Transwell共培养条件下诱导脂肪干细胞成骨能力的改变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (28): 4155-4161.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.008

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Transwell共培养条件下诱导脂肪干细胞成骨能力的改变

孙仕晨，董腾哲，黄昕，张云龙，陈刚

天津医科大学口腔医院口腔颌面外科，天津市 300070

修回日期:2016-05-16 出版日期:2016-07-01 发布日期:2016-07-01
通讯作者: 陈刚，博士，教授，天津医科大学口腔医院口腔颌面外科，天津市 300070
作者简介:孙仕晨，男，1988年生，河北省唐山市人，汉族，天津医科大学在读硕士，主要从事口腔颌面外科及组织工程方面的研究。
基金资助:
教育部留学回国人员科研启动基金资助项目[教外司留(2012)940]

Osteogenic efficiency of induced adipose-derived stem cells under Transwell co-cultured condition

Sun Shi-chen, Dong Teng-zhe, Huang Xin, Zhang Yun-long, Chen Gang

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Revised:2016-05-16 Online:2016-07-01 Published:2016-07-01
Contact: Chen Gang, M.D., Professor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
About author:Sun Shi-chen, Studying for master’s degree, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by:
the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry of China, No. (2012)940

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
成骨细胞前体：即骨祖细胞，为成骨细胞的前体细胞，处于间充质干细胞向成骨细胞分化过程的中间阶段，分布于骨内膜、骨皮质、骨膜等处。具有继续分化为成骨细胞的能力，可通过分化为成骨细胞继而形成骨组织参与骨的改建与修复。
骨髓间充质干细胞在分化为成骨细胞过程中的作用：成骨细胞的前体细胞起承上启下的作用，但其在体内数量稀少，提取困难。脂肪干细胞较其他来源的间充质干细胞来源广泛，取材方便的。实验将脂肪干细胞在体外成骨诱导7 d，使其具有成骨细胞前体的特点，可获得足够数量的前体细胞，为体外研究提供充足细胞来源。

摘要
背景：在共培养条件下，间充质干细胞可调节成骨细胞的分化和成骨能力。
目的：研究成骨细胞前体与未分化的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞在矿化培养液中共培养对其成骨效能的影响。
方法：脂肪干细胞成骨诱导7 d后获得诱导后的脂肪干细胞，将其分别与上述骨髓、其脐带和胎盘来源的间充质干细胞在Transwell小室中进行间接共培养。实验组根据间充质干细胞种类不同将其分为骨髓来源组、脐带来源组和胎盘来源组，对照组为诱导后的脂肪干细胞单独培养。在不同实验间期通过检测碱性磷酸酶活性以及定量分析钙基质沉积情况，观察不同组织来源的间充质干细胞对诱导后脂肪干细胞成骨效能的影响。
结果与结论：①碱性磷酸酶表达活性：间接共培养条件下实验组各组碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P < 0.05)，实验组中骨髓来源组碱性磷酸酶活性高于脐带来源组和胎盘来源组(P < 0.05)；②钙化基质定量分析：实验组各组均显著高于对照组(P < 0.05)，实验组中脐带来源组高于骨髓来源组和胎盘来源组(P < 0.05)；③结果表明：诱导后的脂肪干细胞在间接共培养条件下受间充质干细胞的调节成骨能力明显提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1124-2107(孙仕晨)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 骨髓间充质干细胞, 脐带间充质干细胞, 胎盘间充质干细胞成骨, Transwell共培养, 成骨细胞前体, 分化, 微环境, 基质, 诱导

Abstract:

