3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的实验研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.017

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (16): 2405-2411.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.017

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3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的实验研究

臧晓龙，孙健，李亚莉，陈立强，杨学财，梁立卿，杜国庆

青岛大学附属医院口腔颌面外科，山东省青岛市 266003

收稿日期:2016-03-09 出版日期:2016-04-15 发布日期:2016-04-15
通讯作者: 健，博士，教授，主任医师，硕士生导师，青岛大学附属医院口腔颌面外科，山东省青岛市 266003
作者简介:臧晓龙，男，1988年生，山东省青岛市人，汉族，青岛大学口腔医学院在读硕士，主要从事正颌外科与组织工程骨方面的研究。
基金资助:
山东省自然科学基金项目(ZR2012HM069)

3D-bioprinting manufacturing polylactic-co-glycolic acid/nano-hydroxyapatite scaffold/bone morphogenetic protein-2 sustained release composite

Zang Xiao-long, Sun Jian, Li Ya-li, Chen Li-qiang, Yang Xue-cai, Liang Li-qing, Du Guo-qing

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Received:2016-03-09 Online:2016-04-15 Published:2016-04-15
Contact: Sun Jian, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Zang Xiao-long, Studying for master’s degree, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2012HM069

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

3D生物打印：该技术可以有效保持生物活性因子活性。利用3D生物打印快速成型技术一次性构造具有生物活性的构造块用以制造活体组织。实验采用打印机具有2个喷头2个墨盒，工作行走速度4 mm/min，可依据实验要求调整温度及喷出速度等相关参数，目的是一体化构建组织工程骨及保持其内细胞或生物活性因子的活性。

聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架(PLGA/nHA)：聚乳酸羟基乙酸(PLGA)和纳米级羟基磷灰(nHA)石均有良好生物相容性，PLGA体内经三羧酸循环降解产物为二氧化碳和水，无细胞毒性。实验利用PLGA无毒可降解及良好的亲水性和nHA良好的骨诱导活性及机械性能制得高分子材料/生物陶瓷复合材料，此复合材料既因羟基磷灰石的加入获取了良好的机械性能，经3D打印机塑形后抗压强度达(4.86±0.43) MPa，又因其的加入减缓了PLGA的降解速度，为骨再生及修复提供了时间保障。

背景：3D生物打印技术制备的工程骨支架，其形态、结构可控性好，但对组织工程骨细胞生长因子复合体的构建及缓释细胞因子的时效、量效特点有待进一步研究。

目的：应用3D生物打印技术制备聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体，检测聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架的生物学性能和负载细胞因子缓释复合体的性能，探讨其作为组织工程骨支架复合体的可行性。

方法：用壳聚糖和β-甘油磷酸钠制备温敏型壳聚糖水凝胶，负载骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米球形成缓释复合载体，3D生物打印制备聚乳酸羟基乙酸/纳米磷灰石壳聚糖纳米骨形态发生蛋白2细胞因子缓释复合体，体外实验检测其生物学特性及缓释骨形态发生蛋白2的时效、量效特点。

结果与结论：3D生物打印技术制备的聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架材料平均孔径(431.31±1 8.40) μm，孔隙率为(73.64±1.82)%。聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石复合体48 h内和第30天内蛋白累计释放率均符合生理状态缓释要求，有效控制了聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石缓释复合体的突释效应，缓释效果符合生物学要求。说明3D生物打印制备的聚乳酸羟基乙酸/纳米磷灰石壳聚糖纳米骨形态发生蛋白2细胞因子缓释复合体其孔隙率、孔径、缓释性能、降解速率、机械强度等指标，均符合构建组织工程骨的生物学要求。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
ORCID: 0000-0003-0926-5235(孙健)

