局部应用重组人甲状旁腺激素(1-34)对即刻种植骨整合的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.26.019

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

甲状旁腺激素(1-34)：甲状旁腺激素是由人体甲状旁腺主细胞合成分泌的一条含84个氨基酸残基的多肽链，主要靶器官为骨组织、肾脏及小肠，是人体内调节钙磷平衡的重要激素之一。甲状旁腺激素(1-34)是人工合成的甲状旁腺激素片段，具有甲状旁腺激素的全部生物活性。

骨整合：在光学显微镜下，种植体与周围骨组织直接接触，无任何纤维组织介于其间，称为骨整合，又称骨性结合、骨融合。这种骨性结构由于将人工种植体与组织连接成为一个整体，可有效分散合力，且保证了种植体的稳固，又减少牙槽骨的萎缩与吸收。

背景：在小鼠胫骨种植模型的研究中，有学者发现负载重组人甲状旁腺激素(1-34)的CaP涂层种植体可在早期就显示强大的成骨作用，但并未将这种涂层应用于口腔环境中。

目的：分析局部应用重组人甲状旁腺激素(1-34)对兔即刻种植后骨整合的作用。

方法：将9只新西兰大白兔随机分为实验组(6只)和对照组(3只)，拔除每只兔上下4颗切牙后在拔牙窝下段填塞冻干骨，实验组24个拔牙窝上段即刻植入含有重组人甲状旁腺激素(1-34)的CaP涂层钛螺纹钉，对照组12个拔牙窝上段即刻植入CaP涂层钛螺纹钉。植入后4，8，12周获取完整上下颌骨标本，进行大体与组织学观察、扭矩实验测试、X射线及骨密度分析。

结果与结论：①两组螺纹钉周围新生骨量均随时间延长而升高，实验组螺纹钉周围X射线灰度值始终高于对照组(P < 0.05)；②实验组植入后不同时间点的扭矩值高于对照组(P < 0.05)；③植入后4-12周下颌骨标本组织学观察显示，实验组成骨细胞较为活跃，新生骨与成熟骨出现早于对照组，于植入4周时即可见大量新生血管，而对照组植入8周时仅可见少量新生血管；④结果表明，局部应用重组人甲状旁腺激素(1-34)能够促进早期种植体周围新骨形成，提高种植体-骨界面结合强度，增强种植体稳定性。

ORCID: 0000-0001-6273-9300(侯晓薇)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 重组人甲状旁腺激素(1-34), 局部应用, CaP涂层, 即刻种植, 骨再生, 骨整合

Abstract:

BACKGROUND: Based on a mouse model of tibial implantation, some scholars have found that the CaP-coated implant with recombinant human parathyroid hormone (1-34) (PTH(1-34)) shows strong osteogenesis effect at early stage, but this coating has not been applied in the oral environment

OBJECTIVE: To explore the role of local application of PTH(1-34) on immediate implant osseointegration .

METHODS: Nine New Zealand white rabbits were randomly divided into two groups (six in experimental group and three in control group). All of the tooth sockets were filled with heterogeneous freeze-dried bone firstly after four incisors of each rabbit were extracted. In the experimental group, a titanium screw with PTH(1-34) loaded CaP coating was implanted into each tooth socket, while in the control group, a titanium screw with only CaP coating was implanted. The animals were executed respectively at 4, 8, 12 weeks after operation, and the intact maxillary and mandibular specimens were harvested and tested by gross observation, bone density analysis, torque test, histologic al observation, X-ray observation.

RESULTS AND CONCLUSION: The gray value and maximum torque value of regenerated osseous tissue at different time points in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). Within 4-12 weeks after implantation, regenerated and mature bone tissue appeared earlier in the experimental group than the control group. A large amount of new blood vessels were seen in the experimental group at 8 weeks after implantation, while in the control group, there were only few new blood vessels. To conclude, the local application of PTH(1-34) can promote bone formation, improve the implant-bone bonding strength, and enhance the stability of the implant.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Dental Implants, Teriparatide, Osseointegration, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙智慧，郑宇，王俐杰，樊世锋，侯晓薇. 局部应用重组人甲状旁腺激素(1-34)对即刻种植骨整合的作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(26): 4210-4216.

Sun Zhi-hui, Zheng Yu, Wang Li-jie, Fan Shi-feng, Hou Xiao-wei.

