改良细胞灌流分离装置提高心肌细胞分离效率

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.018

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (51): 8300-8304.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.018

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

改良细胞灌流分离装置提高心肌细胞分离效率

张琳¹，纵静²，张庆涛³

¹徐州医学院临床学院，江苏省徐州市 221002；²徐州医学院附属医院，江苏省徐州市 221002；³徐州医学院附属第三医院，江苏省徐州市 221003

收稿日期:2015-11-05 出版日期:2015-12-10 发布日期:2015-12-10
通讯作者: 张庆涛，硕士，副主任医师，徐州医学院附属第三医院，江苏省徐州市 221003
作者简介:张琳，女，1976年生，江苏省徐州市人，汉族，2007年徐州医学院毕业，硕士，副教授，主要从事心血管病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81400178)；徐州市科技计划项目(XM13B062)

Modified cell perfusion appliance for improving the separation efficacy of cardiomyocytes

Zhang Lin¹, Zong Jing², Zhang Qing-tao³

¹Clinical School of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China;²the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China; ³the Third Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221003, Jiangsu Province, China

Received:2015-11-05 Online:2015-12-10 Published:2015-12-10
Contact: Zhang Qing-tao, Master, Associate chief physician, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Lin, Master, Associate professor, Clinical School of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81400178; the Scientific Plan Project of Xuzhou City, No. XM13B062

摘要/Abstract

摘要：

背景：成熟心肌细胞分离过程复杂，获得数量稳定、高质量的心肌细胞迄今仍无统一、高效、活性好、简便的方法可循。
目的：通过改良Langendorff细胞灌流分离装置，探讨一种更高效的成熟心肌细胞分离方法。
方法：采用细胞灌流分离装置，用Ⅱ型胶原酶经主动脉逆行灌流法分离成年SD大鼠心肌细胞。对照组采用传统Langendorff细胞灌流分离装置；实验组采用改良Langendorff细胞灌流分离装置。消化结束即刻在显微镜下观察细胞形态、杆状细胞比率并计算活细胞产量；通过锥虫蓝染色评价心肌细胞活性。
结果与结论：实验组活细胞产量为(3.7±0.5)×107，显著高于对照组(2.1±0.4)×107，差异有显著性意义(P < 0.05)。实验组锥虫蓝染色阴性的杆状细胞比率(85.6±5.5)%，显著高于对照组(71.8±5.7)%，差异有显著性意义(P < 0.05)。提示采用改良Langendorff离体心脏灌流系统可获得高产量、高活性的心肌细胞，提高了成熟心肌细胞的分离效率，为成熟心肌细胞培养及研究奠定了基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 心肌细胞, 大鼠, 分离装置, 细胞活性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Separating mature cardiomyocytes is is a complex process. Until now, there is no uniform, high-yield, simple method to harvest cardiomyocytes with high viability.
OBJECTIVE: To explore a more effective method of isolating adult rat cardiomyocytes by modifying the cell perfusion appliance.
METHODS: Cardiomyocytes from adult Sprague-Dawley rats were isolated by collagenase type II perfusion method via a cell perfusion appliance. Traditional Langendorff cell perfusion appliance was used in control group, and modified Langendorff cell perfusion appliance used in experimental group. Under an optical microscopy, morphology of cardiomyocytes was observed and rod-shaped cell ratio was detected to calculate the yield of viable cells. Cardiomyocyte viability was evaluated by trypan blue exclusion test.
RESULTS AND CONCLUSION: The yield of viable cells per rat was significantly higher in the experimental group than in the control group [(3.7±0.5)×107 vs. (2.1±0.4)×107, P < 0.05]. The ratio of trypan blue test-negative cells was also significantly higher in the experimental group than in the control group [(85.6±5.5)% vs. (71.8±5.7)%, P < 0.05]. These findings indicate that high-yield and high-viability cardiomyocytes can be harvested
using the modified Langendorff cell perfusion appliance, which improves the separation efficiency of mature cardiomyocytes and lays the foundation for mature cardiomyocyte culture.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中图分类号:

R318

张琳，纵静，张庆涛. 改良细胞灌流分离装置提高心肌细胞分离效率[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(51): 8300-8304.

