钛芯与骨形成蛋白复合材料修复即刻种植牙槽骨缺陷的评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.016

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (22): 3536-3540.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.016

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钛芯与骨形成蛋白复合材料修复即刻种植牙槽骨缺陷的评价

杨玉鹏¹，赵海静²，谷建琦¹，程凤峡¹，郑瑶¹，李娟¹，郝玮¹，王西西¹，吴永生¹

河北省人民医院，¹口腔科，²老干部处，河北省石家庄市 050051

收稿日期:2018-01-19 出版日期:2017-08-08 发布日期:2017-09-01
通讯作者: 吴永生，教授，主任医师，硕士生导师，河北省人民医院口腔科，河北省石家庄市 050051
作者简介:杨玉鹏，男，1983年生，河北省石家庄市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事口腔颌面外科研究。
基金资助:
2014年度河北省医学科学研究课题计划(ZL20140216)

Titanium core/bone morphogenetic protein composite materials used to repair alveolar bone defects after immediate implant placement

Yang Yu-peng¹, Zhao Hai-jing², Gu Jian-qi¹, Cheng Feng-xia¹, Zheng Yao¹, Li Juan¹, Hao Wei¹, Wang Xi-xi¹, Wu Yong-sheng¹

¹Department of Stomatology, ²Department of Veteran Cadre, Hebei Provincial People’s Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Received:2018-01-19 Online:2017-08-08 Published:2017-09-01
Contact: Wu Yong-sheng, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Stomatology, Hebei Provincial People’s Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
About author:Yang Yu-peng, Master, Attending physician, Department of Stomatology, Hebei Provincial People’s Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Science Research Plan of Hebei Province in 2014, No. ZL20140216

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

钛芯羟基磷灰石材料：综合了羟基磷灰石与钛金属材料的良好的特性，不仅有一定的机械强度，而且有优越的生物相容性和骨引导牵引作用，缩短骨与生物人工材料结合时间。

骨形成蛋白：作为人体内最重要的骨诱导生长因子，能够诱导骨细胞的一切生理活动，通过一系列的活动诱导未分化细胞进行增殖行动，慢慢分化为软骨母细胞，并进一步成为成熟软骨细胞，最终通过软骨内骨化的过程形成新骨组织。但骨形成蛋白不宜单独植入生物体内，容易发生降解作用，因此通过钛芯羟基磷灰石作为一个载体，进入牙齿窝间隙中，起到促进骨细胞生长作用，又能诱导骨细胞与种植体间相接触联系。

背景：致力于种植牙槽骨缺损修复的实验和临床研究是现代科技发展方向，寻找适合的骨替代材料成为人们研究的热门课题。

目的：研究钛芯羟基磷灰石与骨形成蛋白复合材料修复即刻种植后牙槽骨缺陷的效果。

方法：将24只新西兰兔随机分为3组，正常组不进行任何处理，实验组、对照组制作股骨大转子区骨缺损模型，实验组于骨缺损处植入种植体及钛芯羟基磷灰石与骨形成蛋白复合材料；对照组植入种植体及钛芯羟基磷灰石材料。植入后4周，检测血CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞比例及NK细胞活性、白细胞介素2水平；植入后16周，采用X射线检测骨密度，组织学观察种植体周围成骨情况。

结果与结论：①实验组骨密度高于对照组(P < 0.05)；②实验组复合材料周围有不同程度的裂解，新生骨组织细胞和基质细胞较为丰富，并且在种植体周围有良好的骨结合接触，内部出现有红染成熟骨组织进入；对照组骨细胞数量、纤维细胞增生少于实验组；③实验组CD4⁺与CD8⁺淋巴细胞比例、NK细胞活性、白细胞介素2水平低于对照组(P < 0.05)；④结果表明，钛芯羟基磷灰石与骨形成蛋白复合材料能够有效修复即刻种植后牙槽骨缺陷区域，引导骨细胞生长。

ORCID: 0000-0002-8010-0583(杨玉鹏)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 钛芯, 骨形成蛋白, 复合材料, 即刻种植, 牙槽骨, 兔, 缺陷, 骨密度, 生物相容性, 炎症反应

Abstract:

BACKGROUND: Now experimental and clinical research on suitable bone substitutes for alveolar bone defects after dental implantation is an issue of concern.

