电针抑制Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2信号通路介导骨关节炎软骨超微结构退变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.32.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (32): 5134-5139.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.32.009

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

电针抑制Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2信号通路介导骨关节炎软骨超微结构退变

付长龙1，林洁1，赵忠胜1，吴广文1，洪秀娥2，郑春松1，林秋英3，戴一琛3，吴明霞2

(福建中医药大学， 1中西医结合研究院，3药学院，福建省福州市 350122；2福建中医药大学附属第二人民医院，福建省福州市 350003)

收稿日期:2017-07-27 出版日期:2017-11-18 发布日期:2017-11-15
通讯作者: 吴明霞，医学博士，主任医师，教授，博士生导师，福建中医药大学附属第二人民医院，福建省福州市 350003
作者简介:付长龙，男，1987年生，山东省济宁市人，汉族，福建中医药大学在读博士，主要从事中西医结合骨关节炎研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81373719)

Electroacupuncture inhibits the ultrastructural degeneration of osteoarthritic chondrocytes mediated by Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2 signaling pathways

Fu Chang-long1, Lin Jie1, Zhao Zhong-sheng1, Wu Guang-wen1, Hong Xiu-e2, Zheng Chun-song1, Lin Qiu-ying3, Dai Yi-chen3, Wu Ming-xia2

(1Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; 2the Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; 3College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China)

Received:2017-07-27 Online:2017-11-18 Published:2017-11-15
Contact: Wu Ming-xia, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, the Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
About author:Fu Chang-long, Studying for doctorate, Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
the National natural Science Foundation of China, No. 81373719

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路：Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路(ERK1/2通路)，位于MAPK信号通路的下游，外界刺激首先激活Ras，诱发连锁反应，活化的Ras进一步激活Raf，Raf激活MEK1/2，进而活化ERK1/2，ERK1/2进入细胞核，激活转录因子的表达，促进软骨细胞的异常增殖及肥大分化，引起软骨钙化、增生，最终形成骨关节炎，因此，ERK1/2信号的活化是决定软骨细胞转归的关键。PD98059作为该信号通路的抑制剂，可通过选择性、非ATP竞争性抑制MEK，进而阻断该信号通路。
电针：电针具有通络舒筋、消肿止痛的功效其在治疗膝骨性关节炎上，具有疗效可靠，不良反应小并且操作方便等优点，可有效缓解膝骨关节炎患者临床症状。