Zhang Lin, Zong Jing, Zhang Qing-tao. Modified cell perfusion appliance for improving the separation efficacy of cardiomyocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(51): 8300-8304.

图/表（结果） 2

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引言

近年来，随着医学科学技术的不断发展，心肌细胞已逐渐成为研究心脏疾病发病机制与治疗的重要工具。新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法已日趋成熟，而成年大鼠心肌细胞的分离和培养则较为困难，现在多数研究只能使用新生大鼠心肌细胞，但二者在形态结构和功能上均存在很大差异，成年心肌细胞的功能特性是其他发育阶段心肌细胞不可替代的。随着心脏电生理研究的不断深入和细胞分子生物学研究在心血管研究领域的不断普及，成熟心肌细胞的分离培养方法作为重要的研究手段也越发显得重要^[1-3]。应用成熟心肌细胞进行心脏疾病发病机制和治疗研究成为心血管病领域的重要课题^[4-6]。自从1969年Kono^[7]首次报道了酶解法被运用于细胞分离以来，用酶解法分离心肌细胞一直是最主要的方法。而自1976年Powell和Twist首次建立了单个成年心肌细胞分离方法后，成年心肌细胞被广泛地用于心肌细胞兴奋-收缩耦联、钙信号变化、力学特性、药物干预、基因治疗等研究中^[8-10]。国内以单个心肌细胞的电生理研究为目的进行急性分离，不适于进行细胞分子生物学研究^[11-13]。许多人在实验中对这种方法进行改进^[14-15]，但分离后细胞的存活率和活性总是不稳定。由于成熟心肌细胞分离和培养的技术、条件要求较高，迄今仍无统一、高效、活性好、简便的方法可循^[16-17]。
目前，大多数研究均采用传统Langendorff装置生物酶灌流消化法分离成熟心肌细胞^[18-19]。在实验过程中，发现传统Langendorff细胞灌流分离装置配置复杂，不易消毒灭菌，易使细胞污染；消化时心脏外环境温度不稳定、细胞产量不高、活性低等问题，导致所分离的心肌细胞无法进入下一步实验。为此，作者在总结国内外实验室分离培养成熟心肌细胞的经验基础上，经过长期摸索，对传统Langendorff装置进行了改良，建立了较为稳定的成年大鼠心肌细胞分离方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2013年7月至2015年7月在徐州医学院实验中心完成。
1.3 材料

实验动物：健康成年SD大鼠16只，雌雄不限，8-10周龄，体质量200-250 g，由徐州医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2010-0003，SPF级。按随机数字表法分为对照组和实验组，每组8只。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。主要液体配制：
无钙液(mmol/L)：NaCl 120.0，KCl 5.4，MgSO4 5.0，丙酮酸钠5.0，葡萄糖20.0，牛磺酸20.0，Hepes 10.0，用NaOH调节pH至7.2。
KB液(mmol/L)：NaCl 15.0，KCl 85.0，KH2PO4 30.0，MgSO4 5.0，丙酮酸钠5.0，肌酸5.0，牛磺酸20.0，葡萄糖20.0，EGTA 0.5，用KOH调节pH至7.2。
酶液：取50 mL无钙液，加入浓度为50 mmol/L的CaCl2和浓度为0.04%的Ⅱ型胶原酶，加BSA 100 mg。
所有液体均用0.22 μm滤膜过滤除菌，用前通纯O2氧饱和。
1.4 方法整个操作过程实验组在改良Langendorff细胞灌流分离装置中进行(见图1)，对照组在传统Langendorff细胞灌流分离装置中进行。实验前1 h预热灌流装置。实验组使用经过改良的Langendorff细胞灌流分离装置，配置透明保温外壳和温度计，不仅缩小了实验空间，而且利于观察并维持内部温度恒定在37 ℃左右，增加了灭菌装置，降低了微生物污染的可能性，使急性分离所得到的成年大鼠心肌细胞可以继续培养进入下一步实验，从而扩大了使用范围，拓展了应用领域。