The local application of recombinant human parathyroid hormone (1-34) promotes osseointegration of an immediate implant

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(26): 4210-4216.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 9只兔均进入结果分析。

2.2 大体观察结果所有术后实验动物均健康无死亡，术后1周创口愈合良好。定期检查见各时段植区周围牙龈无红肿、无破溃、无溢脓炎症表现。

9只实验动物共得36个标本，所有标本钛螺纹钉均无脱落。实验组钛螺纹钉未见松动现象，钛螺纹钉周围骨组织紧密包绕，未见纤维组织长入。对照组植入4周，部分钛螺纹钉松动，钛螺纹钉龈方周围存在角形骨缺损；植入8周，钛螺纹钉松动度有好转，骨缺损面积减小，植入12周，钛螺纹钉顶端周围有骨组织包绕。

2.3 X射线观察及骨密度分析结果

X射线观察结果：X射线片可见各标本钛螺纹钉均在位，两组钛螺纹钉周围新生骨量均随时间延长而升高。植入后4周时，两组拔牙窝内异种冻干骨与周围骨组织均无明显边界，实验组可见钛螺纹钉周围新生骨影像呈云雾状，包绕钛螺纹钉整体，外周皮质骨密度无降低；对照组钛螺纹钉周围较大透射区，新生骨云雾状不明显且钛螺纹钉顶端见骨缺损区。植入后8周时，两组钛螺纹钉-骨界面密度较4周均有明显升高，实验组新生骨量增多，密度与正常骨密度接近，新生骨界限不明显；对照组钛螺纹钉顶端仍可见透射影像，新生骨密度较低且界限清晰。植入后12周，实验组可见新生骨组织紧密包绕在螺纹钉周围，密度较正常骨密度稍高；对照组龈方透射影像基本消失，新生骨密度较植入8周时增加但仍低于正常骨组织，新生骨界限仍可分辨，见图1。

骨密度结果分析：实验组各时间点钛螺纹钉周围骨组织的灰度值均高于对照组(P < 0.05)，见表1。

2.4 扭矩测试结果实验组各时间点的最大扭矩值均高于对照组(P < 0.05)，见表2。

2.5 组织学观察结果植入后4，8，12周标本组织学观察显示，实验组成骨细胞较为活跃，新生骨与成熟骨出现较早。

实验组：植入后4周，可见成骨细胞活跃，在新生骨小梁周围紧密排列，钛螺纹钉周围区域可见骨吸收陷窝及类骨质分泌，新生骨小梁呈片状分布，可见编织骨形成，视野内见丰富的新生血管。植入后8周，成骨细胞数量减少，骨细胞增多，破骨细胞几乎不可见，大量类骨质矿化为骨基质，骨小梁较4周排列密集、粗大，可见编织骨转变成板状新骨。植入后12周，可见骨细胞较多，排列紧密，骨小梁排列粗大致密，大量板状新骨形成，见图2。

对照组：植入后4周，见大量结缔组织细胞成分，成骨细胞量少，破骨细胞较多，但形成的骨吸收陷窝较少，类骨质分泌少，骨小梁几乎不可见，新生血管极其稀疏。植入后8周，可见成骨细胞较4周增多，破骨细胞减少，类骨质沉积较实验组低，新生骨小梁纤细、稀疏，新生血管较4周增多。植入后12周，骨细胞排列混杂，骨小梁较实验组纤细，骨成熟度较低，仅有少量板状新骨形成，见图2。

参考文献

[1]Brennan-Calanan RM,Genco RJ,Wilding GE,et al. Osteoporosis and oral infection: Independent risk factors for oral bone loss.J Dent Res.2008;87(4):323-327．

[2]Prank K,Nowlan SJ,Harms HM,et al.Time series prediction of plasma hormone concentration. Evidence for differences in predictability of parathyroid hormone secretion between osteoporoctic patients and normal controls.J Clin Invest.1995; 95(6):2910-2919.

[3]Blind E,Raue F,Knappe V,et al.Cyclic AMP formation in rat bone and kidney cells is stimulated equally by parathyroid hormone-related protein (PTHrP) 1-34 and PTH 1-34. Exp Clin Endocrinol.1993;101(3):150-155.

[4]四川美康医药软件研究开发有限公司.药物临床信息参考[M].成都:四川科学技术出版社,2007:1507-1508.

[5]Yu XH,Wang LP,Jiang X,et al.Biomimetic CaP coating incorporated with parathyroid hormone improves the osseointegration of titanium implant.J Mater Sci Mater Med. 2012;23(9):2177-2186.

