载细胞甲壳素曲率混合膜修复角膜上皮损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.013

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (2): 232-237.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.013

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载细胞甲壳素曲率混合膜修复角膜上皮损伤

鲁静¹，武士科² ，陈光¹，赵越¹，李丹¹

¹河北大学附属医院眼科，河北省保定市 071000；²河北大学附属医院骨科，河北省保定市 071000

收稿日期:2016-10-25 出版日期:2017-01-18 发布日期:2017-02-27
通讯作者: 武士科，主治医师，河北大学附属医院骨科，河北省保定市 071000
作者简介:鲁静，女，1981年生，汉族，河北省保定市人，硕士，主治医师，主要从事生物、细胞方面的研究。
基金资助:
河北省医学科学研究重点课题(zl20140018)

Chitin hybrid membrane carrying cells repairs corneal epithelial injury

Lu Jing¹, Wu Shi-ke², Chen Guang¹, Zhao Yue¹, Li Dan¹

¹Department of Ophthalmology, ²Department of Orthopaedics, the Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China

Received:2016-10-25 Online:2017-01-18 Published:2017-02-27
Contact: Wu Shi-ke, Attending physician, Department of Orthopaedics, the Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
About author:Lu Jing, Master, Attending physician, Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
Supported by:
the Key Medical Research Project of Hebei Province, No. zl20140018

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
甲壳素：是一种高分子多糖，在自然界中含量比较高，是一种含氮的天然有机化合物存在于动物的外壳中，在体内通过化学键和其它物质结合在一起，是带正电的阳性纤维。
甲壳素的特性：①良好的生物相容性：对动植物的生物相容性都较好，在体内很少产生抗原，免疫原性比较低；②可降解性：甲壳素在体内能够被溶菌酶降解；③衍生物口服没有毒性：甲壳素的衍生物为壳聚糖，壳聚糖为口服药物，口服没有毒性；④促进伤口愈合：甲壳素能够活化细胞，促进细胞的新陈代谢，诱导机体产生细胞因子，细化皮肤、减少瘢痕形成、加速伤口愈合；⑤抗血栓的作用：对血清中低分子量物质通透性较高，对血清蛋白吸附能力比较强；⑥具有免疫、止痛、消炎、止血、抑菌等作用。

背景：研究发现甲壳素是一种比较好的生物材料，但关于甲壳素载角膜上皮细胞混合膜修复兔角膜上皮损伤的研究不多。
目的：观察载角膜上皮细胞甲壳素曲率混合膜对兔角膜上皮损伤的修复作用。
方法：取18只新西兰大白兔，建立左眼角膜上皮损伤模型，随机分2组，实验组于角膜上皮损伤处植入载角膜上皮细胞甲壳素曲率混合膜，对照组植入甲壳素曲率混合膜。植入后1，3，7 d，观察角膜上皮损伤面积、眼角膜病理组织学及超微结构。
结果与结论：①角膜上皮损伤面积：实验组植入后1，3 d的角膜损伤面积明显小于对照组(P < 0.05)，两组植入后7 d 的角膜损伤均全完愈合；②眼角膜病理组织学观察结果：植入后7 d，实验组角膜上皮层和基质层连接紧密，有6层左右上皮细胞层，修复完整，结构整齐，最外层平整光滑；对照组角膜上皮层也和基质层连接紧密，有6层左右上皮细胞层，修复完整，但上皮层层次紊乱，最外层表面不平整；③眼角膜超微结构：植入后7 d，实验组角膜上皮细胞细胞为六边形，排列较紧密，细胞表面平整；对照组角膜上皮细胞也为六边形，表面不平整，细胞之间有间隙；④结果表明：载角膜上皮细胞甲壳素曲率混合膜可促进大白兔角膜上皮损伤的修复。

ORCID: 0000-0002-3851-2453(鲁静)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 甲壳素, 角膜上皮细胞, 修复, 兔, 损伤, 组织工程材料

Abstract:

