白芨胶载外源性重组人表皮生长因子促进伤口愈合机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.011

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (20): 2964-2971.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.011

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白芨胶载外源性重组人表皮生长因子促进伤口愈合机制

王晓，崔平，吴冉，王蓓，仇树林

河北省人民医院医疗美容科，河北省石家庄市 050051

收稿日期:2016-03-16 出版日期:2016-05-13 发布日期:2016-05-13
通讯作者: 仇树林，主任医师，河北省人民医院医疗美容科，河北省石家庄市 050051
作者简介:王晓，女，1980年生，汉族，河北省衡水市人，主治医师，硕士。
基金资助:
河北省科学技术研究与发展指导计划(062761220)

Mechanisms underlying the promotion of wound healing by bletilla carrying exogenous recombinant human epidermal growth factor

Wang Xiao, Cui Ping, Wu Ran, Wang Bei, Qiu Shu-lin

Department of Medical Cosmetology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Received:2016-03-16 Online:2016-05-13 Published:2016-05-13
Contact: Qiu Shu-lin, Chief physician, Department of Medical Cosmetology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
About author:Wang Xiao, Master, Attending physician, Department of Medical Cosmetology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
Supported by:
the Key Science and Technology Program of Hebei Province, China, No. 062761220

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
白芨：为多年生草本球根植物(块根)。白芨有广泛的药用价值，主要用于收敛止血，消肿生肌。
重组人表皮生长因子：是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是类表皮生长因子大家族的一个成员，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。

摘要
背景：如何促进难愈性创面愈合是所有外科医生研究的重点问题，重组人表皮生长因子可有效促进创面愈合，但其作为一种生物制剂，常温下极易被分解。
目的：探讨中药白芨胶作为重组人表皮生长因子的载体促进兔背部伤口愈合的机制。
方法：建立兔背部皮肤全层缺损创伤模型，用白芨胶和重组人表皮生长因子联合干预治疗，设为联合治疗组，并设白芨胶组、重组人表皮生长因子组及对照组作对照。
结果与结论：①创面愈合情况：4组中联合治疗组创面愈合时间最短(P < 0.05)，创面愈合率最大(P < 0.05)。②组织学变化：术后第3，10天，苏木精-伊红染色和Masson染色显示，联合治疗组可明显发现创面新生肉芽组织、毛细血管和胶原纤维形成。③血管内皮生长因子表达：术后第3，10天免疫组化染色显示，联合治疗组血管内皮生长因子表达在各组中最强(P < 0.05)。④结果证实，白芨胶载外源性重组人表皮生长因子通过促进肉芽组织、新生毛细血管和胶原纤维的生成促进伤口愈合，效果显著，优于两者单独应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2958-3612(仇树林)

关键词: 组织构建, 组织工程, 白芨胶, 人表皮生长因子, 创面愈合, 免疫组织化学, 肉芽组织, 胶原纤维, 新生毛细血管, 血管内皮生长因子

Abstract:

BACKGROUND: How to promote wound healing is always the research focus of the surgical physicians in the clinic. Recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) can effectively promote wound healing. However, as a biological agent, it is easy to be decomposed under normal temperature.
OBJECTIVE: To explore the mechanisms underlying the promotion of wound healing in the back of rabbits by bletilla carrying exogenous rhEGF.
METHODS: Model rabbits with full-thickness skin defects in the back were treated with bletilla carrying exogenous rhEGF (combined treatment group), bletilla, rhEGF, or saline (control group).
RESULTS AND CONCLUSION: The time of wound healing was the shortest (P < 0.05) and the wound healing rate was the highest (P < 0.05) in the combined treatment group. On postoperative days 3 and 10, newly formed granulation tissue, capillaries, and collagenous fibers showed by hematoxylin-eosin staining staining and Masson staining and the strongest immunoreactivity of vascular endothelial growth factor determined by immunohistochemical staining were found in the combined treatment group (P < 0.05). These findings confirm that bletilla carrying exogenous rhEGF promotes wound healing by accelerating the forming of granulation tissue, new-born capillaries, and collagenous fibers, and the effects are superior to either of them alone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Granulation Tissue, Epidermal Growth Factor, Vascular Endothelial Growth Factors

中图分类号:

R318

王晓，崔平，吴冉，王蓓，仇树林. 白芨胶载外源性重组人表皮生长因子促进伤口愈合机制[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(20): 2964-2971.