[6]Brnemark PI,Hansson BO,Adell R,et al. Osseointegrated implants in the treatment of the edentulous jaw．Experience from a 10-year period.Scand J Plast Reconstr Surg Suppl. 1977;16:1-132．

[7]Marquezan M,Osorio A,Sant’ Anna E,et al. Does bone mineral density influence the primary stability of dental implants? A systematic review.Clin Oral Implants Res.2012;23(7):767~774．

[8]中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会.原发性骨质疏松症诊治指南(2011年)[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志, 2011, 4(1):2-17.

[9]Binte AR,Tanaka M,Kohno S,et al.Relationship between porotic changes in alveolar bone and spinal osteoporosis.J Dent Res.2007;86(1):52-57.

[10]Khosla S,Westendorf JJ,Oursler MJ. Building bone to reverse osteoporosis and repair fractures.J Clin Invest. 2008;118(2): 421-428.

[11]梁红.内源性及外源性甲状旁腺激素对小鼠拔牙创骨愈合的影响[D].南京医科大学,2010.

[12]Tang ZL,Zhang WJ,Wang DX,et al.An experimental study addressing the promotion of mandibular defect repair through the intermittent subcutaneous injection of parathyroid hormone.J Oral Maxillofac Surg.2014;72(2):419-430．

[13]Deshpande SS,Gallagher KK,Donneys A,et al.Parathyroid hormone therapy mollifies radiation-induced biomechanical degradation in murine distraction osteogenesis. Plast Reconstr Surg.2013;132(1):91-100.

[14]Reynolds DG,Takahata M,Lerner AL,et al.Teriparatide therapy enhances devitalized femoral allograft osseointegration and biomechanics in a murine model. Bone.2011;48(3):562-570.

[15]Hodsman AB,Bauer DC,Dempster DW,et al.Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocr Rev.2005;26(5):688-703.

[16]Jilka RL,Weinstein RS,Bellido T,et al.Increased bone formation by prevention of osteoblast apoptosis with parathyroid hormone.J Clin Invest.1999;104(4):439-446.

[17]Chen HL,Demiralp B,Schneider A,et al.Parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein exert both pro- and anti-apoptotic effects in mesenchymal cells.J Biol Chem.2002; 277(22):19374-19381.

[18]Dobnig H,Turner RT.Evidence that intermittent treatment with parathyroid hormone increase bone formation in adult rats by activation of bone lining cells. Endocrinology.1995;136(8): 3632-3638.

[19]Gasser JA,Kneissel M,Thomsen JS,et al. PTH and interactions with bisphoshonates.J Musculoskelet Neuronal Interact.2000;1(1):53-56．

[20]Hodsman AB,Steer BM.Early histomorphometric changes in response to parathyroid hormone therapy in osteoporosis: Evidence for de novo bone formation on quiescent cancellous surfaces.Bone.1993;14(3):523-527.

[21]Jilka RL,O'Brien CA,Ali AA,et al.Intermittent PTH stimulates periosteal bone formation by actions on post-mitotic preosteoblasts.Bone.2009;44(2):275-286．

[22]Rickard DJ,Wang FL,Rodriguez-Rojas AM,et al.Intermittent treatment with parathyroid hormone(PTH)as well as a non-peptide small molecule agonist of the PTH1 receptor inhibits adipocyte differentiation in human bone marrow stromal cells. Bone.2006;39(6):1361-1372.

[23]唐雯菁,杜艳萍,洪维,等.甲状旁腺素对骨髓间充质干细胞增殖、分化和旁分泌功能的影响[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志, 2014,7(1):42-47.

[24]Frisch SM.cAMP takes controls.Nat Cell Biol. 2000;2(9): E167-168．

[25]Drake MT,Srinivasan B,Mdder UI,et al.Effects of intermittent parathyroid hormone treatment on osteoprogenitor cells in postmenopausal women.Bone.2011;49(3):349-355．

[26]Neer M,Slovik DM,Daly M,et al.Treatment of postmenopausal osteoporosis with daily parathyroid hormone plus calcitriol. Osteoporos Int.1993;3(1):204-205.

[27]Burr DB,Hirano T,Turner CH,et al.Intermittently administered human parathyroid hormone (1-34) treatment increases intracortical bone turnover and porosity without reducing bone strength in the humerus of ovariectomized cynomolgous monkeys.J Bone Miner Res.2001;16(1):157-165.