关键词: 生物材料, 缓释材料, 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石, 3D生物打印技术, 缓释载体, 支架, 壳聚糖, 水凝胶, 纳米球, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tissue-engineered bone scaffold fabricated by 3D-bioprinting technique has good controllability in morphology and structure. However, construction of tissue-engineered bone/cell growth factor complex and time-dose effect of sustained-release factors are needed to be further researched.
OBJECTIVE: To fabricate a sustained-release composite of polylactic-co-glycolic acid (PLGA)/nano-hydroxyapatite (n-HA) scaffold carrying bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) using 3D-bioprinting technique, and test the biological properties of the PLGA/n-HA scaffold carrying BMP-2 and the sustained-release properties, thereby to discuss its feasibility as the tissue-engineered bone scaffold composite.
METHODS: Temperature-sensitive chitosan hydrogel was prepared using chitosan and β-glycerophosphate to construct a sustained-release composite, chitosan nanoparticles carrying BMP-2 . 3D-bioprinting technique was utilized to fabricate the PLGA/n-HA scaffold carrying BMP-2. Biological features of the scaffold composite were tested, and time-dose effect of BMP-2 sustained-release was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The average pore size of the scaffold-cytokine composite was (431.31±18.40) μm, and the porosity was (73.64±1.82)%. The cumulative release rate of BMP-2 from the scaffold-cytokine composite that effectively controlled the burst release during 48 hours and 30 days were suitable for the physiological needs. In conclusion, the porosity, pore size, release property, degradation rate, and mechanical strength of the scaffold-cytokine composite all meet the biological requirements of tissue-engineered bone construction.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Lactid Acid, Bone Morphogenetic Proteins, Tissue Engineering

臧晓龙，孙健，李亚莉，陈立强，杨学财，梁立卿，杜国庆. 3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的实验研究[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(16): 2405-2411.

Zang Xiao-long, Sun Jian, Li Ya-li, Chen Li-qiang, Yang Xue-cai, Liang Li-qing, Du Guo-qing. 3D-bioprinting manufacturing polylactic-co-glycolic acid/nano-hydroxyapatite scaffold/bone morphogenetic protein-2 sustained release composite[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(16): 2405-2411.

图/表（结果） 7

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引言

理想的组织工程支架复合体应需具备良好的仿生结构、生物相容性、细胞因子缓释效能、机械强度和降解速率等生物学特性^[1]。利用生物多孔材料作为支架载体加载不同的生长因子构建组织工程骨，以期达到对骨缺损的修复重建，是近年来研究的热点。3D生物打印技术的出现，为构建仿生组织工程骨的构建提供了一种新的技术手段。3D生物打印区别于以往的构建方法^[1]，其利用计算机辅助设计可以对缺损骨形态实现个性化制作^[2]，同时其内部三维结构也可以达到近似仿生结构，使得组织工程骨的仿构建又向前迈进了一步^[3-5]。以往的研究已证实聚乳酸羟基乙酸/纳米磷灰石(polylactic-co- glycolicacid/Nano-hydroxyapatite，PLGA/nHA)具有良好的生物相容性，无毒可降解性和优良的力学性能。此支架既因为羟基磷灰石的加入满足了组织工程骨机械性能要求，也可因其的加入使得PLGA降解减缓，为骨再生及修复提供了时间保障^[6]。但其降解产酸可引起移植区无菌性炎症导致植入的失败^[7-8]。考虑到上述因素，实验中骨形态发生蛋白2缓释复合体pH值介于7.2-7.6，可中和PLGA降解产生的酸，也可以保护其负载的骨形态发生蛋白2不受酸的影响。

作者在以往对于PLGA/nHA构建组织工程骨支架、壳聚糖纳米球细胞因子缓释载体等系列研究的基础上发现在制备PLGA/nHA支架过程中孔径变异较大，介于100-300 μm之间，抗力形差导致机械性能不尽人意，难以符合组织工程骨的力学要求^[9-10]。骨形态发生蛋白2作为成骨最重要的细胞因子之一，具有强烈的异位诱导成骨特性^[11-15]。以往实验对改良乳化交联法制作的骨形态发生蛋白2缓释载体已进行了时效、量效关系研究^[9]，发现纳米缓释载体的缓释效果与壳聚糖浓度及交联剂和壳聚糖的比例呈现一定关系，但其缓释效果并不能令人满意。为了克服上述困难，作者拟探索用3D生物打印技术构建仿生个体化组织工程骨细胞因子支架复合体的可行性。

实验采用3D生物打印技术制作PLGA/nHA骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米缓释载体复合体，体外实验检测其生物学性能和机械性能，同时检测支架复合体中骨形态发生蛋白2的仿生释放的时效、量效特点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料学研究。

1.2 时间及地点实验于2015年2至10月在中国海洋大学中心实验室完成。

1.3 材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)购自济南贷罡生物有限公司，其中丙交酯、乙交酯比例为75∶25；纳米级羟基磷灰石(nHA)购自美国sigma公司，直径< 200 nm；壳聚糖购自上海蓝季科技发展有限公司，其脱乙酰度> 90.0%。