Wang Xiao, Cui Ping, Wu Ran, Wang Bei, Qiu Shu-lin. Mechanisms underlying the promotion of wound healing by bletilla carrying exogenous recombinant human epidermal growth factor[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(20): 2964-2971.

图/表（结果） 3

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引言

不同原因造成的皮肤创面是外科临床工作中最常见的病症，是众多临床医生研究的重点问题之一。创面愈合是多种细胞、细胞外基质及细胞因子等共同参与并高度协调、调控的复杂生物学过程。创面愈合大致可分为4个渐次发生而又相互重叠的过程，即止血、炎症反应、增殖和重塑^[1]，不同细胞和细胞因子、炎症递质参与了创面愈合的各个过程^[2-3]。如表皮生长因子可促进细胞增殖；转化生长因子β可抑制蛋白酶活性、促进蛋白酶抑制剂的表达、诱导其他细胞因子(如血小板源性生长因子、结缔组织生长因子等)的表达等^[4]。这些研究成果为临床应用细胞或细胞因子来处理创面提供了理论依据。

国际上通常将正规治疗周期超过1个月未愈合的创面定义为慢性创面^[5-6]，在临床上，慢性难愈性创面发生率高，治疗难度大、周期长、费用高，是困扰所有外科医生亟待解决的难点问题之一。慢性创面难以愈合的重要原因之一是因为创面局部缺乏必需的生长因子^[7]。人们一直在为治疗难愈性创面寻找有效的治疗方法而不断努力。近年来，随着生物分子技术和材料技术等的发展，一些细胞因子可体外提纯，生物制剂和新型医用敷料层出不穷。脂肪干细胞和富血小板血浆是近些年研究的热点。脂肪干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中获取的多能干细胞^[8]，具有促进上皮化、肉芽组织形成、血管重建等功能^[9]，被应用于皮肤缺损、慢性溃疡、糖尿病足等创面，均取得了满意的临床效果^[10-13]。富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)促进慢性创面愈合的效果优于传统治疗^[14-15]。但两者的提取较为复杂，很难满足临床上使用便捷的要求。新型医用敷料能加速创面修复，减少伤口感染，提高治愈率^[16-19]，但不同的伤口特点对敷料有不同的要求，新型敷料性能单一、缺乏复合治疗功能，单独使用难以满足伤口复杂的生理需要及有效地促进创面愈合，且价格高，市场普及比较慢^[20]。上述材料和细胞均存在自身的局限性，无法在临床进一步推广应用。

中国中药资源丰富，很多中草药具有抗菌消肿、止血止痛、去腐生肌等作用，外用于伤口对改善伤口微环境、促进伤口愈合起着积极的作用。为了发挥中药外治的独有功效，众多学者在载中药敷料的研制上也进行了很多的研究^[21-22]，但是大多数的载中药新型敷料由于中药成分复杂，有效成分定量、定性困难，作用机制复杂，质量难以控制，很难在临床推广应用。随着现代医学科学技术的发展，中药促进创面愈合的机制逐渐被明确。经研究发现中药在创面愈合过程中可促进肉芽组织形成、增加胶原纤维产生、调节创面免疫功能、促进创面生长因子如表皮生长因子、血管内皮生长因子等的表达等作用^[23-24]。白芨为兰科多年生草本植物白芨的干燥块茎，具有收敛止血、消肿生肌的功能，可用于外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等^[25-27]。白芨主要化学成分为联卞类、二氢菲类、联菲类及其衍生物、多糖、淀粉、葡萄糖等^[28]。彭锐等^[29]研究发现白芨加水搅拌后为凝胶状，涂抹于大鼠背部全层皮肤缺损创面，能显著促进创面肉芽组织、毛细血管生长及创面组织血管内皮生长因子的高表达。王红英^[30]研究发现白芨具有抗炎、镇痛作用。悦随士等^[31]研究发现白芨具有显著的止血功效。综上所述，白芨既可以显著促进创面愈合，又可以作为理想的载体。

