H-型血管在骨关节炎软骨下骨中的表达及作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (20): 3135-3140.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.004

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H-型血管在骨关节炎软骨下骨中的表达及作用

卢键森^1，2，柳鑫^1，2，曾春^1，2，赵畅²，方航²，蔡道章^1，2

¹南方医科大学，广东省广州市 510515；²南方医科大学第三附属医院，广东省骨科研究院，广东省广州市 510630

修回日期:2017-02-27 出版日期:2017-07-18 发布日期:2017-07-28
通讯作者: 蔡道章，教授，博士生导师，主任医师，南方医科大学，广东省广州市 510515；南方医科大学第三附属医院，广东省骨科研究院，广东省广州市 510630
作者简介:卢键森，男，1990年生，广东省佛山市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事骨关节炎研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81371990)；国家自然科学基金(81601945)；高等学校博士学科点专项科研基金(20124433110021)；广东省医学科研基金(A2015422)

Expression and role of H-type vessels in the subchondral bone in the progression of osteoarthritis

Lu Jian-sen^{1, 2}, Liu Xin^{1, 2}, Zeng Chun^{1, 2}, Zhao Chang², Fang Hang², Cai Dao-zhang^{1, 2}

¹Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; ²the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Orthopedic Institute of Guangdong Province, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Revised:2017-02-27 Online:2017-07-18 Published:2017-07-28
Contact: Cai Dao-zhang, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Orthopedic Institute of Guangdong Province, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Lu Jian-sen, Studying for master’s degree, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Orthopedic Institute of Guangdong Province, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371990 and 81601945; the Doctoral Special Fund of Universities, No. 20124433110021; the Medical Research Foundation of Guangdong Province, No. A2015422

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
H-型血管：是一种特殊的血管亚型，是伴随骨形成的一个重要血管。H-型血管主要分布在干骺端，而且随着年龄增长，这种血管逐渐减少，同时骨量也在减少。在骨质疏松模型的小鼠中，H-型血管也是在减少，证实H-型血管与新生骨有着密切的关系。
基质金属蛋白酶13：为软骨细胞分解代谢的基质金属蛋白酶，不仅能够反映关节软骨细胞Ⅱ型胶原的退化情况，而且还能够反映出关节软骨中蛋白多糖、Ⅳ型胶原、X型胶原、软骨骨素等成分的退化情况[31]。骨关节炎过程中，基质金属蛋白酶13升高可提示软骨细胞肥大、凋亡，软骨外基质退变，骨化形成，故其高表达可反映骨关节炎的严重程度。

摘要
背景：H-型血管主要分布在骨骼干骺端，能促进骨量增多，加速骨的形成。
目的：观察骨关节炎发生发展过程中软骨下骨H-型血管的表达情况。
方法：8周龄健康清洁级C57小鼠随机分为实验组和假手术组。实验组小鼠行右侧膝关节内侧半月板切除诱导骨关节炎(MMx模型)；假手术组小鼠则仅切开关节囊而不行内侧半月板切除。术后4周取膝关节标本进行组织学分析，番红O快绿染色评估软骨损伤程度。免疫荧光检测CD31、Emcn、基质金属蛋白酶13表达情况，苏木精-伊红染色观察软骨下骨改变情况，MicroCT分析软骨下骨骨量的变化。　
结果与结论：①与假手术组比较，实验组OARSI评分、软骨下骨CD31、Emcn共荧光、H-型血管、基质金属蛋白酶13荧光表达及软骨下骨骨量均显著升高(P < 0.05)；②结果说明，骨关节炎过程中，软骨下骨的H-型血管增多，促进软骨下骨增生及重塑。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0001-6159-0460(蔡道章)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨关节炎, 软骨下骨, 血管, H-型血管, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: H-type vessels are mainly distributed in the metaphysis, which can promote the proliferation of osteocytes, further accelerating osteogenesis.
OBJECTIVE: To investigate the expression of H-type vessels in the subchondral bone during the occurrence and development of osteoarthritis.
METHODS: 8-week-old C57 mice were randomly divided into experimental and sham groups, followed by the right medial menisectomy to establish the osteoarthritis models or only articular capsulotomy. The knee samples were removed at 4 weeks postoperatively, and were stained with safranin-O-fast green to evaluate the degree of injury. The expression levels of CD31, Emcn and matrix metalloproteinase 13 were detected by immunofluorescent staining. The changes of the subchondral bone were observed by hematoxylin-eosin staining and the changes of bone mass in the subchondral bone were analyzed by micro-CT.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham group, the Osteoarthritis Research Society International scores, expression levels of CD31, Emcn, H-type vessels and matrix metalloproteinase 13, as well as the bone mass in the subchondral bone were significantly increased in the experimental group (P < 0.05). To conclude, the increased H-type vessels in the subchondral bone promote the hyperplasia and remodeling of subchondral bone in the progression of osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Cartilage, Blood Vessels, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