1.4 方法

1.4.1 骨形态发生蛋白2纳米球及骨形态发生蛋白2缓释复合体的制备人重组骨形态发生蛋白2购自美国Peprotech公司。实验采用离子交联法制备负载骨形态发生蛋白2的壳聚糖纳米球，即首先制备2.5 g/L壳聚糖乙酸溶液，用1 mol/L NaOH溶液调节pH至5.5，然后将10 μg/L骨形态发生蛋白2溶入到壳聚糖乙酸溶液中，三聚磷酸钠溶液(1 g/L)滴加入载有骨形态发生蛋白2的壳聚糖溶液中，置于高速离心机内(4 ℃，15 000 r/min)离心30 min，离心物于磷酸盐缓冲液中(PBS，pH=7.4)透析3次，所得即为负载骨形态发生蛋白2的壳聚糖纳米球；采用560 g/L β-甘油磷酸钠作为交联剂，将20 mg 骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米球加入20 g/L壳聚糖乙酸溶液中溶液中震荡溶解，560 g/L β-甘油磷酸钠溶液逐渐滴加入混合溶液中，置入37 ℃恒温水浴锅内约15 min，完成细胞因子缓释系统的制备。

1.4.2 3D生物打印PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体按PLGA∶nHA=4∶1加入1，4-二氧六环溶液(上海源叶生物有限公司)中，37 ℃搅拌溶解后冻干。将冻干材料装入3D生物打印机(青岛尤尼科技有限公司，organisms 2500 X)A桶内，并将温度调整至 130 ℃，将PLGA/nHA冻干材料熔融；将骨形态发生蛋白2纳米球缓释系统装入温度为4 ℃的B桶，保持B桶内温度，3D生物打印机采用机械式直推，打印喷头直径约300 µm，层厚200 μm，推料速度2.7 mm/s，打印速度 4 mm/min，复合体经电脑辅助设计成形，由打印机按预设参数在4 ℃恒温超净台内分层打印成形，制得PLGA/nHA支架-骨形态发生蛋白2细胞因子缓释复合体(图1)。

1.4.3 PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体形态观察及体外降解实验取6个边长为10 mm的正方体支架，利用介质浸泡法计算支架孔隙率；扫描电子显微镜(JEOL JSM-840)下观察支架表面形态和内部结构；利用B1-223A生物光学显微镜(麦克奥迪，香港)测量孔径大小；利用万能实验机(岛津AGS-J，日本)进行力学性能测定，支架断裂时强度对应着其所能承受的最大压应力；将6个支架放入37 ℃含溶菌酶(Amresco，美国)的PBS(pH=7.4)溶液内，16周内不定时测定溶液pH值变化；将PLGA/nHA支架取出后冻干，计算质量损失率Rm(%)=(m₀-m_t)/m₀×100%和体积损失率Rv(%)= (V₀-V_t)/V₀×100%。体积保有率=1-体积损失率(Rv)。V₀，m₀分别为支架原始体积及质量，V_t，m_t分别为各观察点的支架体积及质量。

1.4.4 骨形态发生蛋白2缓释复合体体外蛋白缓释实验离子交联法制备的骨形态发生蛋白2纳米球作为实验对照组^[9]，将20 mg骨形态发生蛋白2纳米球和含20 mg骨形态发生蛋白2纳米球的PLGA/nHA细胞因子缓释复合体各6个放入37 ℃ PBS(pH＝7.4)溶液中，分别于1，3，6，12，24，48，72 h及之后每间隔3 d(终点为30 d)取出2组试管，利用ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)检测并绘制释放曲线。

1.5 主要观察指标 ①PLGA/nHA支架的孔隙率。②支架的孔径。③支架的机械强度。④体外降解实验。⑤PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的体外蛋白缓释效果。

1.6 统计学分析数值以x(_)±s表示，实验数据分析采用单因素方差分析，使用SPSS 22.0统计学软件进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

组织工程骨的发展为人类骨组织缺损的修复重建带来了全新的希望，3D生物打印技术区别于以往传统的组织工程骨的构建方法，利用电脑进行辅助设计3D生物打印制作的仿生组织工程骨结构更加近似生物骨结构，并可进行个体化定制^[17]。国外学者有利用此项技术在-20 ℃制作出了PLGA和磷酸三钙的支架支架，并在骨诱导方面取得了良好的效果^[18]。但此项技术目前对于组织工程骨细胞生长因子缓释复合体的构建研究甚少，本实验采用3D生物打印技术进行了组织工程骨支架-细胞因子缓释复合体的一体化构建。