摘要
背景：前期研究发现，电针能有效抑制凋亡调控基因p38及Fas mRNA的表达，并降低MAPK信号通路的表达，从而抑制软骨细胞凋亡，同时电针可影响骨性关节炎软骨细胞JAK-STAT信号通路，并有效增加转化生长因子β1含量及促进关节软骨中STAT3，Smad3及LepR mRNA的表达以延缓关节软骨退变。
目的：观察电针对骨关节炎大鼠关节软骨超微结构及软骨组织中Ras，Raf，MEK1/2，ERK1/2 mRNA表达的影响。
方法：建立膝骨关节炎大鼠模型，造模成功后2周随机分为4组，模型组不进行电针干预，电针15，30 min组取双侧膝关节内、外膝眼，分别经电针治疗15，30 min，PD98059组经静脉注射细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059，另设正常饲养的大鼠作正常组对照，共干预3个月。
结果与结论：①透射电镜检测显示，与模型组比，PD98059抑制剂组、电针15，30 min组软骨细胞形态变化较小，细胞核较大，部分内质网池扩张，线粒体结构仍较清晰；②ELISA结果显示，与模型组比，PD98059抑制剂组、电针15，30 min组的肿瘤坏死因子α水平降低(P < 0.01)；③RT-PCR结果显示，与模型组相比，PD98059抑制剂组、电针15，30 min组的Ras，Raf，MEK1/2及ERK1/2 mRNA表达显著降低(P < 0.05或P < 0.01)；④结果说明，电针干预能够减轻膝骨关节炎模型大鼠软骨细胞损伤，降低膝关节部滑膜组织中肿瘤坏死因子α水平，下调关节软骨Ras，Raf，MEK1/2及ERK1/2 mRNA表达，从而对骨关节炎关节软骨发挥一定的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7862-752X(吴明霞)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 骨关节炎, 电针, 关节软骨, 软骨, 滑膜, 电针, Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that electroacupuncture (EA) could effectively inhibit the expression of p38 and Fas mRNA mediated by MAPK signaling pathways, to further inhibit the apoptosis of chondrocytes. Meanwhile, EA delays the degeneration of articular cartilage mediated by JAK-STAT signaling pathway through upregulating the expression levels of transforming growth factor β1 as well as the mRNA expression levels of STAT3, Smad3 and LepR.
OBJECTIVE: To explore the effect of EA on the cartilage ultrastructure and mRNA expression levels of Ras, Raf, MEK1/2 and ERK1/2 in the rat with knee osteoarthritis.
METHODS: The rat models of knee osteoarthritis were established, and randomized into four groups at 2 weeks after modeling: model group received no interventions; 15- and 30-minute EA groups were given EA at the Hsiyen (medical, extra) of bilateral knee joints for 15 and 30 minutes, respectively; PD98059 group was given the intravenous injection of extracellular signal-regulated kinase inhibitor PD98059. The intervention time was 3 months. Those rats received normal feeding served as blank control group.
RESULTS AND CONCLUSION: Transmission electron microscopy showed that compared with the model group, the chondrocytes in the 15- and 30-minute EA and PD98059 groups changed little, the nucleus was larger, partial endoplasmic reticulum cisterna expanded, and the mitochondria structure was clear. ELISA results showed that the 15- and 30-minute EA and PD98059 groups had a significant decrease in the level of tumor necrosis factor α compared with the model group (P < 0.01). RT-PCR revealed that the mRNA expression levels of Ras, Raf, MEK1/2 and ERK1/2 in the 15- and 30-minute EA and PD98059 groups were significantly downregulated (P < 0.05 or P < 0.01). These results indicate that EA can alleviate chondrocyte injury in the rat osteoarthritic model, reduce the level of tumor necrosis factor α in the synovium, and downregulated the expression levels of Ras, Raf, MEK1/2 and ERK1/2 mRNA, further delaying the chondrocyte degeneration in osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Knee Joint, Osteoarthritis

中图分类号:

R318

付长龙，林洁，赵忠胜，吴广文，洪秀娥，郑春松，林秋英，戴一琛，吴明霞. 电针抑制Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2信号通路介导骨关节炎软骨超微结构退变[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(32): 5134-5139.

Fu Chang-long1, Lin Jie1, Zhao Zhong-sheng1, Wu Guang-wen1, Hong Xiu-e2, Zheng Chun-song1, Lin Qiu-ying3, Dai Yi-chen3, Wu Ming-xia2. Electroacupuncture inhibits the ultrastructural degeneration of osteoarthritic chondrocytes mediated by Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2 signaling pathways[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(32): 5134-5139.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析经治疗干预3个月后，正常组大鼠在饲养过程中出现1只死亡，剩余29只。实验组经造模后，由于个体差异等原因，出现4只大鼠因麻醉死亡，此外因于造模后2周随机抽取4只大鼠进行模型鉴定，故实验组共剩余112只大鼠，在此基础上经随机分为4组并进行相关治疗后，模型组出现2只死亡，剩余26只；电针15，30 min组在实验过程中分别出现3只和5只死亡，分别剩余25及23只；PD98059组出现6只大鼠死亡剩余22只。最终125只大鼠进入结果分析。

2.2 电针后各组关节组织超微结构变化透射电镜超微结构结果示，正常组软骨细胞外形规则，近球形，表面敷着较丰富的微绒毛样突起，细胞核大，常染色质为主，少有异染色质，细胞间链接较紧密，线粒体数个呈现球星，胞质中有较为发达的粗面内质网且附着有核糖体，胞外基质见胶原原纤维(图1A)；模型组关节软骨细胞发生变性，形态结构改变，异染色质丰富、浓染，细胞器结构紊乱，内质网核糖体脱落，部分糖原聚集，呈现凋亡现象(图1B)；电针15，30 min组的软骨细胞形态变化较小，细胞核较大，模型结构不清，部分内质网池扩张，线粒体结构仍较清晰，糖原散在分布(图1C，D)；PD98059抑制剂组细胞外形近椭圆，表面有突起，胞核近椭圆，异染色质散在，糖原颗粒较多且散在分布，粗面内质网较发达，线粒体呈椭圆形散在分布(图1E)。

