兔胫骨大段完全骨缺损的解剖学模型构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
解剖学3D模型：解剖学模型是一种基于3D打印技术和个体化治疗需求，利用计算机辅助技术从结构上优化与控制制备的组织工程三维支架，其具有与骨缺损部位吻合的外形，有利于个性化的根据不同的骨缺损部位制备人工骨支架，同时也为一些结构不规则的结构部位的修复提供了可能。尤其是位于负重部位的大段骨缺损的修复和重建，不仅要求支架材料具备骨引导、骨诱导性，也要求其具备良好的生物力学支撑和结构的特性引导。
解剖型组织工程骨：实验设计的解剖型组织工程骨能良好吻合骨缺损部位，其弹性模量和抗压强度达不到缺损处胫骨的水平，但比临床常用的骨诱导人工骨弹性模量和抗压强度高出约20倍，在钢板内固定下足够保持适当的承重和局部稳定性。

摘要
背景：组织工程骨为负重部位大段骨缺损修复和重建提供了巨大潜力，目前关于组织工程骨应用研究策略主要集中于支架复合细胞或生物活性分子，而骨组织工程支架的结构化和功能化是其中最重要的研究内容之一。
目的：利用3D打印制备兔胫骨解剖型支架，建立一种简便易行解剖形状可塑的组织工程骨骨缺损模型。
方法：采用Mimic软件获得缺损骨的三维电子模型，利用熔融沉积制法备羟基磷灰石/聚己内酯解剖型支架。将 15只6月龄新西兰大白兔随机分为3组，空白组3只，对照组和实验组均6只，分别制备长1.2 cm的胫骨完全骨缺损，其中空白组缺损处旷置，对照组缺损处将截骨原位放回，实验组缺损处放置解剖型组织工程骨，并用实验设计的小钢板螺钉固定。
结果与结论：①兔胫骨测量结果：兔胫骨长(93.77±0.59) mm；胫腓交界横径(8.36±0.13) mm，矢状径(5.97±0.12) mm，骨皮质平均厚度(1.20±0.10) mm，髓腔平均直径(4.30±0.06) mm；胫骨模型侧面上下关节面中点连线与截骨模型侧面上下截面中点连线的夹角α=(5.97±0.13)°；②缺损区X射线显示：术后4，12周，实验组和对照组骨缺损处移植体未见明显移位和成角畸形，自体骨修复较好；③组织学检查：术后4周，实验组骨断端及支架内有少量新生骨填充，术后12周，重建支架内新骨生成明显增多并且部分矿化；④一般观察：术后4，12周，实验组和对照组组骨缺损处骨移植体无明显移位、成角畸形，实验组和对照组夹角(α)测量差异无显著性意义。⑤结果证实：实验采取的3D打印解剖形状可塑的组织工程骨构建的兔胫骨大段完全骨缺损模型稳定性较好，可模拟骨组织的结构和特异性指导新骨的再生和重建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-6743-1698(许国华)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 支架, 3D打印, 解剖学, 大段骨缺损, 负重骨, 生物力学, 复合材料, 胫骨

兔；国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tissue-engineered bone has been considered to be a promising candidate for the repair and reconstruction of load-bearing large segmental bone defects. Currently, the studies on the application of tissue-engineered bone mainly focus on cell-scaffold or cytokine-scaffold constructs, which have shed light upon the repair of large segmental bone defects.
OBJECTIVE: To establish simple and convenient tissue engineering of anatomically shaped tibial bone defect models using three-dimensional rapid prototyping technology to manufacture rabbit tibia biomimetic artificial bone scaffolds.
METHODS: Three-dimensional electronic models were constructed using Mimic software. Hydroxyapatite/polycaprolactone scaffolds were manufactured by fused deposition modeling equipment. Fifty rabbits aged 6 months were randomly divided into three groups: blank control (n=3), control (n=6) and experimental groups (n=6), respectively. Tibial defects ranged 1.2 cm were made in all groups. No treatment was given in blank control group. The bone defects in control and experimental groups were repaired with autogenous osteotomized bone and anatomical tissue-engineered bone, respectively, and fixed with plates and screws.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Rabbit tibial bone measurements: tibial length was (93.77±0.59) mm, tibiofibular transverse diameter (8.36±0.13) mm, sagittal diameter (5.97±0.12) mm, average thickness of bone cortex (1.20±0.10) mm, average diameter of the medullary cavity (4.30±0.06) mm. Angle between the connection line of the midpoints of superior and inferior articular surfaces at the side of tibial bone models and the connection line of the midpoints of superior and inferior intersecting surfaces at the side of osteotomized bone models was α=(5.97±0.13)°. (2) X-ray in bone defects: at postoperative 4 and 12 weeks, no obvious displacement and angulated deformity were found in bone grafts, suggesting the good bone defect repair. (3) Histological examination: at postoperative 4 weeks, bone scaffolds were filled with new bone in the experimental group. Furthermore, considerably increased new bone formation and mineralization were observed at postoperative 12 weeks. (4) General observation: no obvious displacement and angulated deformity occurred in bone defect grafts at postoperative 4 and 12 weeks. These findings suggest that rabbit anatomical models of large segmental tibial bone defects with good stability were constructed using three-dimensional prototyping technology, which may simulate the structure and function of bone tissue and be used for guiding the new bone regeneration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Anatomy, Biomechanics