取成年SD大鼠，腹腔注射5 000 U/kg的肝素，15 min后大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)，待麻醉起效后用体积分数75%乙醇消毒大鼠胸腹部，参照文献的方法进行分离[20-24]，迅速开胸取心脏，立即放入冰冷(0 ℃)的氧饱和的无钙液中清洗心脏，目的是解离桥粒和细胞间连结。剪去心脏周围除主动脉外的一切血管﹑结缔组织及主动脉弓以上部分，悬挂心脏在细胞灌流分离装置的套管上，套管插入深度不得超过主动脉瓣，用线结扎固定，同时打开恒流蠕动泵，此过程要迅速，尽可能控制时间在一至两分钟内完成。待心脏残留血液泵干净后，停恒流蠕动泵，将进液管从无钙液中换于酶液中，打开恒流蠕动泵循环灌流酶液15-20 min，流速6 mL/min。
实验组使用改良的细胞分离装置，灌流液体从下部的烧杯内通过恒流蠕动泵直接泵至蛇形管内，而不是按照常规方法从位于上部的容器内加液体，通过恒流泵双向调节维持流入和流出液体的平衡，这样不仅便于排空气泡，而且流出的酶液可通过恒流蠕动泵循环再次流入心脏，既不影响分离效果，又节约了胶原酶的用量。消化过程中注意心脏软硬度，待心脏由软变硬再变软，流出液变黏稠，可拉丝时，结束消化过程。将心脏剪下放入氧饱和的KB液中洗去残留的酶液，再放入新的KB液中，剪除心室之外的心肌组织，将心室组织剪成约1 mm3的碎块，用粗开口吸管轻轻吹打，可见细胞和细胞团块的脱落，吸收上清用200目尼龙网过滤，滤液于室温静置20 min，让细胞自然沉降，去上清。
心肌细胞形态学观察及计数：在倒置显微镜下用细胞计数板进行细胞计数，计算每个心脏细胞产量。细胞数/mL原液=(4个大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数。
心肌细胞活性检测：用0.4%锥虫蓝染色。由于活性细胞的细胞膜完整，所以锥虫蓝不能进入细胞内而拒染。死亡或损伤严重的心肌细胞呈团块状，由于细胞膜缺乏完整性，被锥虫蓝染成蓝色。即锥虫蓝拒染的细胞为活的心肌细胞，计算锥虫蓝染色阴性的杆状细胞占总杆状细胞数的百分比。
1.5 主要观察指标 ①心肌细胞形态学。②心肌细胞的计数。③心肌细胞活性。
1.6 统计学分析应用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，两组间比较采用t 检验，数据用x(_)±s表示，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