BACKGROUND: Under co-culture conditions, mesenchymal stem cells could regulate osteogenic differentiation and osteogenesis of osteoblasts.
OBJECTIVE: To observe the osteogenic efficiency of osteoblastic precursor cells co-cultured with undifferentiated bone marrow-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, or placenta-derived mesenchymal stem cells in mineralization medium.
METHODS: Adipose-derived stem cells were induced in osteogenic differentiation medium for 7 days before being indirectly co-cultured with undifferentiated mesenchymal stem cells isolated from different tissues (bone marrow group, umbilical cord group and placenta group) in Transwell plates. Induced adipose-derived stem cells cultured alone served as control group. At different experimental intervals, quantitative analysis of alkaline phosphatase activity and calcified matrix was preformed to observe the effects of mesenchymal stem cells from different sources on the osteogenic efficiency of induced adipose-derived stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Expression of alkaline phosphatase was significantly higher in different experimental groups than the control group (P < 0.05), and it was also higher in the bone marrow group than the umbilical cord and placenta groups (P < 0.05). Quantitative analysis of calcified matrix revealed that the experimental groups were significantly higher than the control group (P < 0.05); and in experimental groups, the umbilical cord group was higher than bone marrow group and placenta group(P < 0.05). These findings indicate that the osteogenic efficiency of induced adipose-derived stem cells is improved dramatically under co-culture conditions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Alkaline Phosphatase

中图分类号:

R394.2

孙仕晨，董腾哲，黄昕，张云龙，陈刚. Transwell共培养条件下诱导脂肪干细胞成骨能力的改变[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4155-4161.

Sun Shi-chen, Dong Teng-zhe, Huang Xin, Zhang Yun-long, Chen Gang. Osteogenic efficiency of induced adipose-derived stem cells under Transwell co-cultured condition [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4155-4161.

图/表（结果） 1

2.1 脂肪干细胞形态 脂肪干细胞原代培养24 h后可见少量细胞贴壁，细胞形状不规则，呈卵圆形或多边形。培养至第7天细胞形态呈长梭形、多角型及不规则型，融合程度达80%。细胞传代培养至第3代，增殖较快，形态呈细长梭形，排列有序且分布均匀(图1)。

2.2 脂肪干细胞表型鉴定结果 流式细胞检测显示提取的脂肪干细胞在传代培养第3代时高表达间充质干细胞标志物CD73和CD90，未表达CD31和CD45等其他类型细胞标志物(表1)，与以往文献报道一致^[16]，证实所提取细胞为脂肪干细胞。

2.3 各组钙化基质形成情况 脂肪干细胞成骨诱导7 d后，细胞形态改变，胞体逐渐变大并逐渐变成多边形(图2A)，茜素红染色显示无钙基质沉积(图2B)。诱导21 d后，茜素红染色可见有钙基质形成(图2C)。

钙基质定量分析结果如表2所示，实验组CPC溶液吸光度值在各时间点均高于对照组(P < 0.05)，脐带来源组在各时间点吸光度值最大(P < 0.05)，胎盘来源组吸光度值在诱导7 d时高于骨髓来源组(P < 0.05)，诱导10-14 d虽高于骨髓来源组但差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 各组碱性磷酸酶活性变化 各组细胞在整个培养阶段碱性磷酸酶活性呈现出相似的趋势，矿化培养液中培养第7天时碱性磷酸酶活性达到峰值，培养第7-14天碱性磷酸酶活性逐渐下降。在整个实验观察期间，骨髓来源组碱性磷酸酶活性在各时间间期始终为最高(P < 0.05)。脐带来源组碱性磷酸酶活性在培养第3-5天时显著高于对照组(P < 0.05)。胎盘来源组碱性磷酸酶活性在培养第3-5天和第10-12天时显著高于对照组(P < 0.05)，见表3。

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引言

再生医学是近年来兴起的用于修复再生组织器官缺损缺失的一种治疗方法^[1]。对修复口腔颌面部骨组织缺损以及由此导致的形态与功能缺陷具有极大优势。作为种子细胞，间充质干细胞广泛分布于人体的骨髓、脂肪、胎盘和脐带等组织内，能够自我更新并具向骨、脂肪和软骨等成熟组织分化^[2-4]。脂肪干细胞因其来源丰富、取材方便、对供体损伤小等优点，在骨组织工程方面具有独特的应用潜力^[5-6]。在骨组织发生过程中，干细胞向成骨细胞分化增殖，进而形成骨组织的调控机制较为复杂。其中，不同类型组织细胞之间的相互影响尤为突出^[7-8]。