2.3 电针对骨关节炎大鼠膝关节部滑膜组织中肿瘤坏死因子α水平的影响 ELISA检测显示如表1示，与正常组比，模型组肿瘤坏死因子α水平表达明显升高(P < 0.01)，与模型组比，PD98059抑制剂组、电针15，30 min组肿瘤坏死因子α水平表达降低(P < 0.01)。见表1。

2.4 各组关节组织Ras，Raf，MEK1/2，ERK1/2 mRNA表达 RT-PCR结果如图2与表1所示，电针干预骨关节炎大鼠软骨后，可降低关节软骨中Ras及Raf、MEK1/2及ERK1/2 mRNA表达。模型组Ras及Raf，MEK1/2及ERK1/2 mRNA表达较正常组显著升高(P < 0.05或P < 0.01)，提示大鼠关节软骨受损；而PD98059抑制剂组、电针15，30 min组的mRNA表达较模型组均显著降低(P < 0.05或P < 0.01)。进而提示电针可缓解4%木瓜蛋白酶所致大鼠软骨退变，其治疗保护机制为降低退变软骨组织中Ras，Raf，MEK1/2及ERK1/2 mRNA表达。

参考文献

[1] Chen S, Huang Y, Chen W, et al. Protective effects of Tougu Xiaotong capsule on morphology and osteoprotegrin/nuclear factor-κB ligand expression in rabbits with knee osteoarthritis. Mol Med Rep. 2016;13(1):419-425.

[2] Li X, Zhen Z, Tang G, et al. MiR-29a and MiR-140 Protect Chondrocytes against the anti-proliferation and cell matrix signaling changes by IL-1β. Mol Cells. 2016;39(2):103-110.

[3] 刘献祥.基于陈可冀学术思想之骨性关节炎研究[J].康复学报, 2016,26(1):2-5.

[4] 林洁,付长龙,李俐,等.电针治疗膝骨性关节炎疗效的系统评价[J].康复学报,2016,26(4):52-58.

[5] Wu MX, Li XH, Lin MN, et al. Clinical study on the treatment of knee osteoarthritis of Shen-Sui insufficiency syndrome type by electroacupuncture. Chin J Integr Med. 2010;16(4): 291-297.

[6] Ye J, Wu G, Li X, et al. Millimeter wave treatment inhibits apoptosis of chondrocytes via regulation dynamic equilibrium of intracellular free Ca2+. Evid Based Complement Alternat Med. 2015:464161.

[7] 吴明霞,李西海,吴广文,等.电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(46):8551-8555.

[8] Wang X, Li F, Fan C, et al. Effects and relationship of ERK 1 and ERK 2 ininterleukin-1-induced alterations in MMP3, MMP13, typeII collagen and aggrecan expression in human chondrocytes. Int J Mol Med. 2011;27(4):583-589.

[9] Karnoub AE, Weinberg RA. Ras oncogenes: split personalities. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9(7):517-531.

[10] Roskoski R. ERK1/2 MAP kinases: structure,function,and regulation. Pharmacol Res. 2012; 66(2):105-143.

[11] 李西海,梁文娜,党传鹏,等.补肾壮筋汤抑制炎性细胞因子表达延缓骨关节炎软骨退变的研究[J].风湿病与关节炎, 2014,3(5): 20-25.

[12] 陈后煌,邵翔,李俐,等.肿瘤坏死因子α诱导大鼠软骨细胞凋亡模型的建立及鉴定[J].中国组织工程研究,2017,21(4):527-531.

[13] Fu CL, Zheng CS, Lin J, et al. Cibotium barometz polysaccharides stimulate chondrocyte proliferation in vitro by promoting G1/S cell cycle transition. Mol Med Rep. 2017;15(5): 3027-3034.

[14] 林木南,林艳红,刘献祥,等.温热疏密波对膝骨关节炎模型大鼠软骨细胞RAS/丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响[J].中医正骨, 2016,28(2):81-86.

[15] 高世超,殷海波,刘宏潇,等.MAPK信号通路在骨关节炎发病机制中的研究进展[J].中国骨伤,2014,27(5):441-444.

[16] O'Neill E, Kolch W. Conferring specificity on the ubiquitous Raf/MEK signalling pathway. Br J Cancer. 2004;90(2): 283-288.