表皮生长因子是一种可促进细胞增殖分化的肽类生长因子，以表皮细胞表达最为丰富。表皮生长因子在创伤愈合过程中可显著促进上皮细胞、成纤维细胞等增殖、分化和迁移，从而促进新生肉芽组织形成和伤口的再上皮化^[32-34]，在各种创面治疗中，显示出良好地促修复作用^[35-40]。随着基因技术的发展，重组表皮生长因子产品已广泛应用于各种急慢性皮肤溃疡及皮肤创伤治疗，可显著加快创面愈合速度^[41]。重组人表皮生长因子就是利用基因重组技术制备的外源性人类表皮生长因子，其结构和生物学活性与人体内源性表皮生长因子高度一致。临床研究表明，重组人表皮生长因子可启动创面修复过程，具有促进上皮组织再生、加速创面愈合作用；加速纤维细胞大量繁殖和胶原纤维沉积，增强创面抗张能力^[42-44]。但在创面愈合过程中，表皮生长因子的数量难以满足组织自身修复的需要，外源性重组人表皮生长因子的补充一方面可促进内源性表皮生长因子的表达，另一方面，也可以补充创面内源性表皮生长因子的相对不足，从而加速创面的愈合。因此，补充同种外源性表皮生长因子，可以最大限度地发挥表皮生长因子自身的生物学作用，加速创面愈合^[45]。但重组人表皮生长因子作为一种生物制剂，常温状态下极易被分解，功效难以被充分发挥。罗江孝等^[46]用自制中药油纱条辅助配合重组人表皮生长因子治疗慢性体表溃疡，能够加快创面愈合速度，提高创面愈合质量，且对创面无刺激，说明中药对重组人表皮生长因子的活性无影响。马培耕等^[47]学者将白芨与高分子神经生长因子联合应用于压疮患者，临床效果显著，白芨作为一种载体不影响高分子神经生长因子的生物活性，且延长了其与创面作用时间，使二者的功效都能充分发挥。

实验选择本身具有抗炎止血、促进创面愈合作用的白芨胶作为重组人表皮生长因子的载体，二者联合用药，使其生物学作用充分发挥，为临床治疗创面尤其是难愈性创面的促愈提供一种新的治疗方法；为减缓生长因子分解速率，延长其在创面的作用时间提供一种新的用药方式；目前生长因子尚缺乏合适的外用载体，将白芨胶作为重组人表皮生长因子的载体为生物制药提供一种新思路；中药是中国医学史上的瑰宝，中药外用由来已久，但因用药种类复杂，用药剂量不准确等问题，长久以来不能得到国际认可。实验使用的白芨胶，其干粉可高压消毒以保证用药的无菌性，单一用药其用药剂量可准确掌握，克服了上述弊端，为临床中药外用提供新的用药方式，为中药与生物分子技术结合开创了新局面。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2012年1月至2015年10月在河北省人民医院临研中心完成。

1.3 材料

实验动物：选择健康成年新西兰大白兔40只，雌雄各半，体质量2.5-3.0 kg，来自河北省人民医院临研中心，动物许可证号：XYXK(冀)2015-0065。单笼喂养，适应环境饲养1周。

药物：白芨购自湖南省衡阳市森本生态农业科技有限公司。重组人表皮生长因子购自广东省深圳市华元基因工程发展有限公司，5 mL/支，2 000 U/mL。

白芨胶的制备：将10 g白芨干粉加入100 mL蒸馏水中^[47]，搅拌均匀，制成黏稠胶状物，高压消毒备用。

白芨胶和重组人表皮生长因子的制备：在严格无菌操作下，将5 mL无菌生理盐水稀释成700 U/mL^[48]，在严格无菌操作下，取白芨胶10 g，加入重组人表皮生长因子液体混匀即可^[49]。

