hIL-24基因通过调控转化生长因子β/Smad通路影响瘢痕疙瘩的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.33.009

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (33): 4926-4932.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.33.009

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hIL-24基因通过调控转化生长因子β/Smad通路影响瘢痕疙瘩的生物学特性

吴志远1，史玉仓2，蒋军健3，吴志贤2，张慧君2，刘艳芳2，刘宏伟1

1暨南大学第一临床学院，广东省广州市 510632；2广东医学院附属医院整形外科，广东省湛江市 524001；3复旦大学附属华山医院手外科，上海市 200040

收稿日期:2016-05-24 出版日期:2016-08-12 发布日期:2016-08-12
通讯作者: 刘宏伟，博士，教授，暨南大学第一临床学院，广东省广州市 510632
作者简介:吴志远，男，1970年生，广东省湛江市人，汉族，2001年广东医科大学毕业，硕士，教授，主要从事瘢痕基础研究。
基金资助:
湛江市科技攻关计划项目(2014B01024)

hIL-24 gene influences the biological characteristics of the keloid by regulating transforming growth factor-beta/Smad pathway

Wu Zhi-yuan1, Shi Yu-cang2, Jiang Jun-jian3, Wu Zhi-xian2, Zhang Hui-jun2, Liu Yan-fang2, Liu Hong-wei1

1the First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2Department of Plastic Surgery, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China; 3Department of Hand Surgery, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China

Received:2016-05-24 Online:2016-08-12 Published:2016-08-12
Contact: Liu Hong-wei, M.D., Professor, the First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
About author:Wu Zhi-yuan, Master, Professor, the First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Research Fund of Zhanjiang, No. 2014B01024

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
瘢痕疙瘩：是继发于皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后，以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的皮肤胶原性疾病。与增生性瘢痕不同，瘢痕疙瘩超过皮损边缘呈浸润性生长，侵犯临近组织，无自限性，易造成功能障碍，有好发部位，多见于有色人种，不发生退行性变化，单纯手术切除后易复发，必须辅以电子线照射等综合治疗，有良性真皮肿瘤之称。
hIL-24基因：是研究较明确的抑癌基因，属于是单拷贝基因，定位于的1q32-41，由7个外显子和6个内含子组成，含有49个氨基酸的信号肽。可激活免疫应答效应，又可发挥特异性地抑制癌细胞生长作用，抑制癌周新生血管增生。由于其受体在不同组织、细胞中的表达存在差异，从而hIL-24发挥不同功能。

摘要
背景：hIL-24基因是研究较明确的肿瘤抑制基因，既可以表达免疫系统刺激蛋白，刺激免疫应答效应，又能特异性地抑制肿瘤细胞生长，抑制肿瘤血管形成，诱导肿瘤细胞凋亡。
目的：分析hIL-24对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制增殖和诱导凋亡的作用及机制。
方法：经临床及病理确诊为瘢痕疙瘩13例，取瘢痕疙瘩组织进行成纤维细胞培养和鉴定。实验分为对照组(瘢痕疙瘩组织成纤维细胞)和转染hIL-24的瘢痕疙瘩成纤维细胞组。构建慢病毒载体(LVTHM)将hIL-24基因转染瘢痕疙瘩组织成纤维细胞，观察转化生长因子β、Smad3、增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶抑制物1基因表达情况。
结果与结论：①细胞免疫荧光染色及细胞流式显示培养的成纤维细胞内胞浆波形蛋白抗体呈阳性，纯度大于97.8%；定量PCR检测成纤维细胞hIL-24的过表达效率为81.7%；② Western blot检测转梁的成纤维细胞表达hIL-24明显增加；③定量PCR检测，对照组转化生长因子β、Smad3、增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达明显高于转染hIL-24的瘢痕疙瘩成纤维细胞组(P < 0.05)，基质金属蛋白酶抑制物1表达明显低于转染hIL-24的瘢痕疙瘩成纤维细胞组；④结果提示，hIL-24抑制成纤维细胞增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达，其作用机制可能是通过转化生长因子β/Smad3转导途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0001-6087-1308(吴志远)

