体外静水压环境下细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.007

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (2): 191-196.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.007

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体外静水压环境下细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

陈江¹，贾育松¹，柳根哲²，孙旗¹，白文博¹，王利¹

¹北京中医药大学东直门医院骨伤一科，北京市 100700；²首都医科大学附属北京中医医院骨科，北京市 100010

收稿日期:2015-11-05 出版日期:2016-01-08 发布日期:2016-01-08
通讯作者: 贾育松，博士，主任医师，硕士生导师，北京中医药大学东直门医院骨伤一科，北京市 100700
作者简介:陈江，男，1983年生，湖北省宜昌市人，汉族，2011年北京中医药大学毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱退行性疾病研究。
基金资助:
北京市自然科学基金资助项目(7142076)；2015年度北京中医药大学基本科研业务费项目(中青年教师类，2015-JYB-JSMS084)

Cytokine-induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under hydrostatic pressure in vitro

Chen Jiang¹, Jia Yu-song¹, Liu Gen-zhe², Sun Qi¹, Bai Wen-bo¹, Wang Li¹

¹First Department of Orthopaedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China;²Department of Orthopaedics, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China

Received:2015-11-05 Online:2016-01-08 Published:2016-01-08
Contact: Jia Yu-song, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, First Department of Orthopaedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
About author:Chen Jiang, M.D., Attending physician, First Department of Orthopaedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
Supported by:
Beijing Municipal Natural Science Foundation, No. 7142076; 2015 Fundamental Research Fund of Beijing University of Chinese Medicine (Middle and Young Teachers), No. 2015-JYB-JSMS084

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

静水压：是指液体所产生的压强，生理学上的静水压就是机体某部位积聚的液体对其周围组织产生的压强。静水压是椎间盘髓核组织在人体直立、弯腰、负重等日常活动中承受载荷的主要力学形式，当椎间盘承受外负荷时，髓核静水压升高，向各方向均匀作用，使纤维环承受张应力。静水压对椎间盘髓核细胞的生长代谢及基因表达具有重要的调节作用，异常压力将导致椎间盘生物力学性能改变及其细胞代谢紊乱。

髓核样细胞：又称类髓核细胞，主要指具有类似髓核细胞功能表达的细胞。椎间盘的髓核细胞为类软骨细胞，但其本身不具备软骨细胞表面特异性的分子标记物，目前尚无公认的鉴定髓核细胞的分子标记物之金标准，试验中常根据髓核细胞分泌Ⅱ型胶原、蛋白多糖为主的表型特点来进行鉴定。在体外特定的条件下，干细胞被诱导分化成为具有类似髓核细胞功能表达的细胞，称之为“髓核样细胞”。

背景：骨髓间充质干细胞的诱导分化受到综合因素的共同作用，体外通过一定的细胞力学刺激结合细胞因子复合体共同作用，以期进一步提高干细胞髓核样细胞分化的效率。

目的：观察在体外静水压环境下转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子 1诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞表型分化的效果。

方法：取成年大鼠骨髓间充质干细胞，体外培养、分离及纯化，传代至第3代后分为：静压药物组在体外静水压加载系统中运用转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1诱导骨髓间充质干细胞分化；单纯药物组在体外常压环境下使用转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1诱导干细胞分化；空白对照组将骨髓间充质干细胞置于体外常压环境下普通培养基中培养。

结果与结论：培养14 d时，静压药物组可见多角形的髓核样细胞，单纯药物组细胞呈不规则形，空白对照组细胞变化不明显。静压药物组细胞中Ⅱ型胶原蛋白及DNA含量高于其他2组。说明在静水压环境下转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1可成功诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化，且诱导效率高于常压。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-3203-5182(贾育松)

关键词: 组织构建, 组织工程, 转化生长因子β1, 类胰岛素生长因子1, 骨髓间充质干细胞, 静水压, 髓核样细胞, 诱导分化, 体外实验, 北京市自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells is induced by integrated factors. In vitro interaction of cytokine complex and certain cell mechanical stimulation is carried out to further improve the efficiency of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into nucleus pulposus-like cells.

