晚期糖基化终末产物可通过调节V-ATPase a3与ClC-7影响破骨细胞的泌酸功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (12): 1826-1832.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.004

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晚期糖基化终末产物可通过调节V-ATPase a3与ClC-7影响破骨细胞的泌酸功能

王海兴1，李子卿1，肖胤勃1，张紫机1，张阳春1，杨兴1，李朝红2，盛璞义1

1中山大学附属第一医院关节外科，广东省广州市 510080；2中山大学中山医学院组织胚胎学教研室，广东省广州市 510080

收稿日期:2017-03-08 出版日期:2017-04-28 发布日期:2017-05-16
通讯作者: 盛璞义，主任医师，中山大学附属第一医院关节外科，广东省广州市 510080
作者简介:王海兴，男，1991年生，河南省新乡市人，汉族，中山大学附属第一医院在读硕士，主要从事骨质疏松及关节假体松动发生机制方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81672149)，资助单位：中山大学附属第一医院；广东省自然科学基金-重点(2015A030311004)，资助单位：中山大学附属第一医院。

Advanced glycation end products modulate osteoclastic acidification by inhibiting the expression of V-ATPase a3 and ClC-7

Wang Hai-xing1, Li Zi-qing1, Xiao Yin-bo1, Zhang Zi-ji1, Zhang Yang-chun1, Yang Xing1, Li Chao-hong2, Sheng Pu-yi1

1Department of Joint Surgery, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; 2Department of Histology and Embryology, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2017-03-08 Online:2017-04-28 Published:2017-05-16
Contact: Sheng Pu-yi, Chief physician, Department of Joint Surgery, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Wang Hai-xing, Studying for master’s degree, Department of Joint Surgery, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81672149; the Key Project of Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2015A030311004

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
晚期糖基化终末产物：晚期糖基化终末产物是在非酶促条件下，蛋白质、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的终末产物。随着人体的衰老，晚期糖基化终末产物会在组织中累积，对正常的生理活动造成影响。
破骨细胞泌酸：破骨细胞对骨吸收坑的酸化是骨吸收进行的重要条件。当成熟的破骨细胞黏附在骨表面后，其通过细胞褶皱缘上的质子泵V-ATPase和氯离子通道ClC-7向骨吸收坑内分泌H+和Cl-，在细胞与骨表面之间形成酸性的骨吸收微环境，这种酸性微环境对于骨矿物质的溶解及有机骨基质的降解非常重要。