关键词: 组织构建, 组织工程, 瘢痕疙瘩, hIL-24, TGF-β/Smad

Abstract:

BACKGROUND: hIL-24, a tumor suppressor gene, can stimulate immune responses, inhibit the growth of tumor cells, and the formation of tumor vessels, and induce cell apoptosis.
OBJECTIVE: To explore the effects of hIL-24 gene on the proliferation and apoptosis of fibroblasts in the keloid and the underlying mechanisms.
METHODS: All the keloid specimens collected from 13 patients were used for fibroblast culture and indentification. Fibroblast of the keloid was transfected with or without hlL-24 lentivirus. Subsequently, mRNA expressions of transforming growth factor-β, Smad3, proliferating cell nuclear antigen, matrix metalloproteinase-2, -9, and metallopeptidase inhibitor 1 were determined.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunofluorescent staining and flow cytometry showed that vimentin antibody was expressed positively in cytoplasma of fibroblast cultures, and the purity was more than 97.8%. Western blot assay showed that hIL-24 expression was significantly increased in the transfected fibroblasts. Quantitative PCR showed that the overexpression rate of hIL-24 in fibroblasts was 81.7% and mRNA expressions of transforming growth factor-β, Smad3, proliferating cell nuclear antigen, matrix metalloproteinase-2, and -9 were significantly decreased, while metallopeptidase inhibitor 1 mRNA expression was significantly increased in hIL-24 transfection group compared with control group (P < 0.05). These findings suggest that hIL-24 gene inhibits the expressions of proliferating cell nuclear antigen, matrix metalloproteinase-2, and -9 in fibroblasts, and the underlying mechanism may involves TGF-β/Smad3 pathway.

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Key words: Keloid, Matrix Metalloproteinases, Signal Transduction

中图分类号:

R318

吴志远，史玉仓，蒋军健，吴志贤，张慧君，刘艳芳，刘宏伟. hIL-24基因通过调控转化生长因子β/Smad通路影响瘢痕疙瘩的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(33): 4926-4932.

Wu Zhi-yuan, Shi Yu-cang, Jiang Jun-jian, Wu Zhi-xian, Zhang Hui-jun, Liu Yan-fang, Liu Hong-wei. hIL-24 gene influences the biological characteristics of the keloid by regulating transforming growth factor-beta/Smad pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(33): 4926-4932.

图/表（结果） 3

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引言

瘢痕疙瘩是继发于皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后，以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的皮肤胶原性疾病。与增生性瘢痕(HS)不同，瘢痕疙瘩超过皮损边缘呈浸润性生长，侵犯临近组织，无自限性，易造成功能障碍，有好发部位，多见于有色人种，不发生退行性变化，单纯手术切除后易复发，必须辅以电子线照射等综合治疗，有良性真皮肿瘤之称。尽管国内外学者从组织、细胞和分子水平上，对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和分化活性异常、细胞外基质过度沉积的病理机制不断进行探讨，也了解到瘢痕的过度增生涉及炎症、免疫、生长因子和某些基因的变化，但是仍不清楚其确切机制，治疗方面尚无突破性进展。

近年来，许多研究显示瘢痕疙瘩的形成可能是由于成纤维细胞胶原合成失调(主要表现为不成比例增加)所致，导致这种失控的原因是控制胶原mRNA转录的有关基因缺失、增加或突变，以致胶原mRNA转录增加^[1-2]。许多研究也显示，瘢痕疙瘩成纤维细胞过度增殖和胶原过度合成的原因可能与基因的结构异常及功能异常有关^[3]。因此寻找瘢痕疙瘩的相关调控基因已成为当前瘢痕研究的热点。

hIL-24是单拷贝基因，定位于的1q32-41，由7个外显子和6个内含子组成，含有49个氨基酸的信号肽。hIL-24表达可在对正常细胞无影响的前提下，特异性诱导肿瘤细胞凋亡，有效抑制原位癌和转移癌的生长。已有研究表明，hIL-24在正常黑素细胞以及早期黑色素瘤中有较高水平的表达，而当肿瘤恶性程度逐渐增加时，其表达出现减少趋势，在转移性黑色素瘤细胞中，则几乎无hIL-24的表达^[4-7]。近期有大量文章表明，hIL-24可通过启动各个信号转导通路实现诱导广泛癌细胞凋亡^[8-9]。hIL-24因其特异性的诱导细胞凋亡的特性，正逐渐成为研究热点。

