形状记忆聚氨酯变形-复形前后与成骨细胞的相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：形状记忆聚氨酯具有良好的理化性能及细胞相容性，但关于形状记忆聚氨酯变形-复形前后成骨细胞相容性的相关报道相对较少。

目的：观察形状记忆聚氨酯变形-复形前后的成骨细胞相容性。

方法：制备形状记忆聚氯酯膜材，于实验环境下进行拉伸-固形-复形，获得变形-复形后的膜材料。将SD乳鼠成骨细胞分别接种于变形-复形前后的形状记忆聚氯酯膜材料上，培养2 h后，计数细胞黏附量，观察细胞铺展情况；培养1-11 d，检测细胞增殖活力。

结果与结论：变形-复形后形状记忆聚氯酯膜材料上成骨细胞的黏附量、增殖活力均显著高于变形-复形前形状记忆聚氯酯膜材料上的成骨细胞(P < 0.05)；成骨细胞在变形-复形后形状记忆聚氨酯上呈梭状，排列呈现出明显的定向性，铺展面积较小；成骨细胞在变形-复形前形状记忆聚氨酯上呈多边形，细胞排列无特定方向性，铺展面积较大。结果表明经变形-复形处理后，形状记忆聚氨酯具有更好的成骨细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 形状记忆聚合物, 聚氨酯, 骨修复, 成骨细胞, 细胞相容性

Abstract:

BACKGROUND: Shape memory polyurethane has good physical and chemical properties and compatibility, but there are relatively few reports on the compatibility of osteoblasts before and after the deformation-complex of the shape memory polyurethane.

OBJECTIVE: To observe the compatibility of osteoblasts with shape memory polyurethane before and after the deformation-complex.

METHODS: Shape memory polyurethane membranes were prepared, and its stretching-solid-complex was conducted under the experimental environment, to obtain the membrane materials after the deformation-complex. The Sprague-Dawley neonatal rat osteoblasts were inoculated on the shape memory polyurethane membranes before and after the deformation-complex. After 2 hours of culture, the number of adherent cells was counted, and cell spreading was observed; cell proliferation was determined after 1-11 days of culture.

RESULTS AND CONCLUSION: The adhesion amount and proliferation activity of osteoblasts on shape memory polyurethane membranes after the deformation-complex were significantly higher than those before the deformation-complex (P < 0.05). The osteoblasts presented fusiform appearance on the shape memory polyurethane membranes after deformation-complex, and cell arrangement showed a clear orientation, but a small spreading area; while the osteoblasts presented polygonal shape on the shape memory polyurethane membranes before deformation-complex, arranged in no particular direction, and spread largely. These findings show the shape memory polyurethane has better osteoblast compatibility after the deformation-complex.

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中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 材料 1-3 d龄SD乳鼠10只，SPF级，健康状况良好，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀) 2013-1-003。

形状记忆聚氨酯由重庆大学生物工程学院生物材料与仿生工程研究中心提供，属于线性高聚物，由异氰酸醋、多元醇和链增长剂3种单体聚合而成，材料的分子结构见图1。

1.3 实验方法

乳鼠成骨细胞的培养与鉴定^[8]：处死乳鼠，利用眼科剪剪开头部皮肤，剥出颅骨，浸泡于含有双抗的Hank’s液(含链霉素、青霉素)。将颅骨片置于青霉素小瓶中，剪碎后添加II型胶原酶溶液，置于37 ℃水浴消化30 min，消化后弃去上清，再次添加胶原酶溶液。收集上悬液，常规离心、洗涤之后，利用含体积分数10%血清的DMEM完全培养基混悬细胞，进行细胞接种，对原代和传代培养的细胞进行鉴定：利用倒置显微镜观察细胞形态，并取第2代成骨细胞进行碱性磷酸酶染色及钙化结节von kossa染色。

形状记忆聚氨酯膜材的制备：利用三氯甲烷对形状记忆聚氨酯材料进行溶解，静置，过夜后倒入聚四氟乙烯模具中，模具尺寸为100 mm×100 mm×2 mm。置于室温条件下自然挥发，72 h后进行真空干燥，脱模，获得实验所需的膜材，尺寸为100 mm×100 mm×2 mm。将膜材随机分为2组，分别设为实验组和观察组，对照组材料直接进行切割，获得大小为8 mm×8 mm×0.2 mm的材料，保存备用；实验组则予以拉伸-复形操作，复形后进行切割，获得大小为8 mm×8 mm×0.2 mm的材料，保存备用。

细胞黏附量测定：对两组材料进行紫外线灭菌，然后置于24孔板中；取第3代成骨细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-1，添加于上面24孔板各孔中，每孔100 μL。观察细胞接种效果，待贴壁生长之后添加适量完全培养基，置于培养箱中进行培养。连续培养2 h后取出，每组分别取3个材料进行10×PBS漂洗，常规2%戊二醛固定、PBS漂洗后进行H33258染色，置于荧光显微镜下观察细胞密度。利用图像分析软件进行细胞计数，取平均值作为最终结果。

细胞增殖检测：对两组材料进行紫外线灭菌，然后置于24孔板中；取第3代成骨细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1，添加于上面24孔板各孔中，每孔100 μL。观察细胞接种效果，待贴壁生长之后添加适量完全培养基，置于培养箱中培养。接种后1-11 d，分别对两组成骨细胞在形状记忆聚氯酯上的增殖情况进行MTT检测。利用酶标仪检测两组在570 nm处的吸光度值(A)。