OBJECTIVE: To investigate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells induced by transforming growth factor-β1 and insulin-like growth factor-1 under hydrostatic pressure.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from adult rats were separated, cultured and purified in vitro. Passage 3 cells were induced in vitro with transforming growth factor-β1 and insulin-like growth factor-1 under hydrostatic pressure (hydrostatic pressure group), with transforming growth factor-β1 and insulin-like growth factor-1 under normal pressure (drug group), or with normal culture medium under normal pressure (blank control group).

RESULTS AND CONCLUSION: At day 14 after culture, polygonal nucleus pulposus-like cells were observed in the hydrostatic pressure group, but irregular cells in the drug group. There was no obvious change in the blank control group. Levels of collagen type II and DNA were higher in the hydrostatic pressure group than the other two groups. These findings indicate that the combination of transforming growth factor-β1 and insulin-like growth factor-1 can successfully induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under hydrostatic pressure, and the differentiation efficiency is higher under hydrostatic pressure than under normal pressure.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

陈江，贾育松，柳根哲，孙旗，白文博，王利. 体外静水压环境下细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(2): 191-196.

Chen Jiang, Jia Yu-song, Liu Gen-zhe, Sun Qi, Bai Wen-bo, Wang Li. Cytokine-induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under hydrostatic pressure in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(2): 191-196.

图/表（结果） 4

2.1 细胞生长情况及形态变化骨髓间充质干细胞分离48 h后可观察到少量纺锤形的细胞贴壁。培养7 d后，可见细胞数量明显增多，细胞呈集落样生长，14 d后可见细胞生长铺满瓶底。可观察到传代细胞呈均匀的长梭形，一两天内出现细胞克隆，细胞的排列规则。第7天细胞体积增大，出现致密贴壁层，细胞排列规则。通过流式细胞仪，第3代骨髓间充质干细胞高表达CD44，低表达CD14，符合骨髓间充质干细胞的特点。在14 d时观察，静压药物组细胞可见类多角形态的髓核样细胞。至第21天，静压药物组中已可观察到呈多角形的髓核样细胞(图1)，单纯药物组细胞则呈现不规则形，空白对照组细胞生长变化不明显。

2.2 DNA含量检测结果从第3天开始，静压药物组细胞中DNA含量增长明显，逐渐高于单纯药物组，且明显高于空白对照组的DNA含量(P < 0.05)。静压药物组不同时间点细胞中DNA含量差异有显著性意义(P < 0.05；表1)

2.3 Ⅱ型胶原表达培养第21天时，静压药物组骨髓间充质干细胞呈多边形，胞浆可见棕褐色颗粒着色，胞核清晰，而单纯药物组骨髓间充质干细胞胞浆可见浅褐色颗粒着色，胞核清晰。空白对照组骨髓间充质干细胞绝大多数呈长梭形，胞浆未见棕褐色颗粒(图2)。

2.4 蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达水平反转录PCR结果显示，从第14天开始，静压药物组与单纯药物组骨髓间充质干细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达水平差异有显著性意义(P < 0.05)，且随培养时间延长而逐渐增亮。空白对照组无明显变化，各时间点几乎无蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达(图3，表2)。

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引言

椎间盘退变引起的颈、腰椎疾病(颈椎病、腰椎间盘突出、腰椎管狭窄等)是骨科临床的常见病和多发病。尤其近年来此类疾病的发病年龄越来越趋于年轻化，保守治疗无效的患者尽管可通过外科手术在一定程度上缓解病痛，但却无法阻止或逆转椎间盘退变的进程，因此脊柱术后的患者一段时间之后常常还可能面临二次手术，这给患者的生活质量造成了严重影响。椎间盘组织是人体脊柱承重结构的重要组成部分，由于其没有直接的血液供应营养，较其他组织更容易发生损伤和退变，而其自我修复能力较差，因此人体脊柱的退变常始于椎间盘组织的退变^[1]。椎间盘退变的主要病理因素为椎间盘髓核细胞数量的减少及功能减退，而椎间盘髓核细胞的减少是退变的根源，使髓核细胞再生是生物治疗椎间盘退变的关键^[2]。骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能^[3]，在特定的体内或体外环境下，可转变为类软骨细胞，而髓核细胞具有与软骨细胞类似的蛋白多糖及胶原的表型表达，这就说明骨髓间充质干细胞有向髓核样细胞分化的可能^[4]。近期，Gou等^[5]在体外动物研究中发现，通过将干细胞移植到实验动物的退变椎间盘内，结果发现椎间盘退变的情况得到了较为明显的改善。而干细胞的体外诱导分化研究还处于探索阶段，其受到多种因素共同作用影响，寻找适于干细胞定向分化为髓核样细胞的条件是目前研究的热点^[6]。