[17] Liu L, Cao Y, Chen C, et al. Sorafenib blocks the raf/mek/erk pathway, inhibits tumor angiogenesis, and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66(24):11851-11858.

[18] 蒋成英,戴广海.Ras/Raf/Mek/Erk信号传导通路在肝细胞癌发生中的作用机制及在靶向治疗中的应用[J].中国肿瘤临床, 2008, 35(23):1377-1380.

[19] Karnoub AE, Weinberg RA. Ras oncogenes: split personalities. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9(7):517-531.

[20] Roskoski R. ERK1 /2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66(2):105-143.

[21] Goldring MB, Goldring SR. Osteoarthritis. J Cell Physiol. 2007;213:626-634.

[22] Wang X, Li F, Fan C, et al. Effects and relationship of ERK 1 and ERK 2 in interleukin-1β-induced alterations in MMP3,MMP13, type II collagen and aggrecan expression in human chondrocytes. Int J Mol Med. 2011;27(4):583-589.

[23] 李冠,甘丽娇,钟妙容.TNF-α与β1,4- GalT-I在骨关节炎滑膜炎症过程中的关系研究[J].临床和实验医学杂志, 2016,15(2): 137-139.

[24] 朱芳晓,周润华,石宇红,等.小白菊内酯对兔膝骨关节炎血清IL-1β及TNF-α的影响[J].中国中西医结合杂志, 2013,33(10): 1382-1384.

[25] 李迎雪,陈丹丹,张茹,等.双歧杆菌脂磷壁酸通过激活小鼠腹腔巨噬细胞MEK/ERK通路促进TNF-α表达[J].海南医学院学报, 2015,21(4):442-448.

[26] 包飞,张燕,吴志宏,等.电针治疗膝骨关节炎疗效观察及对软骨磁共振T2图的影响[J].中国针灸,2013,33(3):193-197.

[27] 刚嘉鸿,宓轶群,王华敏.电针与美洛昔康治疗早中期膝骨关节炎临床疗效比较随机对照研究[J].中国针灸,2016,36(5):467-470.

[28] 吴明霞,李西海,李俐,等.电针后血清对TNF-α诱导凋亡软骨细胞MAPK信号通路的影响[J].福建中医药,2011,42(6):43-45.

[29] 吴明霞,李西海,李俐,等.电针对骨性关节炎软骨细胞JAK-STAT信号通路表达的影响[J].福建中医药大学学报, 2011,21(6): 21-23.

[30] Yang X, He H, Zhou Y, et al. Pulsed electromagnetic field at different stages of knee osteoarthritis in rats induced by low-dose monosodium iodoacetate: Effect on subchondral trabecular bone microarchitecture and cartilage degradation. Bioelectromagnetics. 2017;38(3):227-238.

[31] Baudi P, Catani F, Rebuzzi M, et al. Morphological Study: Ultrastructural Aspects of Articular Cartilage and Subchondral Bone in Patients Affected by Post-Traumatic Shoulder Instability. Anat Rec (Hoboken). 2017;300(7): 1208-1218.

[32] Atik O?, Erdo?an D, Seymen CM, et al. Is there crosstalk between subchondral bone, cartilage, and meniscus in the pathogenesis of osteoarthritis? Eklem Hastalik Cerrahisi. 2016;27(2):62-67.

[33] Iijima H, Aoyama T, Tajino J, et al. Subchondral plate porosity colocalizes with the point of mechanical load during ambulation in a rat knee model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2016;24(2):354-363.

[34] Kaderli S, Viguier E, Watrelot-Virieux D, et al. Efficacy study of two novel hyaluronic acid-based formulations for viscosupplementation therapy in an early osteoarthrosic rabbit model. Eur J Pharm Biopharm. 2015;96:388-395.

[35] Prieto-Potin I, Largo R, Roman-Blas JA, et al. Characterization of multinucleated giant cells in synovium and subchondral bone in knee osteoarthritis and rheumatoid arthritis. BMC Musculoskelet Disord. 2015;16:226.

[36] Tomatsu S, Alméciga-Díaz CJ, Montaño AM, et al. Therapies for the bone in mucopolysaccharidoses. Mol Genet Metab. 2015;114(2):94-109.