瘢痕疙瘩又名瘢痕瘤，本质上为皮肤的一种纤维组织肿瘤，具有类肿瘤特性。因此，此次研究拟构建过表达hIL-24基因的慢病毒载体，从瘢痕疙瘩中分离原代成纤维细胞后，转染过表达hIL-24慢病毒载体，探讨hIL-24对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用，从信号转导途径(TGF-β/Smad3)初步探讨hIL-24作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的相关机制。

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材料方法

设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2014年9月至2015年8月在广东医学院附属医院完成。

1.3 材料实验标本来自就诊广东医学院附属医院整形外科患者，经临床及病理确诊为瘢痕疙瘩，其中男性6例、女性9例；年龄10-47岁，平均年龄(27.2±5.1)岁；病变部位包括耳垂、前胸、上臂、腹部等处。实验分为对照组(瘢痕疙瘩成纤纤细胞)和转染hIL-24的成纤维细胞组；标本取材后即置于液氮瓶中，后转到-70 ℃冰箱保存至使用。所有标本均经患者知情同意后进行成纤维细胞培养等后续实验。

纳入标准：临床及病理确诊为瘢痕疙瘩。

排除标准：临床所见为瘢痕或瘢痕增生组织，经病理确诊为非瘢痕疙瘩。

1.4 实验方法

1.4.1 慢病毒载体(LVTHM)的构建基因片断根据microRNA的miRNA区域设计，并通过oligoengine work station运算所得，软件推算的感染效率为82.8%。

1.4.2 成纤维细胞培养与鉴定无菌条件下去除瘢痕疙瘩组织表皮及脂肪组织，PBS(含1%PS双抗)漂洗3次，用眼科剪碎(大小约0.5 mm³)，加DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清，1%PS双抗)，反复吹打，重悬为组织微粒悬液。置入培养箱中留置培养，每天观察细胞形态、培

hIL-24转染瘢痕疙瘩成纤维细胞实验用试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
DMEM培养液	Gibco
小牛血清	华美生物
0.25%胰蛋白酶	Sigma
DNA抽提试剂盒	Tiangen
PfuUltra™ High-Fidelity DNA Polymerase	stratagene CO.
dNTP	sangon
PCR扩增仪、低温高速离心机	Eppdorf
UV-1601型紫外分光光度仪	Shimadzy
凝胶成像分析系统、蛋白电泳灌胶模具	Bio-Rad
垂直蛋白电泳系统 SE600	Hoefer
聚羟基乙酸、硝酸纤维素膜	Corning
显影液、定影液	Koda
ECL发光试剂盒A、B液	博士得公司

养液颜色变化，注意有无污染，7 d左右传代1次。

将细胞消化并稀释，制成细胞悬液，按0.8×10⁷L^-1细胞浓度均匀接种于预先覆盖灭菌盖玻片的12孔板中。观察细胞铺满盖玻片面积约50%时，取出盖玻片，PBS清洗3次，用40 g/L多聚甲醛固定30 min(室温)。免疫荧光染色及细胞流式检测细胞浆波形蛋白抗体阳性率。

1.4.3 感染成纤维细胞将hIL-24基因转染瘢痕疙瘩组织成纤细胞。当成纤维细胞达到60%融合，PBS洗涤，Trypsin液消化；用含血清培养基终止反应，吹吸分散细胞，离心、重悬、培养细胞，待细胞长到50%-80%单层时，无血清培养基洗涤细胞，将慢病毒载体滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，孵育4-6 h；用含体积分数10%胎牛血清及1%PS双抗的DMEM培养基替换感染液后继续培养；加入相应选择性抗生素，分次筛选稳转株。