成骨细胞在体内成骨过程中接受周围微环境的影响。微环境对成骨细胞的调节可大致分为直接接触调节和间接接触调节两种途径^[9-10]。直接接触调节是通过相邻细胞间细胞膜直接接触实现的，胞质中的小分子物质如Ca²⁺，cAMP通过细胞间的缝隙连接进行交换，从而实现对细胞的调节作用^[11]。间接接触调节是细胞将合成的细胞因子等物质分泌到周围环境，随后分泌的细胞因子再与细胞表面受体结合，实现对细胞生理功能的调节^[12]。在体外，通过共培养可部分模拟体内多种细胞相互作用的环境。而通过Transwell小室可有效地观察细胞间的间接接触调节。

成骨细胞起源于体内骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞首先分化为骨祖细胞，骨祖细胞处于成骨细胞前体阶段，可继续分化为成骨细胞，继而形成骨组织^[13]。目前的一些研究着重于间充质干细胞与成骨细胞间的相互调节关系，对间充质干细胞与骨祖细胞之间调节研究较少，其与间充质干细胞的相互作用关系尚待进一步研究。基于这一点，实验的目的在于探究间充质干细胞对骨祖细胞向成骨细胞分化的调节。

由于体内，成骨细胞前体在骨髓有核细胞中数量稀少，获得难度大^[14]。通过体内获取的成骨细胞前体已进行相关研究，无法获取足够数量的细胞成为制约相关研究开展的原因。实验以成骨诱导后的脂肪干细胞为研究对象，在体外环境观察其与多种间充质干细胞在矿化培养液中间接共培养后，增殖分化为成骨细胞并形成矿化基质的效能，初步观察不同类型干细胞与诱导的脂肪干细胞共培养环境下，对其成骨能力的调控与影响。

材料方法

1.1 设计 对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2014年8月至2015年8月在血液学研究所国家重点实验室完成。

1.3 材料

脂肪组织：实验所用脂肪组织取自女性(4例)腹部吸脂术获取的皮下脂肪组织，由天津伊美尔整形美容医院提供。供者年龄22-30岁，体质量指数为22- 26 kg/m²，排除系统性疾病，以及乙肝和结核等传染病。实验征得供者本人同意并填写知情同意书后收集脂肪组织标本。

细胞：实验所用骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞由血液病研究所国家重点实验室提供。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪干细胞提取 按照课题组前期报告的技术路线提取脂肪干细胞，并进行体外扩增^[15]。无菌条件下，量取20 mL吸脂术脂肪，置于50 mL无菌离心管中。常温PBS反复冲洗脂肪组织至悬液无明显红色，加入 15 mL含体积分数0.075%的Ⅰ型胶原酶溶液，混合均匀。将密封的离心管置于37 ℃恒温水浴锅中缓慢震荡消化30 min。将离心管于1 800 r/min离心20 min，去除上层油脂、未消化的脂肪组织及纤维结缔组织等。PBS轻轻吹打细胞，小滤网过滤细胞悬液，1 800 r/min再次离心10 min，去除上层液面漂浮的油脂，重复此步，至去净悬浮油脂。用10 mL红细胞裂解液重悬细胞，静置至悬液清亮，1 500 r/min离心5 min，DMEM/F-12重悬细胞，接种于T25培养瓶中，置于恒温细胞孵箱中培养，每隔3 d换液1次。

待细胞贴壁生长至70%-80%融合度时，此时的细胞即为原代细胞记为P0，应用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代，此时细胞记为P1，待细胞达到70%-80%融合度时，消化、传代，依次记为P2，P3……Pn代细胞。

1.4.2 流式细胞术鉴定 取传至第3代的脂肪干细胞(P3)，胰酶消化后，以2×10⁵细胞量分别接种于流式管中，加入4 μL小鼠抗人CD31/CD45/CD73/CD90单克隆抗体，震荡混匀。4 ℃避光孵育30 min，用含体积分数2%胎牛血清的PBS清洗，1 500 r/min离心5 min，加入40 g/L多聚甲醛固定后流式细胞仪检测。

1.4.3 脂肪干细胞成骨诱导 取生长良好的传代培养第4代脂肪干细胞(P4)，经消化后接种于6孔板，每孔接种1×10⁵个细胞，贴壁24 h后弃去原培养液更换为成骨诱导培养液(DMEM/F-12含10^-⁷ mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C)，每隔72 h换液。在诱导第21天时，进行茜素红染色。