[28]Sato M.Westmore M,Ma YL,et al.Teriparatide [PTH(1-34)] strengthens the proximal femur of onariectomized nonhuman primates despite increasing porosity.J Bone Miner Res. 2004; 19(4):623-629.

[29]Datta NS,Abou-Samra AB.PTH and PTHrP signaling in osteoblasts.Cell Signal.2009; 21(8):1245-1254.

[30]卫红艳,朱梅.甲状旁腺素治疗骨质疏松研究进展[J].药品评价, 2013,10(5):40-44.

[31]王晶晶,孟维艳,张喆,等.负载 PTH(1-34) 聚乳酸微球体外促成骨分化作用的研究[J].实用口腔医学杂志,2015,31(3):360-364.

[32]于美娜.负载PTH(1-34)的温水凝胶的制备及细胞学研究[D].吉林大学,2013.

[33]Valderrama P,Jung RE,Thoma DS,et al.Evaluation of parathyroid hormone bound to a synthetic matrix for guided bone regeneration around dental implants: A histomorphometric study in dogs.J Periodontol. 2010;81(5): 737-747．

[34]Yu X,Wei M.Preparation and evaluation of parathyroid hormone incorporated CaP coating via a biomimetic method.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2011;97(2):345-354.

[35]李德超,刘惠萍,李慕勤,等.具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层钛合金种植体的体内骨结合[J].中国组织工程研究, 2016, 20(43):6438-6444.

[36]Weng J,Wang M,Chen J.Plasma-sprayed calcium phosphate particles with high bioactivity and their use in bioactive scaffolds.Biomaterials.2002;23(13):2623-2629.

[37]Milella E,Cosentino F,Licciulli A,et al.Preparation and characterisation of titania/hydroxyapatite composite coatings obtained by sol-gel process. Biomaterials. 2001;22(11): 1425-1431.

[38]邓炜,王贻宁.仿生溶液生长法磷酸钙涂层种植体的研究进展[J].国外医学口腔医学分册,2001,28(2):76-78.

[39]Junker R,Dimakis A,Thoneick M,et al.Effects of implant surface coatings and composition on bone integration: a systematic review.Clin Oral Implants Res. 2009;20(4): 185-206.

[40]Luong LN,McFalls KM,Kohn DH.Gene delivery via DNA incorporation within a biomimetic apatite coating. Biomaterials. 2009;30(36):6996-7004.

[41]Stigter M,Bezemer J,de Groot K,et al.Incorporation of different antibiotics into carbonated hydroxyapatite coatings on titanium implants, release and antibiotic efficacy.J Control Release.2004;99(1):127-137.

[42]Liu Y,Li JP,Hunziker EB,et al.Incorporation of growth factors into medical devices via biomimetic coatings.Philos Trans A Math Phys Eng Sci.2006;364(1838):233-248.

[43]Wang CX,Liu JJ,Xiao Y,et al.Study on preparation and activity of a novel recombinant human parathyroid hormone(1-34) analog with N-terminal Pro-Pro extension. Regul Pept.2007; 141(1-3):35-43.

引言

随着口腔种植及修复技术的迅猛发展，种植修复以其咀嚼效率高、不损伤邻牙、美观舒适的特点，受到了越来越多患者的青睐，成为了21世纪牙列缺损甚至牙列缺失的首选修复方法。然而受到感染、肿瘤等局部因素或骨质疏松等全身因素的影响，常会导致拟种植区骨量不足和骨密度降低，增加种植手术难度^[1]。原位组织工程技术的出现为临床解决骨量不足和骨质疏松的问题提供了新的思路。这种技术通过添加各类生物活性成分诱导局部细胞迁移、增殖和分化，促使新骨形成，比起传统骨增量技术来说创伤更小，效果更佳。其中在种植区局部添加促进骨整合的蛋白类药物是行之有效的方法之一。

甲状旁腺激素(1-34)[recombinant human parathyroid hormone(1-34)，PTH(1-34)]拥有甲状旁腺激素的全部活性成分^[2]，可增加骨密度、骨强度和骨连接，改善骨骼微结构^[3]，成为现今组织工程技术的研究热点。作为临床上惟一得到美国FDA批准用于治疗骨质疏松的促骨合成类代谢药物。临床常用的PTH(1-34)给药方法为皮下注射，但吸收及消除速度都很快^[4]，操作不便；靶向性差并伴全身不良反应。因此，PTH(1-34)局部应用成为目前研究的重点方向。在小鼠胫骨种植模型研究中，有学者发现负载PTH(1-34)的CaP涂层种植体可在早期就显示强大的成骨作用^[5]，但并未将这种涂层应用于口腔环境中。