细胞铺展观察：对两组材料进行紫外线灭菌，然后置于24孔板中；取第3代成骨细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1后，添加在上面24孔板各孔中，每孔100 μL。观察细胞接种效果，待贴壁生长后添加适量完全培养基，置于培养箱中培养。连续培养24 h后进行10×PBS漂洗和2%戊二醛固定等处理，添加0.2%Triton X-100，PBS漂洗之后添加罗丹明-鬼笔环肽，置于避光环境下孵育。过夜之后再次进行10×PBS漂洗，并添加H33258，染色之后置于激光共聚焦显微镜下进行观察，了解两组材料上成骨细胞的铺展情况。

1.4 主要观察指标成骨细胞在两组材料上的黏附量、增殖活力及铺展情况。

1.5 统计学分析数据利用统计学软件SPSS 19.0进行处理分析，计量资料予以t 检验，将不同数据经统计学比较差异有显著性意义的标准设定为P < 0.05。

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讨论

严重创伤、感染或肿瘤等因素所导致的大段骨缺损是骨科领域的世界难题，一直缺乏安全有效的治疗方法^[9-13]。随着科学技术的发展进步，各种新型的形状记忆聚合物开始被积极应用于骨缺损修复治疗之中^[14]。
现如今，临床对骨缺损患者进行修复治疗的过程中，
形状记忆聚氨酯是一种应用十分广泛的形状记忆聚合物^[15]。形状记忆聚氨酯属于形状记忆高分子材料，具有良好的生物相容性和力学性能^[16-18]。具体的应用过程中，通过调节各组分的组成和配比，可以获得所需的具有不同转变温度的材料^[19-20]。Pamela等^[21]通过实验合成了一种热塑性聚氨酯，这种聚氨酯具有良好的生物降解性能，通过研究还发现，在材料硬段引入POSS，显著提高了材料玻璃化转变温度以上的弹性。Alteheld等^[22]制备出一种新型交联结构的可降解形状聚氨酯，这一聚合物由脂肪族二异氰酸酯和端羟基星形预聚物通过反应获得，链段较小，具有更好的可降解性能。
通过星形预聚物的三元醇、四元醇引发剂可以构成一定的交联点，发挥出材料的形状记忆特性^[23-25]。聚氨酯通常由多异氰酸酯、聚醚或聚酯及扩链剂反应而成，其中反式1,4-聚异戊二烯未经交联的反式聚异戊二烯为结晶的热塑性聚合物，没有形状记忆效应^[26]。但反式聚异戊二烯分子链中含有双键结构，可使它们像天然橡胶一样进行配合和硫化^[27]。经硫磺或过氧化物交联得到的具有化学交联结构的反式聚异戊二烯，表现出明显的形状记忆效应^[28]。聚酯是大分子主链上含有羰基酯键的一类聚合物，通过过氧化物交联或辐射交联，也可获得一定的形状记忆效果^[29]。交联聚乙烯是最早获得实际应用的形状记忆高分子材料，通过物理交联或化学交联方法控制适当的结晶度和交联度，使大分子链交联成网状结构作为固定相。交联后的聚乙烯在耐热性、力学性能和物理性能等方面有了明显改善^[30-33]。在体外环境下，通过对材料进行一定的处理，可使其发生拉伸-固形-复形一系列变化，但关于形状记忆聚氨酯在变形-复形前后的成骨细胞相容性的相关报道相对较少^[34]。本次实验过程中，即制备形状记忆聚氨酯膜材并进行拉伸-固形-复形实验，获得具有不同表面形貌的形状记忆聚氨酯。在发生变形-复形前后，将不同的材料与乳鼠成骨细胞进行共培养，则受到不同接触引导效应的影响，相应的细胞生长情况也会产生不同的结果。本次实验过程中进行PBS漂洗，对材料上未发生黏附或者黏附程度不牢固的细胞进行清除，并利用细胞核染色计数方式对两组材料上的细胞黏附数量进行统计，经统计和比较可以发现，实验组成骨细胞在形状记忆聚氨酯上的细胞附着数量显著大于对照组(P < 0.05)。接种后1-11 d，实验组成骨细胞在形状记忆聚氯酯上的增殖活力均显著高于对照组(P < 0.05)。经观察，实验组成骨细胞在形状记忆聚氨酯上呈梭状，排列呈现出明显的定向性，铺展面积较小；对照组成骨细胞在形状记忆聚氨酯上呈多边形，细胞排列无特定方向性，铺展面积较大。上述结果表明，在发生变形-复形后，材料表面发生了一定的不平整变化，这一改变的出现，为成骨细胞伪足的攀附提供了更加有力的条件，相应的材料侧壁也为细胞提供了更多的黏附表面，从而显著增加细胞层和基底材料之间的作用力，并为细胞取向、伸展、排列和迁移等提供了良好的条件。因此，在发生变形-复形的材料上，成骨细胞可以更好地黏附和增殖，并沿着一定的方向进行排列，呈现出明显的定向性特征。
综上所述，经变形-复形后，骨修复形状记忆聚氨酯可为成骨细胞黏附等提供更加优良的条件，具备更好的成骨细胞相容性，另外还可以显著提高细胞排列的取向性，具有一定的临床应用前景，值得予以进一步研究。另外，通过本次研究也推测形状记忆聚氨酯材料具有组织诱导性功能，在变形-复形前后可能会对成骨细胞的分化功能和成骨效应产生一定的影响，但受到研究时间的限制，并没有在本次研究中进行分析，相关具体机制还有待在今后予以进一步分析。

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