卢键森，柳鑫，曾春，赵畅，方航，蔡道章. H-型血管在骨关节炎软骨下骨中的表达及作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(20): 3135-3140.

Lu Jian-sen, Liu Xin, Zeng Chun, Zhao Chang, Fang Hang, Cai Dao-zhang. Expression and role of H-type vessels in the subchondral bone in the progression of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3135-3140.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年7月至2016年12月在南方医科大学生命科学楼细胞生物实验室及南方医科大学第三附属医院中心实验室完成。

1.3 材料　

1.3.1 实验动物 健康雄性清洁级C57小鼠20只，8周龄，体质量22-24 g，由广东省医学实验动物中心提供(合格证号：No.44007200021628)。

1.3.2 主要试剂和仪器 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) (美国Sigma公司)、多聚甲醛(广州化学试剂厂)、甘油(广州化学试剂厂)、体积分数75%乙醇(广州化学试剂厂)、二甲苯(广州化学试剂厂)、苏木素粉剂(美国Sigma公司)、DAPI染液(美国Sigma公司)、番红O快绿(美国Sigma公司)。CD31(R＆D，AF3628)、Emcn(Santa Cruz，V.7C7)、基质金属蛋白酶13(MMP13)抗体(Abclonal，A1606)。倒置显微镜(日本Olympus公司)、MicroCT(LCT200)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组　将20只8周龄雄性小鼠分别编号为1-20，利用随机数表法随机抽选出10只为实验组，剩余10只即为假手术组；实验组进行骨关节炎造模，假手术组仅进行关节囊切开。

1.4.2 骨关节炎模型建立 实验组小鼠行右侧膝关节内侧半月板部分切除术(MMx)，术前小鼠自由摄食摄水，用1%戊巴比妥钠(8 μL/g)腹腔麻醉后，剃净右膝关节周围鼠毛并用碘伏消毒。将小鼠固定于解剖显微镜下，在右膝关节部位用眼科剪纵向剪开皮肤，长度1 cm左右。用手术刀沿髌骨内侧纵向切开肌肉，将髌骨向外侧翻并固定，从而暴露出关节解剖结构，首先离断其内侧半月板-胫骨韧带，其次摘除部分内侧半月板。将外翻的髌骨复位，并用眼科针缝合切口。具体方法同之前报道^[12]。假手术组小鼠仅行关节囊切开。手术过程均在实验室无菌手术操作间完成。术后将小鼠至于笼中饲养，自由摄食摄水并自由活动，温度为25 ℃，湿度为50%-70%。

1.4.3 组织取材 实验组和假手术小鼠均在术后4周进行相同处理取材。具体步骤如下：将小鼠断颈处死，取右膝关节并将皮肤及肌肉除净。将处理好的关节置于40 g/L多聚甲醛4 ℃冰箱固定过夜，去离子水冲洗数遍后，再用14%乙二胺四乙酸(EDTA)在摇床上脱钙4周，每天更换一次脱钙液。去除脱钙液，并用去离子水反复清洗5遍，每遍15 min，在机器上进行脱水。脱水完成后，取出标本，置于石蜡包埋机上的液体蜡池中，将膝关节内侧面朝向底面矢状面包埋(尽量保持膝关节平整贴于包埋盒底面)。待包埋后的标本于低温冰台冷却凝固后，置于-20 ℃冰箱冻存，备切片使用。

1.4.4 组织切片及脱蜡水化处理 蜡块修整后切片，先从内侧面开始，切片厚度3-5 μm，并且边切边展片观察，收集关节中央的关节面切片，置于37 ℃恒温箱内过夜干燥。进行脱蜡水化前，将组织切片置于60 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烤片1.0-2.0 h。在二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)和梯度乙醇(体积分数100%，100%，95%，90%，80%，70%，50%)中进行依次脱蜡水化，每次5-8 min。