[37] Asakawa-Tanne Y, Su S, Kunimatsu R, et al. Effects of enzymatic degradation after loading in temporomandibular joint. J Dent Res. 2015;94(2):337-343.

[38] Cheleschi S, Cantarini L, Pascarelli NA, et al. Possible chondroprotective effect of canakinumab: an in vitro study on human osteoarthritic chondrocytes. Cytokine. 2015;71(2): 165-172.

[39] Neu CP, Novak T, Gilliland KF, et al. Optical clearing in collagen- and proteoglycan-rich osteochondral tissues. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(3):405-413.

[40] Prokopovich P. Interactions between mammalian cells and nano- or micro-sized wear particles: physico-chemical views against biological approaches. Adv Colloid Interface Sci. 2014;213:36-47.

[41] Yan JY, Tian FM, Wang WY, et al. Age dependent changes in cartilage matrix, subchondral bone mass, and estradiol levels in blood serum, in naturally occurring osteoarthritis in Guinea pigs. Int J Mol Sci. 2014;15(8):13578-12595.

[42] Salzmann GM, Erdle B, Porichis S, et al. Long-term T2 and Qualitative MRI Morphology After First-Generation Knee Autologous Chondrocyte Implantation: Cartilage Ultrastructure Is Not Correlated to Clinical or Qualitative MRI Outcome. Am J Sports Med. 2014;42(8):1832-1840.

[43] Espino DM, Shepherd DE, Hukins DW. Viscoelastic properties of bovine knee joint articular cartilage: dependency on thickness and loading frequency. BMC Musculoskelet Disord. 2014;15:205.

[44] Speirs AD, Beaulé PE, Ferguson SJ, et al. Stress distribution and consolidation in cartilage constituents is influenced by cyclic loading and osteoarthritic degeneration. J Biomech. 2014;47(10):2348-2353.

[45] Roemer FW, Eckstein F, Hayashi D, et al. The role of imaging in osteoarthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2014;28(1): 31-60.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2016年1月至2017年3个月在福建中医药大学中西医结合研究院完成。

1.3 材料清洁级2月龄SD雄性大鼠150只，动物合格证号：SCXK(沪)2012-0002，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物饲养于福建中医药大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK(闽)2009-0001，分笼饲养，自由饮水，常规饲料喂养。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、造模、干预及取材大鼠150只，随机分为2组，即：正常组30只和实验组120只。实验组采用体积分数4%木瓜蛋白酶0.2 mL/次，隔3 d在大鼠双膝关节腔注射1次，共注射3次复制膝骨关节炎模型^[11]，于造模后2周，从造模组中随机抽取大鼠4只进行鉴定(其他大鼠将于治疗3个月后全部麻醉处死)，后将造模后的实验组大鼠随机分为4组，即模型组、电针15，30 min组及PD98059组，每组各30只。

实验组取双侧膝关节内、外膝眼，采用华佗牌一次性不锈毫针，规格：13.00 mm×0.25 mm(苏州医疗用品厂有限公司，中国，苏州)垂直刺入3 mm，华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪脉冲频率2 Hz，输出脉冲强度2 mA，每周治疗5 d，休息2 d，总共治疗12周。电针15，30 min组每日电针治疗15，30 min，PD98059组经静脉注射细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059(碧云天)5 mmol/L，0.2 mL/kg，1 d/次，共干预3个月；正常组和模型组正常饲养。

治疗时间按人和动物药物等效剂量换算：给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数，确定电针干预时间为 15 min等效于临床30 min的治疗时间。各组经治疗3个月后，水合氯醛麻醉取材。

1.4.2 透射电镜观察软骨细胞超微结构变化经治疗3个月后，每组随机选择3只，使用锐利刀片迅速切取中下1/3段股骨，依次使用体积分数3%戊二醛-15 g/L多聚甲醛- 0.1 mol/L PBS(pH 7.2)置于4 ℃冰箱进行前固定， 0.1 mol/L PBS (pH 7.2)漂洗三四次，体积分数1%锇酸-1.5亚铁氰化钾水溶液4 ℃后固定2 h，0.1 mol/L PBS (pH 7.2)再漂洗三四次，后经梯度乙醇进行脱水，无水丙酮加环氧树脂618包埋剂、纯618包埋剂35 ℃过夜，35 ℃ 24 h， 45 ℃ 12 h，60 ℃ 60 h进行包埋、聚合，UC-6超薄切片机(Leica公司，德国，慕尼黑)切片(厚约85 nm)，醋酸铀染色30 min，蒸馏水漂洗4次后用柠檬酸铅染色5 min，再次水洗4次，透射电镜下观察。