BACKGROUND: Chitin has been found to be a good biomaterial, but research on chitin carrying corneal epithelial cells for rabbit corneal epithelial injury is little reported.
OBJECTIVE: To investigate the repair outcomes of chitin hybrid membrane carrying corneal epithelial cells in the rabbit corneal epithelial injury.
METHODS: Eighteen New Zealand white rabbits were enrolled and made into left corneal epithelial injury models, and then randomized into two groups and treated with chitin hybrid membrane carrying corneal epithelial cells (experimental group) and chitin hybrid membrane (control group), respectively. The damage area, histological changes and ultrastructure of the cornea were observed at 1, 3, and 7 days after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Damage area of the cornea in the experimental group was significantly less than that in the control group at 1 and 3 days after implantation (P < 0.05), and the cornea in both two groups healed well at 7 days after implantation. At 7 days after implantation, in both two groups, the corneal epithelium with six layers adhered to the corneal stroma closely, which was repaired completely and regularly. Comparatively speaking, the cornea in the experimental group possessed smooth outer layer. Besides, in the experimental group, the hexagonal corneal epithelial cells arranged closely with flat surface; while the hexagonal corneal epithelial cells in the control group showed no smooth surface and gaps between cells. These results indicate that chitin hybrid membrane carrying corneal epithelial cells promotes the repair of rabbit corneal epithelial injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Epithelium, Cornea, Polysaccharides, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

鲁静，武士科,陈光，赵越，李丹. 载细胞甲壳素曲率混合膜修复角膜上皮损伤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 232-237.

Lu Jing, Wu Shi-ke, Chen Guang, Zhao Yue, Li Dan.

Chitin hybrid membrane carrying cells repairs corneal epithelial injury

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(2): 232-237.

图/表（结果） 5

2.1 兔角膜缘上皮细胞培养情况角膜缘上皮组织块培养1 d时，有细胞从组织块中迁出，2 d后迁出细胞呈膜状，组织块周围出现细胞生长晕，迁出细胞为多角形，呈现扁平状，连接比较紧密，培养3 d时细胞出现80%左右融合，12 d后相邻组织块之间的迁出细胞相互连接，盖满瓶底；传代培养24 h，细胞出现贴壁生长现象，培养到第6天时传代细胞生长比较旺盛，细胞均一，呈多角形，胞浆比较丰富，排列比较紧密，状态良好，有拉丝现象出现，传代至第3代时，细胞拉丝现象明显，细胞出现变形，见图1。

2.2 体内修复实验结果

2.2.1 实验动物数量分析 18只兔均造模成功，并进入结果分析。

2.2.2 两组眼大体观察结果植入后1 d，实验组眼血管充血，轻度畏光，分泌物不多，没有水肿；对照组眼血管充血明显，畏光，分泌物比较多，角膜浑浊，水肿现象明显。植入后3 d，实验组眼充血明显减轻，没有畏光，分泌物减少，没有水肿；对照组眼仍明显充血，畏光，分泌物仍然比较多，仍有角膜浑浊和水肿。植入后7 d，两组眼看起来都恢复正常。

2.2.3 两组眼超微结构观察结果植入后7 d，实验组角膜上皮细胞细胞为六边形，排列比较紧密，细胞表面平整；对照组角膜上皮细胞也为六边形，表面不平整，细胞之间有间隙，见图2。

2.2.4 两组眼组织病理学观察结果植入后7 d，实验组角膜上皮层和基质层连接紧密，有6层左右上皮细胞层，修复完整，结构整齐，最外层平整光滑；对照组角膜上皮层也和基质层连接紧密，有6层左右上皮细胞层，修复完整，但上皮层层次紊乱，最外层表面不平整，见图3。

2.2.5 两组角膜损伤区荧光染色结果植入后1 d时，实验组角膜上皮层边缘开始出现比较明显的修复现象；对照组角膜上皮层的损伤面积基本没有变化，没有修复现象出现。植入后2 d时，实验组角膜上皮层大部分已被修复，损伤上皮层的修复是分散的，与对照组的从角膜缘细胞移行修复明显不同，修复面积明显大于对照组；对照组角膜上皮层损伤面积开始出现修复现象，修复从角膜缘细胞开始向损伤中心移行，表明实验组移植的上皮细胞可能在损伤角膜上皮层修复中发挥了一定作用。植入后3 d时，实验组角膜上皮层基本恢复正常状态；对照组角膜上皮层的损伤面积也明显减少，但修复速度明显较实验组慢。植入后第4天，实验组角膜上皮层已完全恢复正常状态；对照组角膜上皮层损伤大部分被修复，只有少量损伤区域。植入后第五六天，对照组角膜上皮层已基本修复正常，植入后第7天，完全修复正常。表明甲壳素载细胞膜参与了大白兔损伤角膜上皮层的修复，能够加快角膜损伤上皮层的修复速度，缩短修复时间。