Liao等^[19-20]的研究指出理想的组织工程骨支架孔径应介于100-500 μm，过小和过大的空隙均不利于细胞的攀附和血管化的形成。此次实验使用电脑辅助设计，3D打印技术成形的PLGA/nHA支架保证了其多孔状结构，表面形态整齐，孔径规整均匀，连通性好，经检测其平均孔径(431.31±18.40)μm，孔隙率(73.64±1.82)%，抗压缩强度达(4.86±0.43)MPa，这与上述学者的研究结果相近，机械性能达到松质骨强度^[21]，机械强度的增强一方面与羟基磷灰石的加入有关，另一方面是由于其形状增加了支架整体的抗力形，满足组织工程骨支架要求。

生理状态下骨的再生和修复一般在3-6个月内完成，因此组织工程骨复合体的降解速度应与之相匹配。实验4个月的观察期内支架的体积、质量损失率分别为54.67%和45.58%，降解速率与新骨再生的速率较为协调。这一结果的出现可能与选材和材料的配比有关。在以往PLGA/nHA材料的研究发现，nHA比例在20%-30%时，其材料的抗压强度增强，降解时间延长。而nHA比例进一步增加(40%)，反而影响了高分子的结合能力，性能随之降低；LA/GA比例为75/25的PLGA材料降解时间为4.0-5.0个月^[22-23]，更符合骨再生时间。基于以上数据分析，实验支架材料采用nHA比例为25%，LA/GA为75/25的PLGA组合更为理想，设计的材料配比选用更加符合仿生学标准，实验结果证明其基本达到骨的生成速率与降解速率的匹配。

实验采用3D生物打印技术制作PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体构建组织工程骨模式，骨形态发生蛋白2做为成骨细胞因子，保证骨形态发生蛋白2的活性是成骨的关键。但支架材降解产酸及打印过程中温度过高都会不同程度影响骨形态发生蛋白2的活性^[24]。考虑到上述因素的影响，此次实验PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体打印的全过程均是在4 ℃的恒温超净台内完成，打印程序采用交替逐层打印，虽然支架材料温度较高，但其与缓释系统仅为点接触，热量传递有限，对其活性影响甚微。实验中骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米球包裹于壳聚糖水凝胶微孔内部，水凝胶起到一定阻隔和保护作用，又可缓冲支架降解过程中产生的酸，也保证了骨形态发生蛋白2的活性。

载体系统应模拟生理成骨状态下成骨细胞生长因子的时效、量效特点，使支架复合体中的成骨细胞生长因子缓慢释放，以实现对其最大程度的利用，避免不利于成骨的负反馈效应的出现。在以往的研究报道中，其支架载体材料和结构单一，细胞因子突释效应明显，缓释效果不理想，导致了局部目的药物浓度过高^[9^，^25]，产生了成骨的负反馈效应，抑制了成骨作用。实验中PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体48 h累计释放率仅为(9.54±0.86)%，释放初期突释效应被很好地抑制。这是因为骨形态发生蛋白2纳米球及其表面游离的生长因子包裹于壳聚糖水凝胶内，延缓了其在释放介质中的扩散。第330天时，实验组释放率为11.36%- 67.86%，释放速率开始缓慢上升，是由于外层壳聚糖水凝胶缓慢降解，由外及里的将骨形态发生蛋白2纳米球释放于介质中，这种过程缓慢且均一，释放出的纳米球再次降解实现了骨形态发生蛋白2的二次缓释，由于两层缓释系统的协同作用使得骨形态发生蛋白2的释放过程趋于稳定。随着实验的进行，缓释系统降解殆尽，其释放速率相应的减缓，最后释放曲线出现平台期。实验设计制作的缓释复合体符合双相分布的特点^[26]，缓释效果使得成骨得以延续^[27]。

综上所述，实验利用3D生物打印技术制作的PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体符合组织工程骨的基本要求，其形态规整，孔径孔隙率合适，降解速率和机械强度与天然骨性质类似。成骨细胞因子缓释系统不仅保持了骨形态发生蛋白2的生物活性，也有效地控制了药物的突释效应，释放速率平稳，释放时间缓慢，呈现双相释放规律。制备的PLGA/nHA细胞因子缓释复合体是具有仿生学特点的组织工程骨。实验的后续研究计划对制备的PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体进行动物体内实验，研究其体内修复重建颌骨缺损的效果。随着作者后续实验对于PLGA/nHA复合体研究的深入，一种制作迅速一体化成形的复合体有望为组织工程骨所使用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的实验研究

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