中图分类号:

R318

鲍小刚，许国华. 兔胫骨大段完全骨缺损的解剖学模型构建[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(24): 3508-3515.

Bao Xiao-gang, Xu Guo-hua. Construction of rabbit anatomical three-dimensional models of large segmental tibial defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(24): 3508-3515.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析纳入新西兰大白兔15只(另有3只取材制作电子模型)，空白组3只均存活，对照组6只中有1只于术后10 d因腹泻死亡；实验组6只中有1只于术后约8 d腹泻死亡，1只于术后约24 d无明显诱因死亡；后及时补充实验组及对照组样本量恢复到6只，饲养过程无脱失者，最后15只新西兰大白兔进入结果分析。

2.2 模型创新性目前可利用成骨支架材料的研究较多，包括天然材料(同种异体骨、海藻酸盐、纤维蛋白等)，合成材料(聚己内酯和生物陶瓷等)，复合材料(聚己内酯/羟基磷灰石等)等^[14-15]，这些支架材料都有其优点和缺陷，实验更关注的是材料的复合、加工和新的复合材料的利用，课题组前期研究的聚己内酯/羟基磷灰石复合材料已被证实具有良好的生物相容性、一定的可降解性、一定的机械负荷、适宜成骨细胞和内皮细胞等黏附和增殖等^[4^，^16-18]；现拟利用成熟的3D打印技术制备结构、形状可控的组织工程骨支架，将有利于个性化的根据不同的骨缺损部位制备人工骨支架，有利于研究机械力学对负重部位骨缺损修复影响，同时也为一些结构不规则的骨缺损修复提供了可能，这种具备一定可降解性、一定机械负荷的解剖型组织工程骨支架可能更适合作为负重部位组织工程骨的研究基质^[19-20]。

2.3 模型稳定性骨科生物医用材料自二战以后至今广泛研究，但真正能用于临床负重部位骨缺损修复的支架材料还未有报道。关于负重部位大段骨缺损修复文献的报道多为部分骨缺损的材料充填式成骨研究，包括课题组前期利用聚己内酯/羟基磷灰石复合材料修复山羊胫骨部分缺损研究。Diab等^[7]利用电纺聚己内酯纳米纤维管装载骨形态发生蛋白2作为骨支架修复大鼠股骨大段完全骨缺损，但其模型对支架力学性却不做要求，并且行髓内钉和螺钉固定支架，其局部成骨作用基本靠骨形态发生蛋白2诱导成骨，其支架的意义并未体现。Liu等^[8]利用DBB作为骨支架装载骨形态发生蛋白2修复山羊胫骨大段完全骨缺损；Yasuda等^[9]利用同种异体骨装载骨形态发生蛋白2修复小鼠股骨大段完全骨缺损。目前这些研究并未考虑机械力学对负重部位骨缺损模型的重要影响，也未考虑骨支架与机体自体骨的解剖学匹配问题，其支架重建、修复过程中常出现局部畸形等缺陷，不具备广泛应用的特点^[21-24]。其次，临床因为感染、创伤、肿瘤等所致骨缺损部位、形状及大小各不一致，实验通过计算机辅助技术设计3D打印的符合样本个体化解剖特点的组织工程骨支架，是组织工程骨支架个体化发展的必然要求。一方面，实验从结构上优化与控制组织工程三维支架，具有与骨缺损部位吻合的外形，有利于个性化的根据不同的骨缺损部位制备人工骨支架，同时也为一些结构不规则的结构部位的修复提供了可能^[25-26]。