OBJECTIVE: To study the therapeutic effect of titanium core/bone morphogenetic protein (BMP) composite material on alveolar bone defects after immediate implant placement.

METHODS: Twenty-four New Zealand rabbits were randomly assigned into normal group (no intervention), experimental group or control group. Animal models of bone femoral greater trochanter defect were made in the experimental and control groups. Dental implant and titanium core/BMP composite material were implanted in the experimental group, while dental implant and titanium core were implanted in the control group. Percentage of CD4⁺, CD8⁺ T lymphocytes, natural killer cell activity and interleukin 2 level were detected at postoperative 4 weeks; bone mineral density and osteogenesis around the implant were detected at postoperative 16 weeks through X-ray and histological examinations.

RESULTS AND CONCLUSION: X-ray results showed that the bone mineral density in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Histological results showed that in the experimental group, different degrees of cell lysis around the composite, more bone cells and bone matrices were found, implant-bone osseointegration formed well, and red-dyed mature bone tissues were detective inside the implant. Compared with the experimental group, lower number of bone cells and fibrocytes were found in the control group. Additionally, the percentage of CD4⁺ and CD8⁺ T lymphocytes, natural killer cell activity and interleukin 2 level in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). To conclude, the titanium core/BMP composite material can effectively repair alveolar bone defects after immediate implant placement to guide the growth of bone cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Morphogenetic Proteins, Hydroxyapatites, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杨玉鹏，赵海静，谷建琦，程凤峡，郑瑶，李娟，郝玮，王西西，吴永生. 钛芯与骨形成蛋白复合材料修复即刻种植牙槽骨缺陷的评价[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(22): 3536-3540.

Yang Yu-peng, Zhao Hai-jing, Gu Jian-qi, Cheng Feng-xia, Zheng Yao, Li Juan, Hao Wei, Wang Xi-xi, Wu Yong-sheng.

Titanium core/bone morphogenetic protein composite materials used to repair alveolar bone defects after immediate implant placement

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(22): 3536-3540.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组动物观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年11月至2016年6月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康雄性新西兰兔24只，体质量2.5-3.6 kg，平均(3.5±0.24) kg，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2003-1-003，均无感染、创伤及全身其他疾病。所有动物按照《实验动物管理条例》和《实验动物许可管理办法》规定进行实验，室温，分笼饲养，自由饮水及摄食，1周适应性饲养后进行实验。将24只兔随机分为正常组、实验组和对照组，每组组8只，正常组不做任何处理；实验组于骨缺损处植入钛芯羟基磷灰石材料和骨形成蛋白复合物，将骨形成蛋白称质量后溶于钛芯固化液中，4 ℃放置24 h，使用前将钛芯固相粉末与骨形成蛋白固化液常温下按比例调和成糊状，填入种植体周围骨缺损区；对照组骨缺损处植入钛芯羟基磷灰石材料。

主要材料、试剂与仪器：骨形成蛋白来源于是利用人成熟肽基因克隆，通过大肠肝菌表达获得，由解放军第四军医大学提供；钛芯羟基磷灰石材料，直径0.4-0.9 mm(四川大学)；医用青霉素(中国医药上海化学试剂公司)；二甲苯(哈药集团制药总厂)；甲醛(石家庄市勃盛化学试剂)；苏木精染液、伊红染液(重庆东方制药厂)；戊巴比妥钠(北京普博斯生物有限公司)；BLB羟基磷灰石涂层种植体(法国 Anthogyr公司)；淋巴细胞分离液(Simga)；CD4⁺、CD8⁺单克隆一抗(Abcam)；FITC标记二抗(康为世纪有限公司)；自然杀伤细胞、白细胞介素2 ELISA试剂盒(南京建成生物有限公司)；流式细胞仪(BD公司)；显微镜(OLYMPUS)；包埋机、石蜡切片机 RM20155(德国leica公司)；低温冷冻冰箱(海尔集团)。

