复作用^[3]。也有研究分离骨髓间充质干细胞于富血小板血浆和磷酸三钙支架中分化为成骨和成软骨细胞，然后将细胞支架移植物移植到软骨缺损区，组织病理学观察显示移植12周后骨缺损明显修复，成骨标记物碱性磷酸酶和骨γ羧基谷氨酸蛋白(bone γ-carboxyglutamate protein，BGLAP)的表达水平明显增加，骨髓间充质干细胞可作为组织工程软骨修复的种子细胞，磷酸三钙支具有良好的生物相容性和3D结构，可以促进细胞黏附、生长和增殖，富含细胞因子可以促进干细胞的分化及其功能^[4]。同样有研究将富血小板纤维蛋白结合骨髓间充质干细胞通过关节内注射到骨缺损区域，注射12周后软骨缺损面积减小，再生软骨的面积增大，并有透明样软骨组织形成，该方法可以替代自体软骨细胞移植修复骨缺损^[5]。在组织工程构建和关节软骨损伤发生发展过程中，细胞因子起着非常重要的作用，组织构建过程中加入细胞因子胰岛素样生长因子1和转化生长因子β可以为细胞黏附和生长提供环境，促进细胞的增殖和分化。在膝骨关节炎关节液中有大量炎症因子产生，如白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等，因此细胞因子在关节软骨损伤及软骨细胞凋亡过程中起重要作用^[6-9](图1)，这些细胞因子的作用并非单一作用，而是存在于一个复杂的调节网络之中。文章将对影响关节软骨损伤修复及影响软骨细胞凋亡的主要调控因子做如下综述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程