1.4.4 RT-PCR测定感染效率细胞计数仪计数后，取1×10⁶细胞量，液氮研磨，研磨过程中加入Trizol，移入匀浆器，反复抽打匀浆；转移进新离心管，离心，加氯仿，震荡、离心，加异丙醇，震荡、离心；加入75%乙醇，震荡、离心，加入DEPC溶解RNA；分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度。

以各组cDNA作为模板，按照RT-PCR标准流程进行半定量PCR，根据相对定量法计算目标片段的扩增比例。选择18S RNA作为内参。每个样本重复3次，每组实验各重复3次。

引物序列：hIL-24Forward，5’- GCC TTT GTT TCC CAT CAG AC -3’，Reverse，5’- CCC GAC TTC CCT TTG TGT AA -3’。

1.4.5 Western-blot测定感染的后成纤维细胞表达hIL-24情况取2×10⁶细胞加入RIPA液120 μL，充分裂解、离心，取25 μL裂解后的蛋白，使用蛋白凝胶电泳90 V，弃去电泳液，用TBST洗膜，15 min×3次。加入TH抗体(1∶150稀释)，于摇床4 ℃孵育过夜，弃一抗，TBST洗膜10 min×3次，加入HRP标记的二抗(1∶1 000稀释)，摇床80 r/h 1 h后，用TBST洗膜10 min×3次，尽量吸干膜表面TBST，将荧光底物A、B液等量混合后，反应1 min左右，曝光后显影，并拍照。

1.4.6 定量PCR检测各组成纤维细胞中转化生长因子β、Smad3、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶抑制物1的表达。按照标准RNA抽提流程，抽提各组细胞的总RNA，并利用反转录试剂盒，经反转录生成相应的cDNA。

以各组cDNA作为模板，建立相应的反应体系，SYBR Green I荧光染料法绘制溶解曲线，生成原始数据，并进行分析。

1.5 主要观察指标 ①成纤维细胞培养与鉴定；②慢病毒感染成纤维细胞及感染效率测定结果；③Western blot检测hIL-24表达情况；④定量PCR检测各组成纤维细胞表达转化生长因子β、Smad3、增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶抑制物1结果。

1.6 统计学分析采用Stata 12.1软件，使用单因素方差分析，比较各组间表达差异。P < 0.05时认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

瘢痕疙瘩是组织损伤后的异常修复，表现为以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强，逃避凋亡，向周围正常皮肤组织迁移、侵袭性生长，及以Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白为主的细胞外基质沉积等。目前临床上多采用综合治疗的方法，然而疗效却不甚满意。因此，积极探索瘢痕疙瘩中成纤维细胞和细胞外基质的活动情况显得尤其重要。

hIL-24基因是研究较明确的抑癌基因，可激活免疫应答效应，又可发挥特异性地抑制癌细胞生长作用，抑制癌周新生血管增生。由于其受体在不同组织、细胞中的表达存在差异，从而hIL-24发挥不同功能。其中，皮肤是hIL-24的主要靶组织。研究数据表明，hIL-24可以通过促进真皮细胞增殖而影响表皮的功能^[10]。更重要的是，hIL-24具有广泛的抗肿瘤作用，当其通过质粒转染或腺病毒载体将其转染人肿瘤细胞使其异位表达，可以通过上调caspase3，上调Bax，下调Bcl-2来诱导细胞的凋亡。hIL-24可以下调MDR1、MRP1、和LRP等基因的表达，从而减少p-gp的表达，促进化疗药物在肿瘤细胞内的蓄积，减少外排，增强化疗药物的作用，来逆转肿瘤细胞的耐药性，但对正常细胞没有类似影响^[11-12]。相关研究证实，hIL-24联合顺铂展开了对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的抑癌增效及其凋亡研究。CCK-8检测结果显示hIL-24对A549/DDP细胞具有生长抑制作用，而对正常细胞WI-38无毒性，对于长期应用顺铂而产生耐药的肺癌hIL-24表现出了优势，且联合用药之后抑制率与单独用药比较差异有统计学意义，表明hIL-24具有化疗增敏效应，可减少高剂量DDP所致的不良反应，从而达到低毒高效的作用^[13]。虽然，体内外研究阐述了hIL-24对癌变调节的多种可能机制，但该基因对瘢痕疙瘩的作用及其机制尚未报道。