2.2.6 两组角膜上皮层损伤面积与修复率的比较

角膜上皮层损伤面积：实验组植入后1 ，3 d的角膜上皮层损伤面积明显小于对照组(t=3.457，16.374，P均< 0.05)，见表1。

角膜上皮层修复率：实验组实验组植入后1 ，3 d的角膜上皮层修复率明显高于对照组(t=4.376，10.264，P均< 0.05)，见表2。

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引言

角膜是一种透明结构，处于眼睛最外层，没有淋巴管和血管，由蛋白质与细胞构成，表面较光滑，透明清亮，结构排列有序，对眼睛发挥视觉功能具有重要意义。角膜的功能主要有防御屏障作用和维护视觉作用。角膜受损后，会出现眼部血管充血，分泌物增多，畏光，眼睛发生明显水肿，角膜混浊等现象。角膜的最外面为角膜上皮层，角膜上皮细胞之间通过桥小体互相连接，形成质膜，角膜上皮层的主要作用为：维持角膜基质层的正常功能；保护作用，防止外界有害物质侵入眼睛内，当角膜上皮受到损害时，角膜基质层会变得不规则、干燥，甚至出现角膜水肿、角膜溃疡及角膜穿孔等^[1-3]；角膜上皮层光滑透明，能够较好地维持视力；角膜上皮层还可吸收氧气和营养物质，为其他部分角膜用。角膜上皮细胞的更新周期为1周，内含有毛细血管和神经，对疼痛较敏感，角膜上皮细胞损伤后，能够通过角膜缘的上皮细胞生长移行进行快速修复，轻度角膜损伤常采用药物治疗，重度角膜损伤有致盲性，药物治疗效果欠佳，且角膜缘受到严重损害时，角膜上皮层将无法再生^[4-5]，需要进行角膜移植，但因为角膜供体较缺乏，使角膜移植临床应用受到限制。

组织工程角膜是一种新的角膜供体，主要作用是促进器官和组织的再生和形成，重建、代替并长期维持病变角膜的形态和功能。组织工程角膜支架材料要具有较好的生物相容性，理化性质与人体角膜相似，降解速度适当，能够分泌细胞因子的特点。甲壳素是一种组织工程角膜支架材料，能够提高机体免疫力，促进细胞的新陈代谢，抑制细菌生长，没有免疫原性，没有不良反应，是一种比较好的生物材料^[6-9]。研究通过培养兔角膜缘上皮细胞，制备甲壳素载兔角膜上皮细胞混合膜，建立兔角膜上皮损伤模型，观察混合膜修复角膜上皮损伤的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年10月在河北大学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：选取20只新西兰大白兔，体质量2.6- 3.1 kg，其中2只用于制备兔角膜缘上皮细胞，18只用于建立兔角膜上皮损伤模型，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2003-1-003。

主要材料、试剂和仪器：甲壳素(青岛博益特生物材料有限公司)；新生牛血清、D-Hank's、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；硫酸软骨素、青霉素、链霉素、DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)；硫酸庆大霉素(青岛国风集团华阳制药厂)；表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、戊巴比妥钠(美国Sigma公司)；戊巴比妥钠(沈阳东药集团公司)；超净工作台(苏净集团有限公司)；扫描电镜(上海力申公司)；倒置显微镜(日本佳能)；切片机(浙江科迪仪器)；荧光显微镜(美国Nicolet公司)；培养箱(上海力申公司)；裂隙灯(日本Nikon)。

1.4 实验方法

1.4.1 原代及传代培养兔角膜缘上皮细胞取2只兔，空气栓塞法处死，无菌条件下摘下眼球，去除眼球周围多余组织，用生理盐水清洗干净，放入硫酸庆大霉素中进行灭菌处理。剪下角膜，环钻切取角膜边缘部分，分离角膜边缘部分基质层和上皮层，将上皮层剪成小块，将小块上皮层外表面向下贴到细胞瓶的瓶壁上，加少许血清在培养箱中贴附，4 h后加入DMEM/F12(含新生牛血清)培养基培养，2 d换液1次，显微镜下每天观察细胞并拍照。相邻组织块迁出的细胞达到融合后，去除培养基，D-Hank's液进行清洗，加入胰蛋白酶-EDTA消化细胞，DMEM/F12(含新生牛血清)培养基终止细胞消化，制成兔角膜缘上皮细胞悬液，将制成的兔角膜缘上皮细胞进行传代培养^[10]。

1.4.2 制备甲壳素曲率混合膜将硫酸软骨素和甲壳素按比例1∶1混匀溶解，制成2%甲壳素胶液，绢布将制成的胶液过滤脱泡，铺膜，常温干燥，然后将参考文献[10]方法制备甲壳素曲率混合膜。洗涤为中性，然后将上述甲壳素胶液加入膜具孔内，置入离心膜机内4 000 r/min离心 10 min，常温干燥，蒸馏水进行浸泡，然后取下曲率混合膜，洗涤呈中性备用。