摘要
背景：晚期糖基化终末产物对破骨细胞骨吸收功能的影响存在争议，作者的前期研究表明晚期糖基化终末产物作用于破骨细胞前体可显著抑制骨吸收功能，但关于其对破骨细胞泌酸功能的影响尚不明晰。
目的：探究晚期糖基化终末产物对破骨细胞泌酸功能的影响及其机制。
方法：以15 μg/L的RANKL对破骨细胞前体RAW 264.7进行定向诱导(正常组)，实验组中另加入50-400 mg/L不等的晚期糖基化终末产物及对照用牛血清白蛋白(100 mg/L)。通过骨吸收实验验证晚期糖基化终末产物对骨吸收的抑制效应，并以吖啶橙染色观察晚期糖基化终末产物对破骨细胞泌酸功能的影响；进一步检测质子泵V-ATPase a3及氯离子通道ClC-7的表达情况，分析晚期糖基化终末产物影响破骨细胞泌酸的相关机制。
结果与结论：①晚期糖基化终末产物组的骨吸收面积较正常组显著减少(P < 0.05)；②吖啶橙染色显示晚期糖基化终末产物组的红色荧光(620 nm)强度较正常组显著减少(P < 0.05)，抑制程度随着刺激浓度的增高而加重；③免疫细胞化学染色、蛋白质免疫印迹及PCR发现，晚期糖基化终末产物组的V-ATPase a3及ClC-7表达量均较正常组显著下降(P < 0.05)；④综上结果表明，晚期糖基化终末产物作用于破骨细胞前体可显著抑制破骨细胞的泌酸功能，其机制可能与晚期糖基化终末产物抑制了质子泵V-ATPase a3及氯离子通道ClC-7的表达相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-8555-4827(王海兴)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 糖基化终末产物, 破骨细胞, 骨吸收功能, 空泡型质子泵V-ATPase, 氯离子通道ClC-7, 吖啶橙染色, 破骨细胞泌酸, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The effect of advanced glycation end products (AGEs) on bone resorption is controversial. Our previous study has shown that bone resorption is significantly inhibited when AGEs present with pre-osteoclast cells RAW 264.7, while the effect of AGEs on osteoclastic acidification remains unknown.
OBJECTIVE: To investigate the effect of AGEs on osteoclastic acidification and the underlying mechanism.
METHODS: RAW 264.7 cells were induced by RANKL (15 μg/L; normal group) to generate osteoclasts, and AGEs (50-400 mg/L; experimental group) or bovine serum albumin (100 mg/L; control group) were added at the beginning of the induction. The effect of AGEs on bone resorption was evaluated by analyzing the area of bone resorption on the Osteo Assay Surface plates, and the effect of AGEs on osteoclastic acidification was evaluated by acridine orange staining. Furthermore, the expression levels of V-ATPase a3 and ClC-7 were detected to investigate the underlying mechanism.
RESULTS AND CONCLUSION: The bone resorption area in the AGEs group was significantly decreased compared with the normal group (P < 0.05). Acridine orange staining revealed that the red fluorescence (620 nm) intensity in the AGEs group was significantly decreased compared with the normal group (P < 0.05), and this inhibitory effect became obvious with the increase of AGEs concentration. Immunocytochemistry, western blot assay and PCR findings showed that the expression levels of V-ATPase a3 and ClC-7 in the AGEs group were decreased significantly compared with the normal group (P < 0.05). To conclude, AGEs exert inhibitory effect on osteoclastic acidification, probably by inhibiting the expression of V-ATPase a3 and ClC-7.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Glycosylation End Products, Advanced, Osteoclasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王海兴，李子卿，肖胤勃，张紫机，张阳春，杨兴，李朝红，盛璞义. 晚期糖基化终末产物可通过调节V-ATPase a3与ClC-7影响破骨细胞的泌酸功能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(12): 1826-1832.

Wang Hai-xing1, Li Zi-qing1, Xiao Yin-bo1, Zhang Zi-ji1, Zhang Yang-chun1, Yang Xing1, Li Chao-hong2, Sheng Pu-yi1. Advanced glycation end products modulate osteoclastic acidification by inhibiting the expression of V-ATPase a3 and ClC-7[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(12): 1826-1832.