1.4 实验方法麻醉实验组与对照组兔后，切开兔股骨位置皮肤及皮下层，分离肌层，在股骨上端沿股骨长轴显露股骨大转子区，完全剥离开骨膜，通过系列钻制作深 4.0 mm和直径7.3 mm的骨缺损区域，植入种植体 (3.3 mm×8.0 mm)并充分止血后，实验组从骨缺损中心部位植入钛芯羟基磷酸石灰与骨形成蛋白复合材料，再用温热湿纱布促进其固化，覆盖表面15 min；对照组也用同样处理方法，植入单纯的钛芯羟基磷酸石灰材料。分层进行缝合，包扎，术后给予青霉素以预防感染。

1.5 主要观察指标

各组间骨密度和骨组织学情况：植入后4，8，16周，每个时间点每组处死2只兔，取出种植体周围股骨上端至少1.0 cm处，用生理盐水冲洗标本，切割成体积为10 mm× 10 mm×15 mm的组织块，体积分数10%甲醛固定24 h。①X射线骨密度测量：拍片用Digora数字牙片机，骨密度分析用自动分析程序，用小动物实验软件分析所得结果并进行统计学分析；②组织学观察：16周时对骨组织切片进行苏木精-伊红染色。将标本置于脱钙液中，每6 h更换脱钙液，持续3 d左右，大头针能刺透骨质时可取出。脱钙液配置：蒸馏水、甲醛、甲酸体积比为6∶1∶3。脱钙后取出标本，流水不间断冲洗。然后进行梯度脱水，分别在体积分数70%、80%、95%、95%的乙醇溶液中浸泡，每浓度 5 min。最后在无水乙醇中浸泡，10 min×3次。脱水完成后，取出标本于二甲苯Ⅰ﹑Ⅱ中浸泡各7 min进行透明。接着将标本浸蜡，每次约30 min，然后放置于塑料包埋盒中进行包埋冷却。使用石蜡切片机将修整后的包埋蜡块进行切片，厚度选取5 μm，将切好的组织平整放置于载玻片上进行苏木精-伊红染色，用光学显微镜观察种植体周围的成骨情况。

T淋巴细胞检测：植入后4周采血2 mL，分离淋巴细胞。将100 μL 2×10⁹ L^-1的淋巴细胞液置于试管中，分别在试管内均匀加入抗CD4⁺、CD8⁺单克隆抗体及阴性对照一抗各30 μL，在37 ℃保温箱孵育30 min，2 000 r/min离心 10 min，去上清液后用PBS洗涤3次，每次离心5 min，去掉上清液，在细胞中加入FITC标记二抗10 μL，37 ℃保温箱孵育30 min，2 000 r/min离心10min，PBS洗涤3次，每次离心5 min。上流式细胞仪检测CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞比例。

自然杀伤细胞(NK细胞)活性和白细胞介素2水平检测：植入后4周采血1 mL，离心分离得到血清，并按照ELISA说明书操作，在450 nm波长下检测其吸光度，根据计算得到NK细胞与白细胞介素2水平。

1.6 统计学分析采用 SPSS 18.0 统计分析软件对实验所得数据进行统计学处理。数据采用x(_)±s表示，两独立样本比较采用t-test分析，P < 0.05 则表明两组之间比较差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

当今社会，口腔种植已被广泛应用于临床，其中进行人工即刻种植手术的前提要求是种植区应有充足的骨量，以作为植入种植体的一个支持，这样可使牙窝周围骨与种植体之间形成良好的契合，防止即刻种植初期种植体的不稳定，根据临床数据统计，因为种植区没有充足的骨量，有超过50%的患者因即刻种植后产生种植牙

不稳定情况^[12-15]。进行拔牙手术后，牙槽窝的形态和骨量会对种植体的初期稳定性造成影响，如果牙槽骨与种植体间形成超过1 mm的骨缺损时，则需作骨移植考虑^[16-19]。骨的高度与宽度不足容易导致种植区骨量不足或者骨缺损，临床分为以下几类：种植术中种植体穿孔性骨缺损、种植术前局部牙槽骨缺损及种植体唇侧裂开性骨缺损^[20-23]。常用修复骨缺损的方法有以下几种：引导性骨组织再生术、骨挤压术、骨移植术、骨劈开术、牵张成骨术，常用的骨修复材料有自体骨、异体骨、组织工程学材料^[24-26]。在即刻种植中，拔牙创与种植体形态不吻合是常见的情况，不可避免会导致种植体周围骨缺损情况的发生。因此，致力于种植牙槽骨缺损修复的实验和临床研究是现代科技发展方向，寻找适合的骨替代材料成为人们研究的热门课题。用于修复骨缺损的移植物包括自体移植物、异种移植物、同种异体移植物和合成骨替代物，要求有很好的组织相容性、骨引导性、物理稳定性，能够促进血管生成，愈合过程中要求能缓慢吸收并被骨组织再生所替代^[27-28]。