实验通过简单浸泡方法，在钛螺纹钉上制备负载PTH(1-34)的CaP涂层，即刻种植到兔新鲜拔牙窝内，探讨PTH(1-34)局部应用于颌骨种植模型中对促进种植体周围新骨形成、加速种植体周围骨整合、提高种植体稳定性的作用，为临床提供新思路及实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年5至9月在河北医科大学第三医院动物实验室、实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：普通级健康成年新西兰大白兔9只，雌雄不拘，体质量2.0-2.5 kg，购于河北医科大学动物实验中心，许可证号：1405120。随机抽取6只兔作为实验组，另3只为对照组。

主要药品与试剂：重组人甲状旁腺激素(醋酸特立帕肽SF-34，上海吉尔生化有限公司)；同种骨植入材料(山西奥瑞生物材料有限公司)；10%水合氯醛、蒸馏水(河北医科大学第三医院制剂室提供)；2%盐酸利多卡因注射液(上海朝晖药业有限公司)；9 g/L氯化钠注射液(石药集团第四制药厂)；改良模拟体液(河北医科大学生物化学教研室)；体积分数40%甲醛分析纯溶液、甲酸溶液(石家庄兴冀仪器化玻公司)；苏木精、伊红(石家庄市惠友生物科技有限公司)。

主要实验器械：钛螺纹钉(2.0 mm×10.0 mm，江苏荷普有限公司)；南韩打磨机STRONG 90型；三用恒温水箱SHHW21.420AII、干培两用箱GP-658(天津市泰斯特仪器有限公司)；BOSE electroforce 3220-AT(美国BOSE公司)；Minray口内牙片机、DIGORA Optime牙片数字成像系统(芬兰SOREDEX公司)；显微镜DMil/MClZ0HO(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

PTH(1-34)涂层的制备：①取2.0 mm×10.0mm钛螺纹钉，800#砂纸打磨粗化表面后高温高压消毒备用；②用1%BSA预处理实验容器，纯水冲洗干燥，以防止容器内壁上附着的酶降解PTH(1-34)；③将处理后的钛螺纹钉浸泡于5 mol/L NaOH溶液中，放置于60 ℃恒温箱浸泡24 h。纯水冲洗后室温干燥；④将实验组24颗钛螺纹钉垂直放置到含1.0 mL改良模拟体液和100 mg/L PTH(1-34)的容器中，对照组12颗钛螺纹钉放置到只含1.0 mL改良模拟体液的容器中，42 ℃水浴24 h，纯水冲洗，室温干燥。-20 ℃冰箱保存备用。

动物模型制作：局麻下分3次磨除所有9只兔双侧上下颌切牙牙冠至平龈，每周磨除1次。全麻下拔除兔上下颌4颗切牙后置入骨充填材料，实验组即刻植入含有PTH(1-34)的CaP涂层钛螺纹钉，对照组即刻植入不含PTH(1-34)的CaP涂层钛螺钉，缝合。

取材：植入后第4，8，12周，采用深部麻醉法分别处死实验组实验动物2只、对照组1只，获取双侧上下颌骨标本，去除表面附着组织，将标本浸泡于体积分数10%中性甲醛溶液中，保存于4 ℃冰箱中，备用。

1.5 主要观察指标

大体观察：术后观察实验动物一般情况，伤口是否存在红肿、破溃、溢脓等感染现象。观察标本中钛螺纹钉有无松动脱落、钛螺纹钉与周围骨组织是否存在间隙等情况。

X射线观察及骨密度分析：采用平行投照法拍摄每个标本的X射线片，观察钛螺纹钉周围新生骨面积及与周围骨组织结合情况。每标本于钛螺纹钉第1，5，10螺纹上下1 mm处取6个点测量该处灰度值，并将6点平均值作为该标本钛螺纹钉周围新生骨的平均灰度值。

扭矩测试：将标本置入扭矩测试仪，自动记录运动中的扭矩值，制作扭角-扭矩相关散点图，图中峰值即为钛螺纹钉松动时的最大扭矩值，代表钛螺纹钉与周围骨组织的结合强度。

组织学观察：将各标本固定、脱钙、苏木精-伊红染色后，在光镜下观察种植体周围细胞反应、新生骨生成及钙化程度、纤维组织及新生血管生长情况等。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对X射线灰度值及最大扭矩值进行统计学分析。统计数据符合正态分布，则采用x(_)±s表示。将同一时间点下每组结果进行两独立样本t检验，P < 0.05表示组间差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