PCNA(增殖细胞核抗原)是一种在细胞核内合成的蛋白质，相对分子质量为36 000。增殖细胞核抗原表达量的变化与DNA合成称正相关性，可通过检测增殖细胞核抗原在细胞中的表达量，评价细胞增殖状态^[14-15]。此次研究发现，感染hIL-24的瘢痕疙瘩成纤维细胞表达增殖细胞核抗原显著下降，表明hIL-24可以抑制增殖细胞核抗原合成，并且成纤维细胞增殖减慢。

基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制物，主要参与调节细胞外基质降解，基质金属蛋白酶是重要的蛋白水解酶，可使胶原螺旋的稳定性降低，改变底物二级结构，为其他蛋白酶降解创造条件，是ECM降解过程中起决定性作用的蛋白酶^[16-17]。基质金属蛋白酶抑制物作为一种基质金属酶抑制物，可有效抑制基质金属蛋白酶功能，它可与基质金属蛋白酶非共价结合，抑制基质金属蛋白酶的活性，亦可与酶原结合，进一步阻止其活化，达到抑制细胞外基质降解的作用，因此，基质金属蛋白酶抑制物与基质金属蛋白酶的动态平衡在组织修复的进程中起着至关重要的作用^[18-21]。在本研究中对基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶抑制物1进行检测发现，感染hIL-24的成纤维细胞表达基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9下降，说明hIL-24具有抑制细胞外基质分解的作用。但是，基质金属蛋白酶抑制物1表达增加，推测由于局部基质金属蛋白酶短期内增加过盛，机体为保持基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制物之间的平衡，使其被动升高。以前的有关研究也为此提供支持^[22-23]。

转化生长因子β1是目前公认的与瘢痕疙瘩形成最为密切的细胞因子。转化生长因子β1家族成员对表皮细胞的生长、分化、凋亡及肿瘤形成具有调控作用。转化生长因子β1细胞表面受体主要分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。其中转化生长因子β1直接刺激血管生成，刺激FB增殖及细胞中葡萄糖与氨基酸的转运和糖酵解的进行，同时也抑制基质金属蛋白酶活性和促进基质金属蛋白酶组织抑制剂纤溶酶原激活物抑制剂1基因的表达，进而抑制细胞外基质的降解；还介导血小板源性生长因子、结缔组织生长因子的致纤维化作用；促进纤维粘连蛋白和胶原基质的黏附，促进瘢痕的形成^[24-27]。有研究发现，转化生长因子β1的存在会不断刺激KFB诱导基质产生，导致细胞基质的过度沉积。研究发现，丹参涂膜剂可改善增生期瘢痕微循环局部缺氧状态，进而抑制瘢痕组织内细胞因子转化生长因子β1的表达^[28-29]。

TGF-β1/Smads属于受体偶联丝/苏氨酸激酶信号通路，具有多生物学效性，可调节各类细胞的增殖、分化以及凋亡。在胚胎期该信号失调节时，可引发器官发育受限，表现在成熟个体时TGF-β1/Smads通路与自身免疫、炎性反应、细胞外基质沉积、局部纤维结缔组织增生、肿瘤的增殖、侵袭及转移等有密切联系^[30-31]。近年来，已有大量研究报道转化生长因子β1及其信号分子 Smads 可有效促进各类创面修复进程，抑制smad3基因的表达可能减少转化生长因子β信号通路的传导，从而减少病理性瘢痕的形成。此次研究中发现感染hIL-24的成纤维细胞表达转化生长因子β1、Smad3均下降，由此推测hIL-24可能通过TGF-β1/ Smads途径发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

hIL-24基因通过调控转化生长因子β/Smad通路影响瘢痕疙瘩的生物学特性

hIL-24 gene influences the biological characteristics of the keloid by regulating transforming growth factor-beta/Smad pathway

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