衣霉素海马内给药诱导海马神经元死亡的新现象与假说

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.011

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (51): 8259-8265.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.011

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衣霉素海马内给药诱导海马神经元死亡的新现象与假说

袁磊^1，2，邓思敏³，张海霞¹，钱诗蕾¹，徐斌¹，龚济钦¹，曾杰¹，潘娟⁴，刘宏哲²，胡明华¹，吴长初¹

¹长沙医学院湖南省重点建设学科人体解剖与组织胚胎学教研室和重点实验室，湖南省长沙市 410219；湖南省人民医院，²脊柱外科， ^{4心内科，湖南省长沙市 410005；³上海交通大学附属第六人民医院，上海市 200233}

收稿日期:2015-10-24 出版日期:2015-12-10 发布日期:2015-12-10
通讯作者: 吴长初，副教授，长沙医学院湖南省重点建设学科人体解剖与组织胚胎学教研室和重点实验室，湖南省长沙市 410219
作者简介:袁磊，男，1991年生，湖南省绥宁县人，汉族， 2015年长沙医学院毕业，现任湖南省人民医院骨科中心住院医师。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81171136)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(湘教通[2013]191号-431, 湘教通[2012]402号-445)；湖南省高等学校科学研究项目重点项目(10A013)；湖南省高等学校“十二五”重点学科专项建设项目(湘教发[2011]76号)

Tunicamycin-induced neuronal death in the hippocampus: new phenomenon and new hypothesis

Yuan Lei^{1, 2}, Deng Si-min³, Zhang Hai-xia¹, Qian Shi-lei¹, Xu Bin¹, Gong Ji-qin¹, Zeng Jie¹, Pan Juan⁴,

Liu Hong-zhe², Hu Ming-hua¹, Wu Chang-chu¹

¹Hunan Provincial Key Laboratory of Human Anatomy and Histoembryology, Key Disciplines in Hunan Province, Changsha Medical University, Changsha 410219, Hunan Province, China; ²Department of Spine Surgery, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410005, Hunan Province, China; ³the Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China; ⁴Department of Cardiology, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410005, Hunan Province, China

Received:2015-10-24 Online:2015-12-10 Published:2015-12-10
Contact: Wu Chang-chu, Associate professor, Hunan Provincial Key Laboratory of Human Anatomy and Histoembryology, Key Disciplines in Hunan Province, Changsha Medical University, Changsha 410219, Hunan Province, China
About author:Yuan Lei, Physician, Hunan Provincial Key Laboratory of Human Anatomy and Histoembryology, Key Disciplines in Hunan Province, Changsha Medical University, Changsha 410219, Hunan Province, China; Department of Spine Surgery, Hunan Provincial People's Hospital, Changsha 410005, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171136; Research Learning and Innovative Experiment Project of Undergraduates in Hunan Province, No. [2013]191-431, [2012]402-445; the Scientific Research Project of Higher Education in Hunan Province, No. 10A013; the Key Discipline Construction Project in Higher Education of Hunan Province during the Twelfth Five-Year Period, No. [2011]76