3.1 拟种植区骨质骨量的研究现状步入21世纪，中国接受种植治疗的患者越来越多，人们对种植效果的要求也不仅仅局限于种植手术的成功实施，还期望能达到种植体的早期负重与修复，以及更长的使用寿命。种植体的骨整合速率和长期稳定主要依赖于种植体周围骨质骨量^[6]。目前，临床上对“骨质”并没有清晰的定义，Marquezan等^[7]认为在口腔种植学领域，骨密度是“骨质”的重要评判指标，骨密度与种植体初期稳定性之间有着确切的正相关性。因此，如何增加种植区骨量、提升骨密度，提高骨整合速率成为了现今口腔种植领域学者们关注和研究的热点之一。

在临床接受种植修复治疗的患者中，有相当一部分为中老年人，据统计中国女性50岁以上人群骨质疏松症总患病率为20.7%，男性为14.4%，60岁以上人群的患病率明显增高，女性尤为突出^[8]。研究表明系统性骨质疏松会导致颌骨骨量减少和骨组织微结构退化，使种植手术难以实施^[9]。颌骨局部因素如牙槽骨失用性吸收，感染、肿瘤或外伤等颌面部疾病，也会造成拟种植区局部骨条件不佳，加大种植手术的难度。现阶段临床应用的骨增量技术，如各类骨移植材料的应用、引导性骨组织再生技术、骨劈开和骨挤压技术等，可增加种植区骨量，但存在吸收率高、术式复杂、骨重建性能低等缺点。

PTH(1-34)是骨形成和重建过程中的一个重要调节因子，可显著促进新骨形成，增加骨密度。为观察PTH(1-34)涂层这一局部应用的方式能否发挥其生物活性，以提高种植区局部骨质骨量，增强种植体周围骨整合强度，此次实验选用了兔原位即刻种植模型。目前广泛用于种植实验研究的颅骨、胫骨种植模型等异位种植动物模型，无法全面模拟口腔内唾液、细菌等复杂环境，而且这些部位的松质骨、皮质骨比例和改建特性都与牙槽骨有很大差异。实验选用的口腔原位动物模型，充分模拟了人种植窝的形态特性及大体口腔环境，实验结果更具说服力。

相比于犬、猪等实验动物，兔性情温顺、易于饲养、手术操作相对简单。延续课题组之前的方法，通过分次磨除后完整拔除兔的切牙，成功建立了兔即刻种植模型，缩短了实验周期。兔切牙牙根长且弯，此次实验仅在牙槽窝弯曲部位下段填塞人冻干骨，建立与人种植窝相同的长直形态，辅助钛螺纹钉获得初期稳定性。同时，种植体与牙槽窝间隙小于0.85 mm处不填塞骨粉，只让新鲜血液充盈，模拟种植区天然骨缺损，更方便观察实验组与对照组新生骨在骨质和骨量上的差别。大体观察可见实验组骨整合效果极佳，4周时钛螺纹钉周围已有新骨形成，并无纤维长入。X射线检查结果也证实局部应用PTH(1-34)可促进兔原位即刻种植模型中种植体周围新骨形成，并能增加骨密度。

3.2 PTH(1-34)在种植领域的作用大量基础实验及临床调查表明，全身小剂量间歇应用PTH(1-34)对骨代谢有明确的正性作用，可提高骨重建速率，促进矿化板层骨生长，最终达到促进骨形成，增加骨骼强度及质量，改善骨骼微结构的效果^[10]。这一特性引起了口腔种植领域学者的广泛关注。

随后一系列动物实验研究表明，PTH(1-34)全身应用可对颌骨代谢也起到积极作用，可加速拔牙创愈合，促进下颌骨骨缺损的修复^[11-12]。在与其他骨增量技术联合应用时，如牵张成骨、同种异体骨移植等，PTH(1-34)也可发挥促进新骨形成、提高新生骨机械强度的作用^[13-14]。还有研究发现PTH(1-34)能增强种植体周围骨再生，提高骨缺损区种植体-骨结合界面的愈合速度^[15]。