实验拟在体外构建类似人体椎间的静水压力学环境，并运用转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化，观察是否能有效诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞转化，并比较不同干预条件下诱导分化效果的差异，为椎间盘组织工程研究进行新的探索。

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材料方法

1.1 设计随机对照细胞学研究。

1.2 时间及地点实验于2014年6月至2015年10月在北京中医药大学东直门医院中心试验室完成。

1.3 材料清洁级雄性SD大白鼠5只，鼠龄6-8周，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2015-0012。该研究已获得北京中医药大学东直门医院实验动物伦理委员会批准。

1.4 方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞分离纯化培养^[7] 用体积分数10%水合氯醛通过腹腔行SD大鼠麻醉，在无菌条件下分离出SD大鼠股骨及胫骨，使用10 mL注射器从骨髓腔抽取4.0-6.0 mL新鲜骨髓，在实验室超净台(北京昌平净化设备厂)内用等量PBS稀释洗涤，注入含有等体积、相对密度为1.077的淋巴细胞分离液作梯度离心，收集单个核细胞，洗涤3次后用含有体积分数10%胎牛血清(美国Hyclone公司)的DMEM/F12培养基重悬1×10⁵接种于培养皿，并置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱(德国Hemens公司)中进行培养，连续培养3 d后首次换液，待原代细胞生长接近瓶底面积的90%时，使用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化2.0-3.0 min，添加含血清的DMEM培养基终止消化，离心，弃去上清液，按照1∶3比例进行传代，传至第3代，用流式细胞仪行细胞标志鉴定，并冻存备用。

1.4.2 分组及诱导分化培养细胞分为3组：静压药物组、单纯药物组和空白对照组。取第3代骨髓间充质干细胞复苏后，以5×10⁷ L^-1细胞浓度接种于加有盖玻片的24孔板中，在倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)下观察细胞的生长情况，待细胞至70%融合后，静压药物组骨髓间充质干细胞在静压应力环境(0.3 MPa，2 h/次，2次/d，间隔10 h)下在含转化生长因子β1(10 mg/L；美国Neomaker公司)+类胰岛素生长因子1(100 µg/L；美国Neomaker公司)的含体积分数10%的胎牛血清的DMEM培养基(美国Gibco公司)中培养；单纯药物组骨髓间充质干细胞在常压下以含转化生长因子β1(10 mg/L)+类胰岛素生长因子1(100 µg/L)的含体积分数10%的胎牛血清的DMEM培养基中培养；空白对照组骨髓间充质干细胞在含体积分数10%的胎牛血清的DMEM培养基中培养。各组细胞分别于培养3，7，14，21 d时进行观察检测。

1.4.3 DNA含量测定选取Hoechst33258法，在不同的时间选取细胞，使用木瓜蛋白酶(美国Gibco公司)处理后，选取DNA(小牛胸腺)(美国Gibco公司)完成曲线图像，荧光分光光度计(日本岛津公司)测定各组的吸光度，最后计算出各组的DNA具体含量。

1.4.4 免疫组化法检测Ⅱ型胶原各实验组参照试剂盒(美国Neomaker公司)说明对骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达进行检测。以浓度为1∶100的兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体(美国Neomaker公司)作为一抗。阴性对照使用PBS代替一抗。阳性细胞为光学显微镜下所观察到的细胞胞浆呈淡黄色或黄色者。使用Ⅱ型胶原阳性对照片作为阳性对照。

1.4.5 PCR检测用RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA，并测定RNA浓度，利用反转录试剂盒(美国invitrogen公司)将RNA反转录为cDNA，然后应用PCR仪进行扩增。PCR扩增引物均由北京睿基恒科技发展有限公司合成。