1.4.3 制备载细胞甲壳素曲率膜将上述制备的甲壳素曲率混合膜进行无菌处理，浸泡在DMEM/F12培养基中，浸泡24 h后转移到48孔板的孔底。将兔角膜缘上皮细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度进行消化传代后，接种到甲壳素曲率混合膜上，加入培养基，每天换液，显微镜下拍照并观察角膜缘上皮细胞的生长情况，待角膜缘上皮细胞生长至铺满曲率混合膜片时，取出修复兔损伤角膜。

1.4.4 建立大白兔角膜上皮细胞损伤模型将18只兔戊巴比妥钠麻醉成功后，将左眼设为手术眼，将右眼设为空白对照，对左眼进行消毒，铺巾，撑开眼睑，利多卡因进行局部麻醉，将浸有乙醇的滤纸片贴到角膜中央，软化角膜上皮层，30 s后用生理盐水冲洗，显微镜下将损伤的上皮层用刮刀背刮除，上皮损伤区经荧光素钠滤纸染色进行标记，裂隙灯下拍照观察角膜上皮损伤区。待眼部血管充血，分泌物增多，畏光，眼发生明显水肿，角膜混浊时说明造模成功。

造模成功后将兔随机分为实验组和对照组，每组9只，实验组将载细胞甲壳素曲率混合膜贴到角膜损伤眼表面，然后将上下眼睑进行缝合；对照组将甲壳素曲率混合膜贴到角膜损伤眼表面。术后妥布霉素滴眼液每天滴眼，植入后1 d每组处死3只动物，取出甲壳素混合膜，荧光素钠试纸对角膜上皮层进行染色，裂隙灯下拍照观察，记录上皮层损伤面积；植入后3，7 d，每组每个时间点处死3只动物，继续用荧光素钠试纸对角膜上皮层进行染色，并在裂隙灯下观察并记录角膜上皮层损伤面积。

1.5 主要观察指标

计算角膜上皮层修复率：植入后1，3，7 d，计算角膜上皮层修复率。角膜上皮层修复率=(最初角膜上皮层损伤面积-观察时间时角膜上皮损伤面积)/最初角膜上皮层损伤面积×100%。

电镜下超微结构观察和组织病理学检查：植入后7 d时，取下兔眼角膜，将眼角膜一分为二，一半用于戊二醛固定后在电镜下观察大白兔角膜的超微结构；另一半用甲醛固定，蒸馏水过夜冲洗，梯度乙醇依次脱水，浸蜡包埋后切成6 μm厚切片，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察兔角膜病理学变化。实验过程中若出现角膜基质溶解时，应随时处死并取完整眼球进行组织病理学检查，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光学显微镜下检查并计数角膜中央上皮细胞厚度(细胞层)并照相。

1.6 统计学分析采用SPSS19.0软件进行分析，两组之间均数比较采用t 检验，取P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

角膜各层相互协调，任何一层的结构或功能出现异常，都会引起眼球的稳态失去平衡，对视力造成影响，角膜病是仅次于白内障的第2大致盲病，容易受到机械损伤、化学物质、肿瘤、营养因素、感染及遗传等因素的影响。比较常见的角膜病有角膜外伤、感染性角膜炎及其他角膜病等。角膜上皮细胞的重要作用是维持视觉功能和维持眼表的完整性，角膜上皮细胞的生长周期为1周，角膜上皮细胞的更新源自于角膜缘干细胞，角膜上皮层受到损伤后，细胞膜的选择性和通透性发生改变，角膜对外界有害物质的抵抗能力下降，角膜上皮层的屏障功能受到影响^[11-15]。中毒、肿瘤、感染、外伤等容易引起角膜缘或者角膜上皮层损伤，结膜上皮细胞侵入角膜层表面，生成结膜化上皮，角膜层出现炎性细胞浸润，生成新生血管，结膜化上皮不规则，使角膜的屏障功能受到破坏，引起视力下降，甚至失明^[16-19]。轻度角膜损伤可药物治疗，对于重度角膜损伤需进行角膜移植，因角膜供体缺乏，使角膜移植受到限制。组织工程角膜称为一种新的角膜供体来源。组织工程角膜移植成功率较高，但长期效果不是十分理想，免疫排斥反应是影响长期效果的主要原因，组织工程角膜主要是促进器官和组织的再生和形成，对病变角膜的形态和功能进行重建及代替，并长期维持角膜的功能和结构。