此次实验的X射线片结果显示同一时间点下，添加PTH(1-34)的实验组新生骨骨量和骨密度都较对照组高，实验组种植区早在4周时即可见明显的新骨形成，且随时间延长，新生骨密度逐渐增高；而对照组4周时钛螺纹钉周围则围绕大面积透射影像，至8周时仍可见螺纹钉顶端周围存在骨缺损区。扭矩测试证实PTH(1-34)可增加种植体-骨界面结合强度，与同时期对照组相比，最大扭矩值统计学分析都有显著性差异(P < 0.05)，这种差异在早期就有体现。组织学观察也证实PTH(1-34)可在早期就增加成骨细胞数量，且新生骨钙化度远高于对照组，8周时实验组即可见板状新骨生成，12周实验组骨改建过程基本结束。这些结果都证实了PTH(1-34)促进骨形成，提高新生骨机械强度，加速骨整合的能力。

3.3 PTH(1-34)的作用机制作为一种多肽类物质，PTH(1-34)对骨代谢的正性作用主要通过增加成骨细胞数量和提高成骨细胞活性两方面来实现，得到公认的相关机制包括五个方面。其中抑制成骨细胞凋亡是PTH(1-34)促进成骨的最主要机制^[16]。值得关注的是，PTH(1-34)在成骨细胞融合前有抗细胞凋亡的作用，但会促使融合后的细胞产生凋亡。这可能是由于PTH(1-34)通过清除骨单位内“老化”的成骨细胞，为新生的成骨细胞提供空间，促进骨形成^[17]。

PTH(1-34)的一大特性就是可促使机体在早期迅速大量成骨。这一作用源于PTH(1-34) 作用于静止期的骨衬里细胞，促使其恢复成骨细胞表型^[18]。骨衬里细胞是由成骨细胞完成成骨功能后，由立方体变成扁平状并覆在骨小梁表面形成的，这类细胞的数量极其巨大。PTH(1-34)恢复骨衬里细胞表型的效应可以在8-10 h内完成，因此在没有破骨细胞出现去吸引成骨细胞前，原本静止的骨小梁就能增厚^[19-20]。PTH(1-34)还可通过抑制前成骨细胞的自身增殖，以及抑制骨髓间充质干细胞脂向分化，直接或间接增加成骨细胞数量^[21-22]。此外，PTH(1-34)还能促进骨髓间充质干细胞分泌多种细胞因子，使其具有更强的组织趋化能力、调节周围组织血管和骨发生能力^[23]。

以上4个方面是通过增加成骨细胞数量来实现PTH(1-34)促进骨形成作用的，PTH(1-34)还能刺激成骨细胞产生多种细胞因子，这些细胞因子又通过自分泌或者旁分泌的方式对骨代谢进行调节，间接发挥促成骨作用。目前可肯定的有成纤维细胞生长因子2、胰岛素样生长因子1、血管内皮生长因子等^[24-25]。这些细胞因子能促使成骨细胞成熟和聚集，加速骨基质钙化。

实验组织学4周即可观测到，实验组视野内大量成骨细胞分布，类骨质分泌多；而对照组同时间点则是大量结缔组织细胞成分，成骨细胞数量较低，也证明了PTH(1-34)招募前成骨细胞、迅速恢复骨衬里细胞表型、延缓成骨细胞凋亡的能力。随时间延长，实验组新生骨组织矿化度增高更为明显，可能与PTH(1-34)促进成骨细胞分泌的多种细胞因子有关。同时，4周实验组即可观测到大量毛细血管生成，而对照组8周新生血管仍稀疏，是PTH(1-34)促进血管内皮生长因子分泌的直观例子。

曾经有学者认为PTH(1-34)会通过转移皮质骨来补充松质骨的厚度和密度，使得皮质骨密度下降^[26]。但随研究的加深，人们发现PTH(1-34)的皮质效应是通过骨重塑作用实现的，即早期在皮质骨上制造出孔洞，会被后期大量生成的内皮质骨所抵消，不仅不会降低皮质骨的强度，还能促进皮质骨生成^[27-28]。实验X射线检测也未见种植体周围皮质骨影像降低，甚至可观察到实验组近牙槽嵴顶附近的骨皮质阻射性更大，密度更高。当然，实验并未对皮质骨进行量化检测，仍需进一步实验以明确局部应用PTH(1-34)对皮质骨的影响。