1.4.5 番红O-快绿染色与OARSI评分 每个样品在镜下挑选含关节面切片，行脱蜡水化。取铁苏木精染色2 min，水洗数分钟，1%盐酸乙醇分化液分化数秒，水洗数分钟，1%固绿水溶液中染色10 s，冰醋酸浸泡数秒，吹干，0.5%番红O染液中染色5 min。镜下观察后，置于37 ℃烘箱风干，二甲苯透明封固。每个样品取3张关节病变比较严重的矢状切面，光镜下观察切片中关节组织结构改变，参照Osteoarthritis Research Society International(OARSI)评分标准进行评分并统计分析(均取胫骨平台中间作评分统计，取平均值)，评分越高，提示关节软骨退变程度越严重，骨关节炎情况越严重。

1.4.6 苏木精-伊红染色 切片脱蜡水化，苏木精染10 min，流水冲洗，去余色。1%盐酸乙醇分化液分化数秒钟，流水冲洗数分钟至核呈蓝紫色。进行梯度乙醇脱水：依次为体积分数80%乙醇1 min，95%乙醇1 min，无水乙醇1 min。伊红染30 s，体积分数95%乙醇(Ⅰ)1 min，95%乙醇(Ⅱ) 1 min，无水乙醇(Ⅰ)5 min，无水乙醇(Ⅱ)5 min。二甲苯透明封固。光镜下观察切片中关节组织结构改变；采用MicroCT分析骨松质密度。

1.4.7 免疫荧光 切片脱蜡水化，置于37 ℃孵箱中蛋白酶K修复8 min，PBS洗5 min×3次，室温下滴加3%内源性过氧化物酶阻断剂避光孵育10 min，PBS洗5 min×3次，山羊血清室温封闭1 h，4 ℃条件下滴加CD31(1∶200)、Emcn(1∶50)、基质金属蛋白酶13(1∶100)抗工作液孵育过夜，PBS洗5 min×5次，室温下避光滴加兔抗羊(594)(1∶100)、兔抗大鼠(488)(1∶100)、驴抗兔(488)(1∶100)二抗后孵育1 h，避光下PBS洗5 min×5次，滴加DAP染核指甲油封固。荧光显微镜下观察切片中关节组织相关指标(CD31、Emcn、H-型血管、基质金属蛋白酶13)的表达情况。

1.5 主要观察指标 ①骨关节炎OARSI评分；②膝关节CD31、Emcn、H-型血管、基质金属蛋白酶13的表达水平；③软骨下骨骨小梁形态及骨量变化。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示。采用excel2007整理汇总资料，Photoshop软件处理图片，Graph Pad软件做图像曲线分析，SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。对两组数据进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

近20年来，骨关节炎的研究多数关注软骨退变，如软骨细胞损伤^[13-14]、软骨细胞自噬等^[15-16]。然而，人与动物模型的骨关节炎发生与进展过程都伴随有显著的血管增生与长入^[17]，但目前对血管增生在骨关节炎中作用的研究较少。而且，血管种类很多，调控机制不清楚。

正常情况下，关节软骨是一个无血管结构，软骨下骨血管也不多。在关节中，调节血管的生产因子分两类：抑制血管生成因子，如软骨调节素和血小板反应蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)等^[18]，抑制血管形成；促进血管生成因子，如血管内皮生长因子、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和肝细胞生长因子等^[19]，促进血管形成。正常情况下，抑血管调节因子和促血管调节因子保持平衡，最终以抑制血管生成为主。近期研究表明，骨关节炎发生发展中，关节软骨的血管内皮生长因子表达增多^[20-21]、软骨调节素1表达减少^[22]，导致抑血管调节因素下调，而促血管调节因素上调，最终血管增生、长入。软骨调节素1表达减少时，通过促进缺氧诱导因子2α核转位，增加缺氧诱导因子2α表达^[23]，促血管形成。血管的长入主要分布在骨软骨交界处及新生骨赘处^[24]，提示其与骨形成有一定的联系。该血管通道形成，促使非钙化软骨层与钙化软骨层进行代谢产物交换，影响透明软骨层代谢平衡。骨关节炎发病过程中，血管的长入能影响软骨细胞增殖、凋亡，加速细胞外基质矿化^[25]，促进骨赘形成，并加快软骨下骨增生、重塑，进一步加剧关节软骨退变、改变机械负荷，加重骨关节炎的发生发展。同时，血管形成能调节神经相关因子和诱导神经长入，最终引起骨关节炎患者的关节疼痛^[26]。而且，血管形成能促进巨噬细胞浸润，诱导产生各种炎症因子，可能影响细胞自我修复^[27]。但是，具体影响骨关节炎的血管种类仍未分类，研究尚浅。