图/表（结果） 2

2.1 晚期糖基化终末产物对破骨细胞骨吸收的影响破骨细胞诱导第5天，正常组的骨基质被大量溶解吸收，而晚期糖基化终末产物组的骨吸收总面积随着刺激浓度的增加呈减少趋势，且在浓度超过100 mg/L后趋势显著(P < 0.05)；牛血清白蛋白组的骨吸收总面积相较正常组未见减少(图1)。此结果提示，晚期糖基化终末产物作用于破骨细胞前体可显著抑制骨吸收功能。
2.2 晚期糖基化终末产物对破骨细胞泌酸功能的影响晚期糖基化终末产物对破骨细胞泌酸功能的影响通过吖啶橙染色加以探究。吖啶橙是一种荧光色素染料，该染料的发射荧光波长与其浓度相关，在低浓度时发出绿色荧光 (图2A)，而在高浓度(高于100 nmol/L)时转换为橙红色荧光[21]。吖啶橙可透过细胞膜，但在酸性环境中被质子化后会丧失膜通透性，因此吖啶橙会在活细胞的酸性囊泡中高浓度聚积而发出橙红色荧光(图2B)。
在本研究中，吖啶橙染色显示正常组的破骨细胞胞质及细胞边缘出现大量发出橙红色荧光的酸性囊泡，提示破骨细胞泌酸功能良好。随着晚期糖基化终末产物浓度的增高，破骨细胞的橙红色荧光强度逐渐减弱而绿色荧光强度逐渐增强，牛血清白蛋白组与正常组相比差异无显著性意义(图3A)。利用多功能酶标仪对各组的红色荧光强度 (620 nm发射波长)进行定量检测发现，当晚期糖基化终末产物浓度高于100 mg/L时，破骨细胞的红色荧光强度相较正常组显著下降(P < 0.05)，而牛血清白蛋白组相较正常组差异无显著性意义(图3B)。此结果表明晚期糖基化终末产物可干扰破骨细胞转运囊泡的正常酸化，减弱其胞外泌酸功能，进而影响破骨细胞的骨基质溶解吸收能力。
2.3 晚期糖基化终末产物对破骨细胞V-ATPase a3及ClC-7表达水平的影响
2.3.1 晚期糖基化终末产物抑制V-ATPase a3的表达免疫细胞化学染色的结果显示，晚期糖基化终末产物组的V-ATPase a3表达量较正常组有所下降，在浓度超过 100 mg/L后抑制效应显著(P < 0.05)，牛血清白蛋白组相较正常组差异无显著性意义(图4A，B)；实时定量PCR的结果显示，100 mg/L的晚期糖基化终末产物刺激破骨细胞前体24，48及72 h后V-ATPase a3的mRNA表达量均较正常组显著下降(P < 0.05)(图4C)。
2.3.2 晚期糖基化终末产物抑制ClC-7的表达 Western Blot结果显示，晚期糖基化终末产物组的氯离子通道ClC-7表达量随着刺激浓度的增高逐渐下降，在浓度超过100 mg/L时差异有显著性意义(P < 0.05)，牛血清白蛋白组的ClC-7表达与正常组相比差异无显著性意义(图5A，B)；实时定量PCR结果提示，100 mg/L的晚期糖基化终末产物刺激破骨细胞前体24，48及72 h后的mRNA表达量较正常组有所下降，在 48 h和72 h时差异有显著性意义(P < 0.05，图5C)。

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引言

晚期糖基化终末产物是体内多种物质的氨基基团与还原糖的醛基之间发生非酶性糖基化反应所形成的一系列具有高度活性终产物的总称^[1-5]，其在体内分布广泛，主要影响长寿命蛋白质^[6-7]。随着人类年龄的增长，晚期糖基化终末产物会在组织中不可避免地生成和积聚，引起组织细胞蛋白质结构异常和功能障碍，成为多种衰老相关性疾病的致病因素^[7-10]。其中，沉积在骨组织的晚期糖基化终末产物可直接作用于成骨细胞、破骨细胞及骨髓间充质干细胞等细胞群，引起骨形成及骨吸收的紊乱，导致骨质疏松^{[7, 9]}。

晚期糖基化终末产物对骨吸收的影响目前存在很大争议^[11-14]。既往研究多认为晚期糖基化终末产物可促进破骨细胞的骨吸收功能^[11-12]，但以Valcourt等^[13-14]为代表的研究则提出了相反结论。作者的前期研究发现晚期糖基化终末产物作用于破骨细胞前体RAW 264.7可显著抑制破骨细胞的骨吸收功能^[14]，支持了Valcourt的相关结论。作者的前期研究提示晚期糖基化终末产物可显著抑制破骨细胞前体的分化，并可通过抑制组织蛋白酶K及整合素ανβ3的表达抑制破骨细胞的骨胶原降解及黏附迁移能力，表明晚期糖基化终末产物可同时通过减少成熟破骨细胞的个数及其功能而抑制骨吸收活动。

破骨细胞的骨吸收活动是一个多阶段的复杂过程^[15-18]，包括破骨细胞的分化形成、在骨表面的黏附迁移、质子泵V-ATPase及氯离子通道ClC-7参与的胞外泌酸和组织蛋白酶K等主导的骨胶原降解。其中，胞外泌酸是破骨细胞进行骨吸收的重要条件^[18-19]。V-ATPase及ClC-7存在于破骨细胞的基底褶皱缘上，可将H⁺及Cl^-转运到骨吸收坑密闭区，溶解无机矿物质，并为组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶等降解酶提供酸性环境，参与骨吸收。

破骨细胞的泌酸功能是治疗骨吸收相关疾病的潜在靶点。目前国内外尚无文献探究晚期糖基化终末产物对破骨细胞泌酸功能的影响，文章拟通过体外破骨细胞诱导体系及吖啶橙染色观察晚期糖基化终末产物对破骨细胞泌酸功能的影响，并探讨可能的调控机制，为相关的理论研究提供参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学，对比观察实验。