PCR反应条件为：95 ℃温度下预变性5 min，然后 95 ℃温度下变性30 s，60 ℃温度下退火45 s，72 ℃温度下延伸40 s，共循环32次，再72 ℃延伸10 min。然后对PCR产物进行电泳，凝胶成像系统检测分析其吸光度值。Ⅱ型胶原上游引物的碱基序列是：5’-CTC CCA GAA CAT CAC CTA CCA-3’，下游引物的碱基序列是：5’-TGA CAG TCT TGC CCC ACT TAC-3’。蛋白聚糖上游引物的碱基序列是：5’-GTC CAC CAT TCG GCA TAA CT-3’下游引物的碱基序列是：5’-CAG GTC AGG GAT TCT GTG TGT-3’。

1.5 主要观察指标 ①大鼠骨髓间充质干细胞的形态。②DNA含量。③Ⅱ型胶原蛋白表达水平。④聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原mRNA表达水平。

1.6 统计学分析所有样品均重复测定3次。利用t 检验对各组间数据进行比较，P < 0.05表示差异有显著性意义，所有统计处理使用SPSS 11.5软件完成。数据以x(_)±s表示。

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讨论

椎间盘退变性疾病是骨科临床十分常见的疾患之一，其主要的病理学改变为髓核细胞数目和胞外基质成分(聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原)的减少，纤维细胞逐渐增多，从而造成椎间盘内的水分子相应减少并逐渐失去正常的生理功能^[2]。髓核细胞的表型表达同类软骨细胞，其产生胞外基质的能力受到外界应力刺激、生长因子、温度、低氧等细胞外环境因素的影响^[8-10]。而生长因子和骨髓间充质干细胞对通过加强细胞的分化来增强椎间盘的功能^[11]。Risbud等^[12]通过实验发现，骨髓间充质干细胞可促进髓核样细胞的生成，在较低的氧气浓度的条件下，与转化生长因子β1可共同促进骨髓间充质干细胞分化，诱导骨髓间充质干细胞后，在椎间盘损伤的模型中，发现有一定程度的修复功能。Steck等^[13]在转化生长因子β1的介导下对骨髓间充质干细胞进行培养，发现诱导后的骨髓间充质干细胞与髓核细胞相近。Morigele等^[14]通过转化生长因子β1成功诱导兔基因敲除骨髓间充质干细胞成为了具有髓核细胞表型的细胞。另外，在退变椎间盘组织中部分髓核细胞DNA发生凋亡，推测可能的原因是在体外培养时外界氧分压、温度等骤变导致髓核细胞发生凋亡^[15]。Buckwalter等^[16]的研究结果表明使在体外细胞培养中使用类胰岛素生长因子1能够防止细胞自行凋亡，提高细胞生物学活性。郑力峰等^[17^]观察不同浓度胰岛素样生长因子1对兔骨髓间充质干细胞分化成类髓核细胞的作用，结果显示100 μg/L 类胰岛素生长因子1能提高兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化的数量。张长春等^[18]研究认为类胰岛素生长因子1对白细胞介素1体外诱导的髓核细胞凋亡具有抑制作用。王磊等^[19]进一步证实在促进分泌Ⅱ型胶原和人退变髓核细胞合成效果方面，转化生长因子β1与类胰岛素生长因子1联合使用时比单独使用转化生长因子β1效果更加明显。因此，在本实验中将转化生长因子β1与类胰岛素生长因子1联合使用以便进一步提高细胞分化的效果。

静水压是椎间盘髓核组织在人体直立、弯腰、负重等日常活动中承受载荷的主要力学形式，在体外构建静水压力学环境对于体外研究骨髓间充质干细胞向髓核样细胞的分化情况及功能状态具有重要意义。Park等^[20]在周期性的压缩负荷(1 Hz，10 min，2次/d)下进行细胞培养，发现聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、Sox9基因合成增加。Wernike等^[21]以生物反应器产生周期性轴向压缩力(10%-20%，0.5 Hz，1 h/d)，研究表明力学有助于促进向透明软骨分化。韩成龙等^[22]观察模拟微重力条件下体外转化转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞表型分化时发现，在模拟微重力三维培养条件下转化生长因子β1转染的骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1的含量及反转录PCR法检测蛋白聚糖及Ⅱ型胶原mRNA的表达均明显高于对照组，提示模拟微重力条件下可促进骨髓间充质干细胞合成蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白的能力。因此，作者认为在进行骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的研究中，力学环境因素是重要的外界影响因素之一，而对于细胞而言，其平面结构接受外界应力刺激的能力不同于组织的立体结构，因此根据作者既往研究，实验选择0.3 MPa，2 h/次，2次/d，间隔10 h的施压方式更为符合细胞体外生物力学研究的特点及规律。