取传代培养第4代的脂肪干细胞(P4)，经消化后接种于T75培养瓶，DMEM/F-12贴壁24 h后弃去原培养液更换为成骨诱导培养液，每隔72 h换液，诱导7 d。

1.4.4 间接共培养体系建立 应用Transwell培养板(美国Corning公司)建立细胞共培养体系，按1∶2的比例, 上层接种的2×10⁴个间充质干细胞，下层接种4×10⁴个诱导的脂肪干细胞。实验组根据间充质干细胞不同的组织来源, 共分为3组, 即：骨髓来源组，脐带来源组和胎盘来源组。对照组上层不接种间充质干细胞，下层接种4×10⁴个诱导的脂肪干细胞。DMEM/F-12培养液贴壁24 h后弃去原培养液更换为矿化培养液(DMEM/F-12含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C)，培养14 d。

1.4.5 碱性磷酸酶活性 分别于培养第3，5，7，10，12，14天，取每组各3孔细胞，裂解细胞后，按碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成科技有限公司)说明检测碱性磷酸酶活性。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)测量总蛋白浓度。

1.4.6 钙化基质定量分析 分别于培养第7，10，12，14天，各取5孔细胞以体积分数70%乙醇固定，体积分数0.5%茜素红染色1 h，PBS清洗后加入体积分数10%氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液(美国Amresco公司)，室温下孵育30 min。吸取上清液，使用酶标仪于紫外线波长562 nm处测定样本CPC溶液的吸光度值，分析其钙化基质沉积量。

1.5 主要观察指标 各组诱导的脂肪干细胞碱性磷酸酶活性检测；各组诱导的脂肪干细胞钙化基质定量分析结果。

1.6 统计学分析 所得各实验间期碱性磷酸酶活性及CPC溶液吸光度值用x(_)±s表示，组间数据差异采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析检测，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

早前研究发现，将成骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养，成骨细胞的成骨活性受到抑制，碱性磷酸酶及钙化基质均减少^[10^，^12]；而将成骨细胞与骨细胞共培养时，成骨细胞活性则得到显著提高^[9]。这一现象提示将不同分化阶段的细胞共培养有可能会产生不同结果。间充质干细胞的成骨分化进程，经历了成骨细胞前体，最终分化为成骨细胞^[17]。

实验中，诱导的脂肪干细胞具有成骨细胞前体的特征。因成骨细胞前体在体内数量少获取难度大，因此作者将脂肪干细胞向成骨细胞前体诱导，从而克服了成骨细胞前体数量上的缺点，获取了足够数量的细胞。同时相关研究结果提示，脂肪干细胞在成骨诱导培养基中培养7 d后，细胞形态近似成骨细胞，与成骨相关的基因RUNX2、骨桥蛋白及Ⅰ型胶原等水平也上调，表明经成骨诱导7 d后的细胞处于前成骨阶段^[3]。

不同组织来源的间充质干细胞促进诱导的脂肪干细胞的骨向分化，但有各自的特点。由实验结果可见，在碱性磷酸酶的活性方面，实验组高于对照组，实验组中骨髓来源组高于脐带来源组和胎盘来源组，诱导的脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞共培养时碱性磷酸酶活性高于其他组。茜素红可以特异性地与钙基质结合，之后又可被表面活性剂CPC重新溶解^[18]。通过检测CPC溶液吸光度值，能够可靠反映钙基质沉积量。实验中，矿化液培养的各时间间期CPC定量检测显示，各实验组钙基质形成均较对照组多。其中，脐带来源组为最高，胎盘来源组次之，骨髓来源组最少。研究结果显示，脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞在调控钙基质形成方面强于骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞促进碱性磷酸酶表达。在3个共培养实验组中，骨髓来源组碱性磷酸酶水平最高，钙基质沉积量反而低于脐带来源组和胎盘来源组。提示骨髓间充质干细胞可促进并维持成骨细胞前体处于骨分化早期状态。Wen等^[3]在研究中发现在向成骨细胞分化时，骨髓间充质干细胞更易表达碱性磷酸酶，但向成骨分化后期分化时则慢于脐带间充质干细胞和脂肪干细胞。此结果与实验结果均提示骨髓间充质干细胞可能在维持成骨细胞前体的早期骨分化状态中其主要作用。