1.4 实验方法

1.4.1 兔背部皮肤全层缺损创伤模型的构建清洁级新西兰大白兔40只单笼喂养，参照以往文献方法^[50-52]，构建兔背部皮肤全层缺损创伤模型。术前禁食12 h。术前1 d用体积分数8%硫化钠将兔背部脱毛，暴露15 cm×10 cm的皮肤，手术时兔腹腔内注射体积分数2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，碘酒、乙醇消毒，铺无菌手术巾，避开肩胛骨和髂骨，用特制打孔器在距脊柱2.0 cm的双侧制作圆形创面各3个，面积约3.14 cm²，创面边缘之间间隔约2.0 cm，切除创面全层皮肤至深筋膜^[53]。根据以往文献所用方法切除皮肤全层至深筋膜^[54-56]，即创伤造模成功。

1.4.2 分组及干预将兔40只随机分为4组，即联合治疗组、重组人表皮生长因子组、白芨胶组和对照组，每组10只。联合治疗组：术毕即刻给予白芨胶和重组人表皮生长因子涂抹创面，无菌敷料包扎固定；重组人表皮生长因子组：术毕即刻创面喷重组人表皮生长因子液，平均用量按150 U/cm²创面面积计算^[48^，^57]，无菌敷料包扎固定；白芨胶组：术毕即刻创面外涂白芨胶，无菌敷料包扎固定；对照组：术毕即刻用生理盐水冲洗创面，无菌敷料包扎固定。每日换药1次，方法和剂量相同，直至创面愈合。

1.5 主要观察指标

1.5.1 一般情况观察术后动物单笼饲养，观察创面愈合、创面与周边皮肤的关系等情况^[58]。

1.5.2 创面愈合时间测量创面愈合标准以创面面积小于总面积的5%或愈合面积大于95%为完全愈合^[59]。

1.5.3 创面愈合率测量于术后第3，10天，用0.25 cm× 0.25 cm的透明方格纸测量创面面积，用德国产ASM- 68K半自动图象分析仪计算创面面积，创面愈合率=[(原创面面积-测量创面面积)/原创面面积]×100%^[60]。

1.5.4 组织学观察术后第3，10天，每组各取6个创面新生皮肤及周围部分正常皮肤组织，经体积分数10%中性甲醛溶液固定，常规固定，脱水、石蜡包埋，5 μm连续切片，行苏木精-伊红染色和Masson染色，光镜观察皮肤组织中新生肉芽组织、毛细血管和胶原纤维生成情况。

1.5.5 免疫组织化学染色观察术后第3，10天每组6个创面同上法取材，行新生上皮细胞的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫组织化学染色，按照血管内皮生长因子免疫组化试剂盒(美国Neowmarker公司)采用SABC法进行操作。将皮肤标本制作冰冻切片，40 g/L多聚甲醛固定30 min，体积分数0.3%H₂O₂甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗 5 min，3次，用血清封闭抗原20 min，滤纸吸去多余的液体，滴加浓度为1∶200的血管内皮生长因子兔抗兔抗体溶液，4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，3次，滴加经过生物素标记的1∶200羊抗兔二抗50 μL/片，室温下孵育30 min，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，共3次，滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液(S-P)50 μL/片，孵育30 min，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，共3次，DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)显色，每个标本中均加入DAB溶液，显微镜下观察，显色满意无背景，即用自来水冲洗终止反应。

苏木精复染，盐酸乙酸分化，脱水，二甲苯透明，树胶封固，观察血管内皮生长因子在新生上皮细胞中的分布^[58]。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件包对数据进行分析，数据以x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用单因素方差分析和q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