2.4 兔胫骨标本测量结果使用复旦大学高分子材料重点实验室MicroCT对3只新西兰大白兔双侧胫骨进行三维重建，得出长度(93.77±0.59) mm；胫腓交界横径(8.36±0.13) mm，矢状径(5.97±0.12) mm；骨皮质平均厚度(1.20±0.10) mm；髓腔平均直径(4.30±0.06) mm；胫骨模型侧面上下关节面中点连线与截骨模型侧面上下截面中点连线的夹角[α=(5.97±0.13)°]。根据图像结果分析出兔胫骨解剖参数，用于指导内固定安置。实验用自行设计的钢板在体外进行兔胫骨的固定，侧面和背面观可见钢板固定牢靠，长度和弧度适合兔胫骨(图2)。

2.5 解剖型组织工程骨构建及其生物力学测试见图3A-E。兔胫骨行CT扫描后，利用Mimic软件基于CT断层扫描计算机三维重建技术获得缺损骨的三维电子模型(图3B)。再对电子模型数据进行处理得到STL格式的文件，将此文件输入熔融沉积成型设备(FDM)制备解剖仿生人工骨支架(图3E)。该打印的解剖型组织工程骨抗压强度、弹性模量均接近自体骨且较临床常用的骨诱导人工骨有显著提高，具有较好的支持作用(表1)。

2.6 模型验证结果

2.6.1 一般情况各组于术后第3天均能在笼中自由活动和进食。术后切口愈合良好，无红肿、渗液等感染表现，术后10 d伤口愈合。

2.6.2 影像学评估钼靶X射线摄片显示：各组样本于术后4，12周行X射线片检查未见明显成角、移位等，且12周时缺损结合处骨端融合，新骨生成(图4)。

2.6.3 术后12周取材的大体标本、CT重建和组织学检查大体及CT观察可见2组骨端融合，自体骨修复组和解剖型组织工程骨修复组均能提供良好的支撑功能，无移位、成角畸形(表1)，前者骨修复较好，后者骨-支架界面分界清楚。组织细胞学检查：实验组可见新骨生成，术后3个月时新骨面积较第1个月明显密集且出现矿化表现(图5)。X射线检查和解剖学观察结果见图6，7。

参考文献

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年6月至2015年10月在解放军第二军医大学转化中心及动物中心完成。

1.3 材料于解放军第二军医大学动物中心购得健康6月龄新西兰大白兔18只，雌雄不限，体质量2.5-3.0 kg，普通级笼养。使用动物品种品系规格、处死动物方法等均符合动物伦理学要求。地点使用许可证号：SYXK(沪) 2012-0003，动物生产许可证号：SCXK(沪) 2012-0007。

1.4 实验方法

1.4.1 聚己内酯/羟基磷灰石复合材料的制备将羟基磷灰石(HA，Sigma，USA)和聚己内酯(PCL，相对分子质量60 000，Sigma，USA)按照30∶70的质量比预混合后，再加入到Haake(Rheocord 900，Germany)转矩流变仪中，在转速为100 r/min、温度为100 ℃条件下熔融密炼10 min直到扭矩达到平衡，获得聚己内酯/羟基磷灰石复合材料。

1.4.2 兔胫骨电子模型获取及聚己内酯/羟基磷灰石复合材料仿生解剖型组织工程骨的设计和制造随机选取3只新西兰大白兔，按照动物伦理学要求处死后获取完整左侧胫骨3只行CT(复旦大学高分子材料重点实验室SkyScan1176)扫描获取断层数据。

实验与上海交通大学Bio-M实验室合作，基于CT断层扫描图片利用Mimic软件的计算机三维重建技术获得骨缺损的三维模型。测量胫骨模型侧面上下关节面中点连线与截骨模型侧面上下截面中点连线的夹角(α)。利用该实验室的熔融沉积成型设备(FDM，Stratasys Inc.)制备聚己内酯/羟基磷灰石复合材料仿生解剖型组织工程骨，FDM的加工原理是从喷头喷出连续的聚己内酯/羟基磷灰石熔融纤维，喷头在计算机的控制下以一定的路径做平面运动，控制纤维有序的在工作平台上沉积并冷却、固化；完成一层截面后，工作平台下降一个厚度，如此再进行纤维的沉积成型，最终通过层层叠加形成最终的仿生解剖型组织工程骨。实验首先将获得的人工骨支架三维模型导入FDM软件中获得加工路径，再在100 ℃的条件下将聚己内酯/羟基磷灰石复合材料熔融，而后按照所设定的加工路径通过聚己内酯/羟基磷灰石纤维的层层叠加制备出所需的仿生解剖型组织工程骨。