1.2 时间及地点于2016年1月至2017年2月在中山大学中山医学院基础实验室完成。

1.3 材料 RAW 264.7(小鼠单核/巨噬细胞系，ATCC®)；牛血清白蛋白(无脂级，片段V；Roche公司)；反转录试剂盒(Roche公司)；D-核糖(Sigma-Aldrich公司)；胎牛血清、DMEM培养基、α-MEM培养基(Gibco公司)；重组小鼠RANKL(R＆D system公司)；抗V-ATPase a3抗体、抗ClC-7抗体(Santa Cruz公司)；抗ß-actin抗体(CST公司)；RNAsimple 总RNA试剂盒(天根生化科技公司)；24孔骨吸收板(Corning公司)；KAPA SYBR 快速定量PCR 混合物(KAPA 生物系统公司)；ZEISS AXIO OBSERVER Z1荧光显微镜(ZEISS公司)；ImageQuant LAS 4000 mini 检测系统，增强型化学发光液(GE Healthcare公司)；荧光定量PCR仪器(CFX96)(Bio-Rad 公司)；SpectraMax M5 多功能酶标仪(Molecular Devices公司)。

1.4 方法

1.4.1 晚期糖基化终末产物的制备将D-核糖 (600 mmol/L)与牛血清白蛋白(50 g/L)于PBS(pH 7.4)中混匀，过滤除菌后于37 ℃恒温避光孵育2周。孵育后装入透析袋于PBS中透析72 h，去除未反应的游离核糖。非糖基化对照用牛血清白蛋白不加入核糖，余制备条件相同。

1.4.2 破骨细胞的诱导破骨细胞的诱导方法与作者的前期研究相同^[14]。将RAW 264.7细胞以1×10⁴/孔的浓度接种在24孔板中或以1×10⁵/皿浓度接种于35 mm培养皿中，培养基为含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基。在细胞贴壁24 h后，向培养基中加入终浓度为15 μg/L的RANKL。正常组只予RANKL诱导，实验组中另加入50-400 mg/L不等的晚期糖基化终末产物及对照用牛血清白蛋白(100 mg/L)。培养基及晚期糖基化终末产物(或牛血清白蛋白)每日更换，诱导周期为5 d。

1.4.3 骨吸收实验骨吸收实验的方法参照作者的前期研究^[14]。RAW 264.7细胞以1×10⁴/孔的浓度接种在24孔骨吸收板(含羟磷灰石涂层)中。破骨细胞诱导结束后，弃掉骨吸收板中培养基，加入10%的漂白液作用5 min以去除残余细胞。去离子水漂洗2次后，将板置于室温空气中干燥。使用单镜头反光式取景照相机拍摄骨吸收板的骨吸收情况，通过Photoshop软件对图像进行反相处理，并通过Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics公司)对骨溶解坑面积进行分析。

1.4.4 吖啶橙染色破骨细胞吖啶橙染色参照Ying等^[20]的方法。在破骨细胞诱导的第5天，弃掉培养板中各组的培养基，加入以α-MEM培养基配置的终浓度为10 mg/L的吖啶橙染色工作液，于37 ℃孵育15 min。用不含吖啶橙的α-MEM培养基清洗培养板各组2次，即刻于ZEISS AXIO OBSERVER Z1荧光显微镜下观察各组破骨细胞的染色情况。同时通过SpectraMax M5多功能酶标仪检测各组的红色荧光强度(激发波长：485 nm，发射波长620 nm)。

1.4.5 免疫细胞化学染色破骨细胞诱导结束后，弃掉培养基，磷酸盐缓冲液清洗各组细胞后以体积分数100%的甲醇(-20 ℃)固定细胞10 min。用含0.25%曲拉通X-100的磷酸盐缓冲液孵育细胞10 min，并以含体积分数10%驴血清的封闭液孵育细胞30 min。随后各组细胞加入抗V-ATPase a3抗体4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液清洗后以红色荧光素标记的二抗于37 ℃孵育2 h，再次清洗后以DAPI复染细胞核。于荧光显微镜(ZEISS AXIO OBSERVER Z1)下观察各组细胞并拍摄图像，使用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics公司)对各组荧光强度进行分析。