3.4 PTH(1-34)局部应用的研究目前临床上主要将PTH(1-34)应用于治疗骨质疏松症，通过皮下注射的给药方式进行，并且1例患者终生只能接受一次为期24个月的治疗。因此，在口腔种植学领域，这种方法存在依从性差的问题，还可能会出现血钙浓度异常导致的一系列副作用，同时靶器官局部血药浓度不能保证。更需要提起注意的是，甲状旁腺激素造成的骨质变化时一个复杂的过程，PTH(1-34)促进骨合成的作用效果与药物的给药浓度和方式有关^[29]。如果药物浓度过高，PTH(1-34)会通过调节核因子κB受体活化因子配体和骨保护素的比值，导致破骨细胞数量增多、活性增强，促进骨吸收^[30]。这些缺点显著限制了PTH(1-34)在口腔种植领域的应用。因此近年来，国内外学者都在积极的进行PTH(1-34)局部应用方面的研究。相关成果包括使用纳米微球、水凝胶、树枝状聚合物胶束等载体^[31-33]，实现PTH(1-34)的局部释放，并能保持其生物活性。

上述研究虽然都制备出了PTH(1-34)局部释放的剂型，但制备过程和实验操作都相对复杂。为此，我们使用在模拟体液中简单浸泡的方法，制备钛种植体表面PTH(1-34)涂层，希望同时达到PTH(1-34)局部释放和简化操作的双重效果。实验药物浓度的选择参考了Yu等^[34]的研究，他们对比后发现使用浓度为100 mg/L的PTH(1-34)，钛金属片表面负载总量最大(25±10.25) µg；释放量大且速率稳定持久，能达到14 d以上；并在体外细胞实验中观测到明显的成骨细胞聚集、黏附和增殖现象。此次实验结果也显示在带有涂层的种植体植入早期，种植体周围就聚集了大量的成骨细胞，和Yu等的研究结果一致，说明这种涂层可以达到PTH(1-34)局部释放，并能在动物体内也保持生物活性。

3.5 PTH(1-34)涂层载体的选择钛种植体生物化学改性是通过将负载的生物活性分子局部释放，影响周围组织反映，达到促进骨整合的发生，提高种植成功率的目的^[35]。因此，选用合适的载体提高PTH(1-34)与钛螺纹钉的高效结合和稳定释放成为此次实验的关键因素之一。磷酸钙是常用的医用生物陶瓷材料之一，通过离子喷涂、溶胶-凝胶、仿生溶液涂层等多种方式可以将CaP结合到钛金属表面^[36-38]。CaP涂层显现了出色的生物相容性及骨传导性，能增强种植体周围新骨生成、加速早期骨整合，提高种植体初期稳定性^[39]。随种植体植入时间的延长，实验单纯CaP涂层的对照组就可观测到新生骨量增加、种植体-骨界面强度的升高的现象，以及骨整合的实现。

CaP还是多种生物分子的有效载体，能保持其活性并实现稳定释放，如DNA、抗生素和生长因子等^[40-42]。利用这一优势，实验在近似生理温度的环境下，将模拟骨矿物环境的改良模拟体液与一定浓度的PTH(1-34)混合，把碱化处理后的钛螺纹钉浸泡其中，得到负载PTH的CaP涂层。这种方法简单易行，通过共沉积作用实现，由于甲状旁腺激素等电点为8.0，在pH为6.5-7.0的改良模拟体液中带正电荷^[43]，故可被带负电的CaP晶体吸附并包裹，同时保证了PTH(1-34)的高结合率和生理活性。

实验根据大体观察、X射线影像学、生物力学及组织学的检测，证实负载PTH(1-34)的CaP涂层联合了甲状旁腺激素和仿生磷酸钙的双重特性，在原位即刻种植模型的骨整合方面起到正性作用，与对照组相比，实验组新骨形成量大、成熟度高，生物力学强度大。此次实验发现这种方式进行的钛表面改性作用持久，在8周和12周时，实验组还能继续保持上述优势，缩短种植体愈合时间，增强骨整合效率，这可能源于早期PTH(1-34)对骨组织正性作用打下的良好基础。

综上所述，通过共沉积方法制备的负载PTH(1-34)的CaP涂层可加速种植体周围新骨形成，增强种植体-骨界面结合强度，加速骨整合的实现。但由于实验条件和时间的限制，对于PTH(1-34)最适浓度的选择、涂层技术的完善，以及种植体上部负载和远期稳定性的影响还需进行进一步的研究，PTH(1-34)对皮质骨的作用也需进行量化分析，以便为临床提供更多实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程