本实验中所用到的静水压加载系统兼顾了力学刺激、细胞因子以及低氧、温度等环境因素，这些因素已被证实对于骨髓间充质干细胞向髓核样分化具有明显的影响^[23-24]。较以往单一诱导因素研究更为科学，部分还原了人体真实的椎间内部环境状态，对细胞体外实验来说是一种更为先进的研究方式。实验通过不同分组及时间点观察，结果显示培养21 d后，静水压环境下转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1诱导的静压药物组细胞形态已经发生明显改变，从最初的长梭形、纺锤形变为多角形，其外形已经十分接近髓核细胞，其形态较单纯细胞因子干预的单纯药物组更为接近于髓核细胞。对于各组细胞增殖活性检测，实验采用了DNA含量检测，在实验第3天时观察静压药物组细胞DNA含量逐渐高出单纯药物组，且显著高于空白对照组(P < 0.05)，该结果证实了静压药物组的骨髓间充质干细胞活性更优，在机体中发挥其增殖及产生功能性胞外基质等的能力更强。静压药物组在骨髓间充质干细胞的细胞爬片免疫组化染色中可发现Ⅱ型胶原染色阳性与骨髓间充质干细胞胞体着色，可见明显的髓核样细胞表型；单纯药物组细胞可观察到较少数量的细胞可表达Ⅱ型胶原蛋白，空白对照组无显著改变，证实静压药物组的骨髓间充质干细胞胞体中已有明显的的Ⅱ型胶原蛋白合成。在本实验中，蛋白聚糖及Ⅱ型胶原mRNA的表达水平用于评估各组骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化程度高低的指标，通过反转录PCR检测从基因水平对其在各组细胞中表达的情况进一步评估，其中在静压药物、单纯药物两组均可检测出，而这些物质都是髓核细胞的主要表型表达，提示在体外合适干预条件下骨髓间充质干细胞已向髓核细胞分化，且随着时间的延长这种分化越来越明显。通过该实验，进一步证实了骨髓间充质干细胞在定向分化过程中是受到多方面因素共同作用的结果^[25-26]，在过去的研究中也发现使用单一诱导因素的情况下，诱导分化的结果往往不甚理想，因此，在结合前期相关研究的基础上，我们提出的静水压联合细胞因子复合体干预诱导，通过对比研究，结果显示静水压环境下细胞因子复合体组总体诱导效果更优于其他组。这也进一步明确了力学环境在骨髓间充质干细胞诱导分化过程的重要性。

综上所述，本文通过体外构建的静水压应力环境进一步完善了体外诱导骨髓间充质干细胞向髓核养细胞分化的综合干预条件，通过不同的分组及时间，进一步明确了力学环境及细胞因子对骨髓间充质干细胞分化的作用机制，找到了体外培养分化的合适途径，为利用骨髓间充质干细胞干预椎间盘退变进行了进一步的探索。骨髓间充质干细胞的生长分化特性受许多自身和外界调控因素的影响, 其中力学因素对体外培养的骨髓间充质干细胞的影响是值得进一步深入研究，利用适当的机械力学因素结合细胞因子复合体诱导因子等使骨髓间充质干细胞定向增殖和定向分化，对椎间盘组织工程的研究具有重要的意义。但是力学因素对体外培养的骨髓间充质干细胞生物学活性的研究仍然存在很多问题，如何更加科学有效地对骨髓间充质干细胞进行综合干预，寻找最佳的体外诱导干预条件尚需进一步的探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

体外静水压环境下细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

Cytokine-induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under hydrostatic pressure in vitro

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