1.4.3 兔胫骨和3D打印解剖型组织工程骨的弹性模量检测采用生物力学材料试验机(QX-W600，上海企想检测仪器有限公司)测定支架材料的压缩力学性能，以兔胫骨和骨诱导(BAM)人工骨作为对照。加载速度为 5 mm/min，支架材料压扁的最大压力为F(N)，根据公式P=F/A(A为受压面积)，求得抗压强度。根据公式E=σ/ε求得弹性模量(σ为应力，ε为应变)。

1.4.4 兔胫骨大段完全骨缺损解剖学模型构建新西兰大白兔15只，随机分为空白组、对照组和实验组各3，6，6只。编组后，采用戊巴比妥钠(Sigma，USA，P3761)，行耳缘静脉麻醉，按无菌手术操作规范，选择胫腓骨融合点处至胫骨下端区域实施长度约1.2 cm的胫骨完全骨缺损；空白组旷置只行钢板(天津希翼订制)固定；对照组在微锯条(上海世达五金工具钢锯条)锯下约1.2 cm的胫骨后原位放回并行钢板固定；实验组将事先备好的3D打印解剖型组织工程骨安置缺损处并行小钢板螺钉内固定，使用3.0不可吸收丝线逐层关闭伤口并用无菌纱布包扎。术前0.5 h及术后24，48，72 h应用0.24 g青霉素钠/只肌注预防感染。主要手术过程见图1。

1.4.5 影像学评估分别于术后4，12周采用X射线机行缺损处侧位摄片(55 kV，2.932 mAs，9.49 ms)检查。术后12周行microCT对骨缺损处进行重建(滤片：Al1 mm，精度：35 μm，360°扫描，步长0.7°)。

1.4.6 一般观察和组织细胞学检查观察术后12周各组胫骨解剖情况，并通过大体标本测量缺损修复部位成角畸形或移位情况。实验组于术后12周各随机选取3个标本，截取0.5 cm长标本经体积分数10%甲醛固定 2 d，自来水冲洗4 h，体积分数75%乙醇脱水2 d，85%乙醇脱水2 d，95%乙醇脱水2 d后，在冠状面以20 μm平均厚度切片并用苏木精-伊红染色，以观察新骨生长情况。

1.5 主要观察指标 ①兔胫骨标本测量结果。②术后4，12周行X射线片观察缺损区吻合情况及骨生长情况。③术后12周行CT扫描观察缺损区吻合、成骨情况及大体标本观察和夹角α测量。④术后12周行实验组组织切片苏木精-伊红染色观察新骨生成情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料用x(_)±s表示，采用重复资料测量方差分析进行多组间数据差异比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 移植体模型选择良好的骨缺损修复模型是骨组织工程研究中不可或缺的部分，是评价生物材料性能、构建策略优劣及分子细胞学作用机制的必要载体^[27]。实验查阅文献发现国内外众多关于体内研究组织工程骨支架、支架负载细胞或生物分子等修复和重建动物负重部位大段骨缺损研究常利用负重部位的部分骨缺损，缺少负重部位完整骨缺损研究，即负重部位的力量支撑由骨移植体支架承担。负重部位完全骨缺损组织工程骨研究多见于大小鼠研究，而其骨结构与人体骨结构不同^[11]；兔完全骨缺损常见于前肢尺桡骨上，干扰因素较大^[28]；鲜未见于狗、羊等大型动物^[5]。此外，实验查阅文献尚未发现兔及大动物负重部位解剖型骨移植体的设计研究，负重部位骨移植体在承受机体生物力学方面的特殊地位，而且大多数研究未注重缺损部位骨移植体的解剖吻合问题，忽略了本不该忽略的生物力学的影响^[19^，^21-23^，^26]。实验设计的解剖型组织工程骨能良好吻合骨缺损部位，其弹性模量和抗压强度达不到缺损处胫骨的水平，但比临床常用的骨诱导人工骨弹性模量和抗压强度高出约20倍，在钢板内固定下足够保持适当的承重和局部稳定性。鉴于以上几点，实验选择兔下肢单一负重骨缺损模型，并通过计算机辅助技术设计3D打印的符合样本个体化解剖特点的组织工程骨支架来重建骨缺损，使组织工程骨修复模型更完善。