1.4.6 Western blot分析细胞诱导结束时以含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。将裂解液在4 ℃下离心 (12 000×g)20 min，转移上清液并测定蛋白质浓度。100 ℃变性蛋白5 min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，后转移至硝酸纤维素膜上。使用抗ClC-7抗体和抗ß-actin抗体进行免疫印迹分析。于ImageQuant LAS 4000 mini检测系统通过增强型化学发光液显影蛋白条带。使用Image J软件对各条带灰度值进行分析。

1.4.7 实时定量PCR 以100 mg/L的晚期糖基化终末产物刺激诱导中的破骨细胞前体24，48和72 h，随后通过RNAsimple总RNA试剂盒提取细胞总RNA。通过反转录试剂盒将0.5 μg的总RNA合成cDNA。使用KAPA SYBR快速定量PCR混合物制备PCR反应体系(20 μL)，于荧光定量PCR仪器上进行聚合酶链式反应。以GAPDH为内参，使用2^-^??Ct法计算V-ATPase a3和ClC-7的相应表达水平。实验所用引物由上海生工生物公司合成。PCR引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①晚期糖基化终末产物作用下破骨细胞骨吸收面积的变化；②晚期糖基化终末产物对破骨细胞泌酸功能的影响；③晚期糖基化终末产物作用下破骨细胞质子泵V-ATPase a3和ClC-7的表达水平。

1.6 统计学分析全部实验均重复3次，数据应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。连续变量采用单因素方差分析，配对样本间比较采用Student t 检验，多样本组间比较采用Fisher最小差异法。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

非酶糖基化衰老理论是目前被众多学者公认的衰老理论之一^[8]。晚期糖基化终末产物作为非酶糖基化反应所形成的复杂终产物，可伴随年龄的增长在组织中不可避免的生成和积聚^[22]。近年来晚期糖基化终末产物对骨代谢的影响受到重视，研究表明晚期糖基化终末产物可与其受体结合，引起氧化应激及炎症反应^[23-24]，继而导致成骨细胞、破骨细胞及骨髓间充质干细胞的功能改变，最终导致骨代谢的紊乱及骨质疏松的发生^{[7, 9-10]}。

晚期糖基化终末产物对破骨细胞的作用在学术上存在争议^[12-13^，^22]。国内既往文献大多表明晚期糖基化终末产物可促进骨吸收^[11^，^25-26]，而作者的前期研究提出了相反结论^[14]，提示晚期糖基化终末产物作用于破骨细胞前体可显著抑制骨吸收。作者以RANKL对破骨细胞前体RAW 264.7进行定向诱导，在诱导同时加入50-400 mg/L的晚期糖基化终末产物，发现实验组的吸收坑面积和组织蛋白酶K表达量较正常组显著减少，抗酒石酸酸性磷酸酶染色亦显示分化形成的破骨细胞数量随晚期糖基化终末产物浓度的增高而显著下降。进一步的检测发现，晚期糖基化终末产物可显著抑制整合素ανβ3的表达，提示破骨细胞的黏附和迁移能力受到抑制。

骨吸收的强弱与破骨细胞的数量及功能状态密切相关。破骨细胞分化成熟后，借助其伪足小体黏附在骨表面形成一个密封区域，随即通过细胞褶皱缘上的质子泵和氯离子通道向密封区内分泌H⁺及Cl^-，使局部形成pH约为4.5的酸性微环境^{[18, 27-28]}。破骨细胞正常的泌酸是无机骨基质溶解吸收的必要条件^{[27, 29]}，同时也为组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶等降解酶发挥作用提供了最合适的酸性环境^[27]。目前国内外尚无文献报道晚期糖基化终末产物对于破骨细胞泌酸功能的影响，因此作者在本研究中对这一问题及其机制进行了探究。

作者首先重复了骨吸收实验，结果与前期研究一致，晚期糖基化终末产物对骨吸收的抑制程度随着刺激浓度的增加而逐渐加重。在此基础上，作者进行了吖啶橙染色实验，结果表明晚期糖基化终末产物可干扰破骨细胞内转运囊泡的正常酸化，提示晚期糖基化终末产物可减弱破骨细胞的泌酸功能，并最终抑制破骨细胞对骨基质的溶解吸收。