1.4.3 ELISA检测滑膜肿瘤坏死因子α水平取膝关节部滑膜组织，精确称质量1 g，加入10 mL PBS中，置于冰上进行超声粉碎，震荡充分后，调至12 000 r/min进行高速离心，取上清液，依据ELISA试剂盒(R＆D Systems公司，美国)操作步骤进行加样^[12]，完成后使用酶标仪(450 nm波长)进行肿瘤坏死因子α水平检测。

1.4.4 RT-PCR检测软骨组织Ras，Raf，MEK1/2，ERK1/2 mRNA表达 Ras，Raf，MEK1/2，ERK1/2 mRNA mRNA引物设计与合成见表1。

表1 引物信息

Table 1 Primer sequences

mRNA	序列	片段长度(bp)
Ras	正义：5’-TCG GAT TGG CTC GGG CTC CT -3’ 反义：5’-ACG CTC CAA GCG GTA GGT TGA -3’	442
Raf	正义：5’-TGG CGA TGT AGC TGT GAA AG -3’ 反义：5’- GTG AGC CCC TCA TGT AGG AA -3’	336
MEK	正义：5’-TCG GAT TGG CTC GGG CTC CT -3’ 反义：5’-TCT GGG GCC ATC CAC AGC AC -3’	295
ERK	正义：5’-GGC ACC AAC CAT TGA GCA GA -3’ 反义：5’-GAT CAT TGC TGA GGT GCT GTG TC -3’	101
GAPDH	正义：5’-ACG GCA AGT TCA ACG GCA CAG -3’ 反义：5’-GAA GAC GCC AGT AGA CTC CAC GAC -3’	149

采用Trizol法，提取经干预后各组软骨组织中的Total RNA，使用核酸蛋白检测仪进行浓度检测；将Oligo 1 μL，gDNA 1 μL，EnzymeMix1 μL，R-Mix 2×TS 10 μL，RNA体积=1 000/浓度(mg/L)，DEPC水体积=7-RNA体积按照先加DEPC水，后浸在液面以下加RNA，最后再加总管的顺序在42 ℃ 1 h、70 ℃ 5 min、4 ℃保存条件下进行反转录；后进行PCR，操作移液枪准确加入Mix 10 μL、上游引物1 μL，下游引物1 μL，DEPC水7 μL，cDNA 1 μL配制公共管，即20 μL/管量。PCR条件为94℃ 4 min条件下首先进行预变性，循环35次(94 ℃ 30 s，退火58℃ 30 s，72℃ 45 s)，后置于72℃ 10 min，并于4℃保存；制备1.5%琼脂糖凝胶，上样后在100 V，70 mA，15 min条件下电泳，使用Bio-Rad Fluor-S ^TMMultiImager图象分析仪下扫描，经分析后拍照存档^[13]。

1.5 主要观察指标各组关节组织超微结构、肿瘤坏死因子α水平、Ras，Raf，MEK1/2及ERK1/2 mRNA表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件包进行分析，计量资料采用x(_)±s表示，组间数据比较采用单因素方差分析及LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

3.1 Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路参与调控骨关节炎软骨退变的病理进程 RAS/MAPK信号转导通路是介导骨关节炎软骨退变较为主要的一条信号通路，参与软骨细胞增殖分化凋亡及炎症反应作用等多种生理过程^[14-15]。Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路属于“MAPK”众多通路中的一员，其主要由一个小GTP结合蛋白连接激活的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白激酶级联反应，Raf，MEK，ERK是其重要组成部分。相关研究发现，该信号通路与骨关节的发生发展具有密切联系，其具体机制为，经炎症刺激后，受累关节处的炎症因子能够特异性地与细胞膜受体结合，经过信息传递激活胞内MAPK信号，MAPK将信号从细胞膜转移至细胞核内激活相关转录因子，参与细胞的多种生物学反应^[16-17]，经外源信号刺激传递，首先激活Ras，诱发连锁反应，活化的Ras进一步激活Raf，Raf激活MEK1/2，进而活化ERK1/2，ERK1/2进入细胞核，激活转录因子的表达，促进软骨细胞的异常增殖及肥大分化，引起软骨钙化、增生，最终形成骨关节炎，因此，ERK1/2信号的活化是决定软骨细胞转归的关键^[18-21]。