创伤愈合是由多种细胞和组织成分参与的生物学过程，生长因子参与创伤愈合的全部过程^[62]。

实验结果显示，白芨胶和重组人表皮生长因子能显著促进创面愈合，缩短创面愈合时间，两者联合用药效果优于单用白芨胶和单用重组人表皮生长因子。白芨胶和重组人表皮生长因子联合用药能显著促进新生肉芽组织、新生毛细血管的生成。肉芽组织在创面愈合过程中扮演着重要的角色，对创面修复起保护作用。早期的肉芽组织基质较多，伴有炎性细胞渗出及少量新生毛细血管，炎性细胞以巨噬细胞为主，巨噬细胞可分泌多种炎性介质，进一步刺激纤维母细胞及毛细血管增生，加速创面愈合。实验于术后第3天取材制作组织切片经苏木精-伊红染色，光镜观察发现，白芨胶和重组人表皮生长因子较其他3组更能显著促进巨噬细胞渗出和新生毛细血管的形成。中后期的肉芽组织以胶原纤维和毛细血管为主，是创面重塑的时期。术后第10天取材制作组织切片经苏木精-伊红染色发现：联合治疗组成纤维细胞和新生毛细血管数量最多。由此可见，白芨胶和重组人表皮生长因子作用于创面愈合的全部过程，可显著促进炎性细胞、新生毛细血管和胶原纤维的渗出和形成，有利于预防创面感染和创面重塑，加速创面愈合，这可能是其促愈机制之一。

白芨胶和重组人表皮生长因子联合用药能显著促进胶原纤维的形成。胶原是细胞外基质的基本结构，除了对组织提供支持和张力外，还能对细胞施加多种影响^[63-64]，胶原纤维的含量决定了创面愈合后组织的弹性。术后第3，10天取材，经Masson染色后发现联合治疗组的胶原纤维排列与其他3组相比最密集，说明其能显著促进胶原纤维的形成，增强创面新生组织的抗张能力，提高创面愈合的质量，两者联合用药促进胶原纤维生成的效果优于单用白芨胶和单用重组人表皮生长因子，这既是白芨胶和重组人表皮生长因子促进创面愈合的机制之一，也是其优势所在。

白芨胶和重组人表皮生长因子2者联合用药能显著促进血管内皮生长因子的合成，从而促进新生毛细血管的形成。良好的局部血液循环，既能保证创面所需要营养和氧分,也有利于坏死物质吸收、运输并预防控制局部感染。血管新生是创面愈合的必要条件。血管内皮生长因子又称血管通透因子，是一种可特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，既能促使微血管内皮细胞增殖、迁移，又能增加微血管的通透性，使血液中的大分子物质进入细胞外基质中，形成纤维蛋白凝胶等，有利于新生血管和基质细胞生长^[65]。实验于术后第3，10天取材，免疫组织化学染色发现联合治疗组血管内皮生长因子阳性细胞灰度在4组中最大。说明白芨胶和重组人表皮生长因子能显著促进细胞合成血管内皮生长因子，从而促进新生毛细血管的形成，为创面局部的细胞生长提供养分，改善创面局部的血液循环不畅，加速创面愈合，这也是其促愈机制之一。两者联合用药促进新生毛细血管形成的作用优于单用白芨胶和单用重组人表皮生长因子。

综上所述，白芨胶和重组人表皮生长因子作用于创面愈合的全部过程，可显著促进炎性细胞渗出、新生毛细血管和胶原纤维的形成，缩短创面愈合时间，提高创面愈合质量。白芨胶本身具有收敛止血，去腐生肌的功效，将白芨胶作为重组人表皮生长因子的载体，可延长重组人表皮生长因子的作用时间，弥补重组人表皮生长因子易分解的弊端，为临床治疗创面愈合提供新的治疗方法，为生物制药提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

白芨胶载外源性重组人表皮生长因子促进伤口愈合机制

Mechanisms underlying the promotion of wound healing by bletilla carrying exogenous recombinant human epidermal growth factor

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