破骨细胞泌酸的直接执行者是位于其细胞褶皱缘上的空泡型质子泵V-ATPase和氯离子通道ClC-7^{[18, 27]}。质子泵是一种水解ATP产生能量、推动H⁺逆浓度梯度跨膜转运的大分子复合体(简称H⁺-ATPase)。根据所在质膜的不同分为细胞膜型(P-ATPase)、线粒体型(F-ATPase)和空泡型(V-ATPase)^[30]。位于破骨细胞内负责泌酸的质子泵为空泡型V-ATPase，由位于胞质内的催化ATP水解的V1结构域和位于跨膜区内的负责H⁺转运的V0结构域两部分组成^[18^，^31-32]。V0结构域中的a3亚基是负责H⁺转运的关键亚基^{[18, 30]}，研究表明小鼠a3亚基突变后会引起破骨细胞泌酸功能的严重受损并导致小鼠患骨硬化症，提示V-ATPase a3在破骨细胞泌酸中发挥重要作用。在本研究中，作者利用免疫细胞化学染色及实时定量PCR对晚期糖基化终末产物作用下的破骨细胞V-ATPase a3的表达情况进行了探究，结果表明晚期糖基化终末产物作用于破骨细胞前体可明显抑制V-ATPase a3的表达，提示晚期糖基化终末产物可能通过抑制V-ATPase a3影响破骨细胞的泌酸功能。

氯离子通道ClC-7在维持骨吸收的酸性微环境中亦发挥重要作用^[27]。研究提示，人和小鼠的ClC-7基因的异常缺失会引起破骨细胞骨吸收功能的下降，导致骨硬化症的发生。作者通过Western Blot和定量PCR探究了晚期糖基化终末产物对破骨细胞ClC-7表达的影响，结果显示晚期糖基化终末产物可显著抑制ClC-7的表达。据此推测，晚期糖基化终末产物对破骨细胞泌酸系统的抑制可能是全方位的，可同时抑制V-ATPase a3和ClC-7的表达从而使破骨细胞的泌酸功能受损，骨吸收功能受到抑制。

本研究中晚期糖基化终末产物的刺激时间为诱导全程的长时间刺激，尚未涉及对成熟破骨细胞短时间刺激的影响探究。有学者认为晚期糖基化终末产物对破骨细胞作用的矛盾效应可能源于不同的研究体系和实验技术，例如在Miyata等^[12]的研究中，使用了含有破骨细胞的小鼠骨髓细胞群进行了相关实验，在骨髓细胞群中既有破骨细胞前体，又有处于不同分化阶段的破骨细胞；而Valcourt等^[13]的研究使用了纯种细胞株作为破骨细胞诱导的前体，并于诱导的起始就给予了晚期糖基化终末产物的刺激。因此，前期研究中使用了不同种类的细胞，并且晚期糖基化终末产物刺激破骨细胞时其所处的分化阶段亦有差异，这些可能是造成相关研究出现矛盾的原因。本研究采取了与Valcourt相近的研究体系，并未对晚期糖基化终末产物对成熟破骨细胞的单纯作用做出探究。关于晚期糖基化终末产物在破骨细胞不同分化阶段的影响是否存在差异，尚需进一步的实验加以验证。综上所述，本实验表明，晚期糖基化终末产物作用于破骨细胞前体可显著抑制破骨细胞的泌酸功能，导致破骨细胞骨吸收功能的下降。此效应可能主要源自晚期糖基化终末产物对破骨细胞空泡型质子泵V-ATPase a3和氯离子通道ClC-7表达的抑制。V-ATPase a3与ClC-7作为调控破骨细胞骨吸收功能的重要分子，是骨吸收相关疾病的潜在治疗靶点，关于晚期糖基化终末产物调控V-ATPase a3和ClC-7的具体分子机制还需要进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

晚期糖基化终末产物可通过调节V-ATPase a3与ClC-7影响破骨细胞的泌酸功能

Advanced glycation end products modulate osteoclastic acidification by inhibiting the expression of V-ATPase a3 and ClC-7

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