PD98059作为该信号通路的抑制剂，可通过选择性、非ATP竞争性抑制MEK，进而阻断该信号通路^[22]。肿瘤坏死因子α作为加剧软骨退变的主要炎性因子之一，可引起关节软骨基质的降解，并诱导软骨细胞凋亡，且强度范围与骨关节炎严重程度相并行^[23-24]，此外，相关研究发现，肿瘤坏死因子α可以增强ERK信号通路的活化程度，而其抑制剂能够显著抑制该通路的激活，二者具有密切的相关性^[25]。

3.2 电针抑制Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2信号通路介导骨关节炎软骨超微结构退变电针作为临床中治疗骨关节炎的常用方法之一，具有良性作用^[26-27]。在基础研究领域，前期研究发现，电针后血清能有效抑制凋亡调控基因p38、Fas mRNA，并降低MAPK信号通路的表达，从而抑制软骨细胞凋亡^[28]，并影响骨性关节炎软骨细胞JAK-STAT信号通路，有效增加TGF-β1含量及促进关节软骨中STAT3，Smad3及LepR mRNA的表达进而延缓关节软骨退变^[29]。鉴于关节软骨超微结构的改变是骨关节炎的重要证据之一^[30-45]，实验结果发现，与模型组相比，经电针及PD98059抑制剂干预后，大鼠关节软骨超微结构获得改善，提示两者均可缓解体积分数4%木瓜蛋白酶所致大鼠软骨细胞的超微结构的异常改变；此外，与模型组相比，实验干预后电针组和PD98059抑制剂组软骨中Ras，Raf，MEK1/2及ERK1/2 mRNA表达均显著降低，提示电针与PD98059抑制剂可通过抑制其表达，调节Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路，抑制炎症反应引起的软骨细胞凋亡，从而延缓OA软骨退变。实验结果示，电针15，30 min治疗膝骨关节炎疗效相当，在一定程度上可为临床操作提供参考，但实验毕竟只是单纯的动物实验，具体的临床疗效还有待于后期大样本多中心的随机对照临床试验验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

电针抑制Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2信号通路介导骨关节炎软骨超微结构退变

Electroacupuncture inhibits the ultrastructural degeneration of osteoarthritic chondrocytes mediated by Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2 signaling pathways

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	金涛, 刘林, 朱晓燕, 史宇悰, 牛建雄, 张同同, 吴树金, 杨青山. 骨关节炎与线粒体异常[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1452-1458.
[3]	张吉超, 董跃福, 牟志芳, 张震, 李冰言, 徐祥钧, 李佳意, 任梦, 董万鹏. 骨关节炎患者在不同步态角度下膝关节内部生物力学变化的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1357-1361.
[4]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[5]	肖阳, 龚立琼, 费静, 李雷激. 电针干预面神经损伤模型兔面神经核团中神经生长因子及其受体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1253-1259.
[6]	刘冬铖, 赵继军, 周子红, 吴沼锋, 俞颖豪, 陈宇浩, 冯德宏. 开放楔形胫骨高位截骨手术不同力线矫正参考方法的比较[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(6): 827-831.
[7]	王楠, 钱宇章, 谢林. 不同针刺方法治疗腰椎间盘突出症的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 813-820.
[8]	范建超, 徐派的, 韩永丽, 文彩玉珠, 张红星, 潘小丽. 电针足三里对功能性消化不良模型大鼠内脏高敏感性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 663-668.
[9]	董苗苗, 赖涵, 李曼玲, 许秀洪, 罗梦, 王文豪, 周国平. 电针干预脑缺血再灌注损伤模型大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 749-755.
[10]	许磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.
[11]	何俊君, 黄泽灵, 洪振强. 阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 694-699.
[12]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[13]	刘进, 李振, 郝慧琴, 王泽, 赵彩虹, 芦文静. 二妙散水提物调控胶原诱导性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎性因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 688-693.
[14]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[15]	张键, 林坚平, 周钢, 方业汉, 王本超, 吴永昌. MRI半定量评估早期膝骨关节炎软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 425-429.