组织工程角膜支架材料需要具备适当的降解速度，便于角膜组织形成^[20-22]；良好的生物相容性^[23]；与人体角膜相近的理化性质；具有机械韧性；能够分泌细胞因子，促进细胞黏附到支架上生长^[24-28]。常见的天然的组织工程角膜支架材料有胶原及其复合材料、甲壳素、脱细胞基质、透明质酸、羊膜等^[29-31]。甲壳素是一种高分子多糖，在自然界中含量比较高，是一种含氮的天然有机化合物^[32-34]，存在于动物的外壳中，在体内通过化学键和其它物质结合在一起，是带正电的阳性纤维。甲壳素具有以下特点^[35-37]：①良好的生物相容性：对动植物的生物相容性都较好，在体内很少产生抗原，免疫原性比较低；②可降解性：甲壳素在体内能够被溶菌酶降解；③衍生物口服没有毒性：甲壳素的衍生物为壳聚糖，壳聚糖为口服药物，口服没有毒性；④促进伤口愈合：甲壳素能够活化细胞，促进细胞的新陈代谢，诱导机体产生细胞因子，细化皮肤、减少瘢痕形成、加速伤口愈合；⑤抗血栓的作用：对血清中低分子量物质通透性较高，对血清蛋白吸附能力比较强；⑥具有免疫、止痛、消炎、止血、抑菌等作用：甲壳素能够使细菌产生甲壳素酶，该酶能抑制细菌生长，溶菌酶还能够激活巨噬细胞，提高免疫力等作用。甲壳素是一种比较好的医用材料，在医学多个领域均有应用^[38-39]，在眼科领域可用于制作眼药膏、滴眼液、接触镜片等，可作为人工泪液的代替品，以及用于制备组织工程角膜等。

研究将载角膜上皮细胞甲壳素曲率混合膜移植入兔角膜上皮损伤眼表面，观察载角膜上皮细胞甲壳素曲率混合膜对兔角膜上皮损伤的修复作用。植入后1 d，实验组眼血管充血，轻度畏光，分泌物不多，没有水肿；对照组眼血管充血明显，畏光，分泌物比较多，角膜浑浊，水肿现象明显。植入后3 d，实验组眼充血明显减轻，没有畏光，分泌物减少，没有水肿；对照组眼仍明显充血，畏光，分泌物仍然比较多，仍有角膜浑浊和水肿。植入后7 d，两组眼看起来都恢复正常。植入后7 d，处死大白兔，电镜下见实验组眼角膜上皮细胞细胞为六边形，排列比较紧密，细胞表面平整；对照组眼角膜上皮细胞也为六边形，表面不平整，细胞之间有间隙。植入后7 d，实验组兔角膜上皮层和基质层连接紧密，有6层左右上皮细胞层，修复完整，结构整齐，最外层平整光滑；对照组眼角膜上皮层也和基质层连接紧密，有6层左右上皮细胞层，修复完整，但上皮层层次紊乱，最外层表面不平整。裂隙灯下对角膜损伤上皮进行拍照观察，发现：植入后1 d时，实验组角膜上皮层边缘开始出现比较明显的修复现象，对照组角膜上皮层的损伤面积基本没有变化，没有修复现象出现；植入后3 d时，实验组角膜上皮层基本恢复正常状态，对照组角膜上皮层的损伤面积也明显减少，但修复速度明显较甲壳素载细胞膜组慢；植入后第4天，实验组角膜上皮层已完全恢复正常状态，对照组角膜上皮层损伤面积大部分被修复，只有少量损伤区域；植入后第7天，两组角膜上皮层均完全修复正常。

实验组植入后1，3 d的角膜损伤面积均明显小于对照组，两组植入后7 d的角膜损伤面积均为0。实验组植入后1，3 d的角膜修复率均明显大于对照组，两组植入后7 d的角膜修复率均为100%，均已全部修复。表明载角膜上皮细胞甲壳素曲率混合膜能够促进大白兔角膜上皮损伤的修复，载细胞甲壳素曲率膜参与了大白兔损伤角膜上皮层的修复，能够加快角膜损伤上皮层的修复速度，缩短修复时间。甲壳素的主要生化作用是产生细胞因子，抑制成纤维细胞的增殖，促进体内巨噬细胞的前移，促进胶原蛋白合成。甲壳素能够调节信号传导，促进分泌生长因子，并促进细胞增殖和前移，提供角膜上皮层的修复速度，甲壳素具有抗炎作用，能够减轻角膜上皮损伤局部的炎症反应，硫酸软骨素也促进角膜上皮的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

载细胞甲壳素曲率混合膜修复角膜上皮损伤

Chitin hybrid membrane carrying cells repairs corneal epithelial injury

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