最近研究表明，H-型血管是一种特殊的血管亚型，是伴随骨形成的一种重要血管。H-型血管主要分布在干骺端，而且随着年龄增长，这种血管逐渐减少，同时伴随着骨量也在减少^[28]。在骨质疏松模型的小鼠中，H-型血管也是在减少，证实H-型血管与新生骨有着密切的关系^[29]。H-型血管形成的过程中，Notch通路调控相关的血液流动因子，促进骨组织中H-型血管血液流动，促进骨组织形成，导致骨量增加^[30]。但是，既往研究都关注干骺端、骨干以及骨皮质的H-型血管变化，很少观察到软骨下骨的H-型血管变化。骨关节炎过程中，软骨下骨血管长入，但是对H-型血管与骨关节炎的关系也是研究甚少。

本实验在骨关节炎小鼠(术后4周)上观察到，软骨下骨的H-型血管较假手术组明显增多。同时，采用番红O快绿、苏木精-伊红染色，观察软骨退变及软骨下骨结构的变化。组织形态学上，作者观察到骨关节炎小鼠的关节软骨退变明显，甚至出现软骨剥脱，并且软骨下骨重塑，骨小梁紊乱，骨量增加。免疫荧光上，作者观察到骨关节炎小鼠软骨下骨的血小板-内皮细胞黏附分子CD31增多，提示骨关节炎过程中软骨下骨的血管确实增多。而且，骨关节炎小鼠的内皮黏蛋白Emcn增多，与CD31共荧光标记为H-型血管，提示骨关节炎小鼠软骨下骨H-型血管增多。而且，骨关节炎小鼠的基质金属蛋白酶13免疫荧光表达升高。

基质金属蛋白酶13为软骨细胞分解代谢的基质金属蛋白酶，不仅能够反映关节软骨细胞Ⅱ型胶原的退化情况，而且还能够反映出关节软骨中蛋白多糖、Ⅳ型胶原、X型胶原、软骨骨素等成分的退化情况，是骨关节炎过程的一个重要观察指标^[31]。骨关节炎过程中，基质金属蛋白酶13升高可提示软骨细胞肥大、凋亡，软骨外基质退变，骨化形成，故其高表达可反映骨关节炎的比较严重。上述实验提示软骨下骨H-型血管生成有可能是骨关节炎早期的重要特点，其H-型血管数量可反映软骨下骨增生及重塑的严重程度。

越来越多的研究证实，软骨下骨与软骨是一个统一的运动单元，互为整体，共同承载着生物损伤负荷^[32]。而且，软骨下骨紧贴于软骨下，为软骨提供机械支持和缓冲应力^[33-34]。软骨下骨增生及重塑过程中，骨量明显增多，改变骨内微环境，从而改变机械负荷加重骨关节炎^[35]。Cui等^[36]在骨关节炎小鼠中观察到软骨下骨骨岛周围H-型血管密集。软骨下骨H-型血管的发现为软骨下骨增生及重塑提供有力依据。但是，本实验依然存在不足之处：①没有从体外实验探讨H-型血管的调控机制；②没有从多个时间段探讨H-型血管的变化。

综上所述，本实验通过番红O快绿染色和CD31、Emcn荧光染色从组织形态学上观察到H-型血管生成可能是软骨下骨增生及重塑的重要因素。以上结果可初步证实了骨关节炎发病进程中存在软骨下骨的H-型血管生成现象，而且该血管加速软骨下骨增生及重塑，为骨关节炎的诊治提供新策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

H-型血管在骨关节炎软骨下骨中的表达及作用

Expression and role of H-type vessels in the subchondral bone in the progression of osteoarthritis

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