迄今为止，牙槽骨手术中最常用的是金属钛材料种植体，一方面是因其具有良好的机械性，另一方面也是由于其生物相容性和耐腐蚀性。钛芯羟基磷灰石材料综合了羟基磷灰石与钛金属材料的良好特性，不仅有一定的机械强度，而且有优越的生物相容性和骨引导牵引作用，能缩短骨与生物人工材料结合时间^[29-31]。这些性能是不能够满足整个种植及康复的过程，由很多因素来决定种植的成功与否，包括加入到在种植体上的各种生物或物理或化学因素。位于皮质骨的特殊蛋白质-骨形成蛋白，能通过以下步骤起成骨作用的：即骨生成、骨诱导和骨传导。成骨细胞直接分泌骨基质并逐渐矿化成骨的，属于骨生成阶段，这个阶段要求有成骨细胞的支持，自体骨会有这样的能力；诱导未分化的间充质细胞转化为成骨细胞或成软骨细胞，归于骨诱导阶段，并促进骨生长，这种情况可以在无自体骨细胞的区域形成骨细胞^[32-35]。实验结果证实，实验组骨密度增加，组织学检测证实两者结合可促进牙骨细胞增殖，并且增加细胞与种植体之间的融合联系。但其对于机体的免疫反应及生物相容性的基础实验并未清楚，实验还对其免疫系统变化和炎症因子变化进行检测。

组织器官移植免疫反应中，细胞免疫在移植排斥反应中起作用，牙骨种植体及修补材料的进入，也属于移植的一部分，会引起机体产生一定的反应。在细胞免疫中T淋巴细胞分为两大亚类，即辅助T细胞(CD4⁺)起正向调节作用和抑制T细胞(CD8⁺)起负向调节作用，通过检测其数目变化可及时反映生物体内部免疫功能是否出现紊乱或器官移植时是否出现排斥反应^[36-37]。实验结果证实，实验组CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞比例低于对照组(P < 0.05)，证明复合材料免疫原性较单一钛芯材料的低，不容易引起受体细胞免疫，这可能与复合材料里面具有骨形成蛋白材料，可促进自身骨细胞生成，减少细胞免疫排斥的发生有关。NK细胞作为机体重要的免疫细胞，参与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节过程中，在某些情况下参与排斥反应发生^[38]。活化T细胞产生白细胞介素2，可以起到促进淋巴细胞生长、增殖、分化作用，并且对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，促进细胞因子产生，刺激NK细胞增殖，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞进行增殖活动，增加T细胞活性，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞等一系列的免疫活动^[39]。白细胞介素2水平变化与NK细胞活性、T淋巴细胞数量呈现正相关。实验研究结果表明：复合物充分发挥了骨传导作用和骨诱导作用，克服了骨形成蛋白在体内吸收过快，不能单独制成骨的形状的缺点，在临床上有很大实用价值。与对照组相比，实验组具有明显的治疗效果。实验结果证实，在植入第4周时，实验组NK细胞活性和白细胞介素2水平低于对照组(P < 0.05)，降低趋势与T淋巴细胞的结果一致。结果证明，引起自体炎症反应的因子数量得到降低，证明其具有一定生物相容性。钛芯与骨形成蛋白复合材料能够有效修复即刻种植后牙槽骨缺陷区域，钛芯引导骨细胞的生长，骨形成蛋白材料能够促进新生骨细胞与种植体的结合，降低炎性反应的发生，与牙槽骨种植体、骨细胞间有良好的相容性，可作为一种较为理想的新型牙槽骨修复材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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