脐带间充质干细胞促进诱导的脂肪干细胞形成矿化基质。Panepucci等通过对比脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的基因表达发现，二者均基因表达相似，然而与细胞外基质形成相关基因的如Ⅰ型胶原，脐带间充质干细胞表达高于骨髓间充质干细胞^[19]。将骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞在成骨诱导培养液中培养7 d后检测与骨形成相关的基因，骨桥蛋白和Ⅰ型胶原在脐带间充质干细胞中的表达要多于骨髓间充质干细胞^[3]。骨桥蛋白是骨基质的作用组成成分参与骨形成，并在调节骨基质矿化过程中起重要作用，Ⅰ型胶原是骨基质中主要的胶原蛋白^[20-21]。以上提示脐带间充质干细胞主要是通过调节细胞外基质的形成和矿化在骨形成中起作用。在实验中，诱导的脂肪干细胞在与脐带间充质干细胞间接共培养时促进矿化基质形成较骨髓来源组高，同样提示了脐带间充质干细胞可能通过调节诱导的脂肪干细胞的细胞外基质合成及分泌调节诱导的脂肪干细胞成骨进程。

关于胎盘间充质干细胞的成骨能力尚存争议。Ulrich等研究认为胎盘间充质干细胞的成骨能力很弱，源于其表达成骨相关基因水平低于骨髓间充质干细胞，而抑制成骨分化的基因Twist2表达较高^[22]。然而，Fan等^[23]分别利用骨髓间充质干细胞和胎盘间充质干细胞修复新西兰兔的桡骨临界骨缺损，结果显示2种细胞在碱性磷酸酶无显著差异，胎盘间充质干细胞表现出与骨髓间充质干细胞相似的成骨能力。在实验中胎盘间充质干细胞主要表现了在与诱导的脂肪干细胞间接接触时可加速诱导的脂肪干细胞向成骨细胞分化，并迅速形成矿化基质。

间充质干细胞可以合成多种生物活性因子，这些因子被分泌到细胞外起介导细胞间信号传导的作用^[24]。间充质干细胞合成的多种因子在释放到培养液中后可作用于诱导的脂肪干细胞。Ando等^[25]研究间充质干细胞上清液发现，间充质干细胞上清液中存在多种因子可以促进成骨细胞的增殖分化。脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞分泌的多种因子可以促进间充质干细胞向成骨细胞分化，上调成骨相关基因，形成矿化基质，加快骨组织再生^[26-27]。当其与诱导的脂肪干细胞间接共培养时，分泌到细胞外的因子可促进诱导的脂肪干细胞分化为成骨细胞，进而形成钙化基质。迄今研究已证实，Wnt/β-catenin信号通路，MAPK信号通路，Notch信号通路等多种信号通路涉及碱性磷酸酶合成和基质矿化^[28-29]。实验结果提示，在碱性磷酸酶合成和基质矿化的过程中，不同的培养环境下，其中起主要调控作用的信号通路在这两方面可能存在一定差异。RUNX2在成骨细胞分化过程中起着重要作用,骨组织中的特异性基质蛋白在转录水平均受其调控^[30-31]。脐带间充质干细胞分泌的多种生物因子则可能通过影响和调节Notch以及其他相关的信号通路，调节与矿化相关的转录因子RUNX2等继而影响细胞基质的合成，最终使脐带来源组中诱导的脂肪干细胞产生的钙基质沉积增加。上述过程所涉及的具体机制还有待进一步研究。

综上所述，在与不同组织来源的间充质干细胞间接共培养条件下，诱导的脂肪干细胞成骨能力得到明显提高。脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞在矿化阶段对诱导的脂肪干细胞成骨能力的调节要强于骨髓间充质干细胞。然而，多种间充质干细胞与诱导的脂肪干细胞间的信号传导与调控影响在成骨细胞前体分化中的具体作用，还有待于继续研究。

Transwell共培养条件下诱导脂肪干细胞成骨能力的改变

Osteogenic efficiency of induced adipose-derived stem cells under Transwell co-cultured condition

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