自从1953年Durrows和Moscona首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后^[26]，成熟心肌细胞分离和培养技术不断进展，逐步发展成现有的浸泡法、贴块法、离体心脏灌注法等3种心肌细胞分离方法。心肌细胞浸泡法是应用酶浸泡被剪成约1 mm3的心肌组织，随着酶逐渐渗入细胞间质，可以分离出心肌细胞。但是在渗透过程中，酶对外面的心肌细胞破坏严重，对心肌细胞间质作用时间不同，分离心肌细胞的效果较差，该方法主要用于人的心肌细胞的分离；贴块法主要用于新生动物心肌组织，先将心肌组织剪成1 mm3大小，放在培养液中，主要利用新生心肌细胞易生长的特性，依靠细胞的分化生长出单个心肌细胞，此方法分离成年动物心肌细胞效果较差。对成年动物而言，体外心脏生物酶灌注法分离心肌细胞的质量及数量最佳^[27-29]，其基本原理是先依靠心脏跳动排出心脏内积血，防止冠脉血管栓塞及污染，再用胶原酶消化细胞间质中的胶原纤维以释放心肌细胞。而欲获得数量稳定和质量较高的心肌细胞是一件比较困难的事情^[30-32]。
成熟心肌细胞分离过程复杂，传统的Langendorff细胞灌流分离装置包含多个蛇形管、玻璃容器和较长的连接管道，主要依靠重力进行灌流，其高度通常在1 m左右，因此仅适合于电生理研究所需的单个细胞的急性分离。本装置经过改进和优化后，仅使用一个蛇形管和一个玻璃容器，连接软管的数量和长度也经过精简，极大地降低了整个系统的高度，同时也减少了玻璃容器和连接软管散热，利于满足离体心脏对外环境的温度要求。由于离体心脏对外环境温度要求严格，整个灌流过程中，心脏周围的温度及灌流液的温度始终要保持在37 ℃左右。传统的Langendorff细胞灌流分离装置直接暴露在实验室大环境下，冬季外环境温度很难达到37 ℃左右，而夏季由于操作人员长时间暴露在37 ℃左右外环境工作，极易导致中暑。经过改良的Langendorff细胞灌流分离装置，配置了透明的保温外壳和温度计，缩小了实验空间，利于实时观察并维持内部温度，保证整个消化过程离体心脏周围温度恒定在37 ℃左右，同时还能起到日常细胞分离装置的防尘作用。传统的Langendorff细胞灌流分离装置及分离外环境不易消毒灭菌，容易造成分离细胞的污染。作者经过改良，在透明保温装置内增加了灭菌设备，心肌细胞分离的全部操作均可在该装置中完成，显著降低了微生物污染的可能性。曾有报道在超净台中进行成熟心肌细胞分离，但是由于超净台内温度难以维持37 ℃左右，而且超净台内高度有限，易导致操作空间受限，灌注压不足，显著影响了心肌细胞分离效果。应用langendorff灌流装置分离心肌细胞分为恒流和恒压两种模式，恒流灌流可以通过监测灌注压力判断心脏是否完成消化^[33]，优于恒压灌流。本研究采用恒流灌注，流速设定为6 mL/min。恒流灌注的流速一般为6-8 mL/min，传统的Langendorff细胞灌流分离装置经改良后，所有的灌流液体均从下部的烧杯内通过恒流蠕动泵直接泵至蛇形管内，而不是按照常规方法从位于上部的容器内加液体，通过恒流泵双向调节维持流入和流出液体的平衡，这样不仅便于排空气泡，而且流出的酶液可通过恒流蠕动泵循环再次流入心脏，既不影响分离效果，又节约了胶原酶的用量，从而节省了大量实验开支。
此外，本研究发现在成年大鼠心肌细胞分离过程中还应注意以下事项：①关于消化酶的选择，很多实验室是联合应用胶原酶和胰蛋白酶^[34]。由于胶原酶作用较缓和，主要解离细胞外基质的胶原蛋白，对细胞的损伤较小。而胰蛋白酶主要用于分解组织间质的蛋白成分，作用强，同时对心肌细胞膜蛋白有破坏作用，对细胞损伤大，因此作者选择不加胰蛋白酶而单独使用胶原酶。另外，酶的批次变化意味着酶的活性变化，会明显影响心肌细胞分离的效果，因此尽量选择同一批次的酶。②关于消化酶的浓度，消化酶的浓度过高及消化时间过长都可造成细胞膜不可修复的损害^[35-36]。作者在实验中发现用0.04%浓度的Ⅱ型胶原酶就可以分离到高质量的心肌细胞，既减少了胶原酶对心肌细胞的损害，又节省了昂贵的Ⅱ型胶原酶的费用，还能保证分离效果。③关于酶的消化时间的判断是该实验的关键点也是难点之一，消化不全和过度消化都会造成心肌细胞的损伤。作者在实验中发现应该密切观察心脏软硬度的变化，待心脏由软变硬再变软，心脏体积较之前增大，流出液变黏稠并可以拉丝时，应当结束消化过程，消化时间过长会对心肌细胞造成不可逆的损害^[37]。④关于细胞活性的测定，正常的活细胞，细胞膜结构完整，能够排斥锥虫蓝，使之不能进入细胞内。而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，细胞膜的通透性增加，可被锥虫蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，本研究借助锥虫蓝染色非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。
作者通过对传统Langendorff细胞灌流分离装置进行改良，建立了较为稳定的成年大鼠心肌细胞的分离方法，通过本方法分离得到的成年大鼠心肌细胞具有结构完整、杆状率高、细胞活性好、细胞收缩较好的特点，能够满足实验需要。
现在，随着科技的不断发展，成年大鼠心肌细胞已广泛应用于离子通道、基因转染、细胞免疫等方面的研究。本研究采用改良的Langendorff细胞灌流分离装置进行Ⅱ型胶原酶匀速灌流分离成熟心肌细胞，不仅提高了成熟心肌细胞的分离效率，获得了高产量、高活性的心肌细胞，而且满足了成熟心肌细胞进一步培养的要求，为需要应用成熟心肌细胞进行的各种研究奠定了基础。

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