3.2 缺损部位和大小选择实验选择易获取的新西兰大白兔为研究对象，利用3D打印解剖型组织工程骨构建兔胫骨下端单一负重骨缺损模型，既避免传统兔模型前臂双骨作用的影响，更突出了缺损模型的个体化和负重部位生物力学的重要性^[29-30]。临界骨缺损为机体不能自愈的最小骨缺损，在动物生命周期内愈合小于10%的骨缺损，或为其周径的2倍^[13]。实验按照直径2倍制作了兔胫骨大段完全骨缺损模型，3个月后通过X射线片以观察其自行愈合的能力，可得出1 cm长度的胫骨完全骨缺损不能通过自身的修复愈合。

3.3 模型制备要点影响骨缺损愈合的因素有很多^[31-37]，首先熟悉兔下肢肌肉和血管解剖入路，避免肌肉和血管误伤；其次，兔属于较容易感染种属，内固定物应置于肌肉较丰富的胫骨外侧，有利于提高供血或降低感染风险；牢固的内固定是保证组织工程骨支架研究的基础，骨折错位、钢板外漏、对位对线差均会直接导致内固定失败。实验在前期实验基础上改进了动物内固定钢板并采用上下各3枚和2枚螺钉固定，实验中兔未出现固定松动现象。自体骨组和实验组中各有1只于术后因腹泻死亡，考虑术后追加抗生素所致其胃肠道菌群紊乱所致。实验组中1只于术后24 d无明显诱因死亡，考虑可能是骨髓炎所致。实验术中动物创伤较大，内固定相对复杂，容易导致术后感染、腹泻或内固定失败等严重并发症，这可能是目前负重部位大段完全骨缺损模型研究较少的主要原因之一。实验术前已熟悉兔胫骨局部解剖结构，并利用设计合理的小钢板系统内固定安置，有利于降低围手术期并发症发生。

3.4 实验模型构建的意义目前各种组织工程骨支架材料都有其优点和缺陷，实验更关注的是材料的复合、加工和新的复合材料的方法。实验通过加工复合羟基磷灰石和聚己内酯两种材料制备组织工程骨支架，整合了羟基磷灰石和聚己内酯两者材料细胞生物学的优势，能更好应用于包含多种细胞修复机制的骨组织修复^[16-18，27]。实验术后1，3个月影像学和大体标本测量均显示3D打印的羟基磷灰石/聚己内酯解剖型组织工程骨和自体骨修复兔胫骨负重部位完全骨缺损模型无显著移位、成角畸形，且有着新骨生成；组织切片染色显示该3D打印的羟基磷灰石/聚己内酯解剖型组织工程骨中新骨生成，这些一定程度上说明实验构建的解剖型组织工程骨模型具有与自体骨相似的机械支撑和解剖吻合作用。术后动物并发症较少，也有效保证了此模型的稳定性，为该骨支架作为组织工程骨基质的基础研究奠定了重要意义。临床因为感染、创伤及肿瘤等所致骨缺损部位、形状、大小各不一致，而目前研究骨缺损修复模型多集中于支架的填塞模式，尤其是忽视了负重部位组织工程骨修复时生物力学的影响^[25-26]。实验是组织工程骨支架个体化发展的必然要求，实验通过计算机辅助技术设计3D打印的符合样本个体化解剖特点的组织工程骨支架，一方面，实验从结构上优化与控制组织工程三维支架，具有与骨缺损部位吻合的外形，有利于个性化的根据不同的骨缺损部位制备人工骨支架，同时也为一些结构不规则的结构部位的修复提供了可能。另一方面，实验将各具特点的生物材料组合起来，有利于不同细胞能够在不同的生物材料上黏附、增殖和分化，为进一步组织修复研究奠定基础^{[4，16-18，27]}。但是，实验兔胫骨完全骨缺损解剖型模型构建的样本量较少，缺少横向对照研究；其次，实验对手术者经验要求较高，可能在更大型动物(如犬、羊等)体内操作更接近临床实践并减少偶然误差。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程