摘要/Abstract

摘要：

背景：海马内注射衣霉素和红藻氨酸均可诱导内质网应激介导海马神经元凋亡，但两者大有不同。
目的：比较海马CA1区内注射红藻氨酸和衣霉素后不同时间段海马神经元的死亡情况。
方法：将96只成年雄性昆明小白鼠随机分为PBS组、红藻氨酸组和衣霉素组，海马CA1区分别注射红藻氨酸、衣霉素和PBS。
结果与结论：Fluoro-Jade B染色显示，红藻氨酸组小白鼠注射后2，3，4，5，6，8 h损伤侧出现海马神经元死亡明显。衣霉素组小白鼠注射后4 h损伤侧CA1区可见神经元明显死亡，对侧无明显死亡；衣霉素组小白鼠注射后5 h损伤侧CA1-3区未见神经元明显死亡，但对侧CA1-3区可见大量神经元死亡。免疫组化染色显示，衣霉素组小白鼠注射后4，5 h神经元死亡明显区域内磷酸化真核翻译起始因子2α的表达明显上调。结果提示海马内注射衣霉素后5 h出现海马神经元同侧给药对侧死亡的现象，是由于海马内注射衣霉素后随着药物浓度的扩散在4.0-5.0 h间神经元凋亡可能有一个由同侧向对侧迅速蔓延的过程，这是不同于红藻氨酸海马内注射诱导神经元死亡过程的又一新现象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 衣霉素, 红藻氨酸, 海马, 脑立体定位, 免疫组化, Bederson体征评分, 磷酸化真核翻译起始因子2α, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although both tunicamycin and kainic acid can induce neuronal apoptosis in the hippocampus, their processes are very different.
OBJECTIVE: To compare the death of hippocampal neurons induced by injection of tunicamycin and kainic acid into the hippocampal CA1 region.
METHODS: Ninety-six adult male Kunming mice were randomized into PBS, tunicamycin and kainic acid groups, and then subjected to microinjections of PBS, tunicamycin and kainic acid into the hippocampus, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: Fluoro-Jade B staining showed that at 2, 3, 4, 5, 6 and 8 hours after kainic acid injection, hippocampal neurons appeared to have obvious death at the injured CA1 region; at 4 hours after tunicamycin injection, neuronal death was visible at the injured CA region rather than at the contralateral CA1 region; at 5 hours after tunicamycin injection, there were a large of dead neurons in the contralateral CA1 region rather than at the injured CA1 region. Immunohistochemical staining showed that the expression of phosphorylated eukaryotic initiation factor 2α at the apoptotic region was up-regulated significantly at 4 and 5 hours after tunicamycin injection. These findings indicate that with the diffusion of tunicamycin concentration, the neuronal apoptosis may have a trend to spread rapidly from the ipsilateral to the contralateral CA1 region at 4-5 hours after hippocampal injection of tunicamycin, and this process is a new discovery that is different from kainic acid-induced hippocampal neuron apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中图分类号:

R318

袁磊，邓思敏，张海霞，钱诗蕾，徐斌，龚济钦，曾杰，潘娟，刘宏哲，胡明华，吴长初. 衣霉素海马内给药诱导海马神经元死亡的新现象与假说[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(51): 8259-8265.

Yuan Lei, Deng Si-min, Zhang Hai-xia, Qian Shi-lei, Xu Bin, Gong Ji-qin, Zeng Jie, Pan Juan. Tunicamycin-induced neuronal death in the hippocampus: new phenomenon and new hypothesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(51): 8259-8265.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 96只小鼠均进入结果分析，中途无脱落。实验流程见图1。

2.2 Bederson神经体征评分依据Bederson神经体征评分，以确定海马内注射药物对小鼠中枢神经功能的影响，结果发现PBS组、红藻氨酸组小白鼠注射后1和12 h和衣霉素组小白鼠注射后1，2，3，6，8，12 h的Bederson神经体征评分为0-1分，而红藻氨酸组注射后2，3，4，5，6，8 h和衣霉素组注射后4，5 h的Bederson神经体征评分为3分，提示在海马CA1区内注射红藻氨酸后2，3，4，5，6，8 h和注射衣霉素后4，5 h小白鼠中枢神经功能出现明显损伤，而在PBS组、红藻氨酸组注射后1，12 h和衣霉素组注射后1，2，3，6，8，12 h的小白鼠未出现明显损伤。
2.3 FJB染色结果 PBS组小白鼠海马内未见细胞死亡增加(图2A1-6)；红藻氨酸组小白鼠注射后2，3，4，5，6，8 h损伤侧出现海马神经元死亡明显增加(图2B1-6)；而在衣霉素组小白鼠注射后1，2，3，6，8，12 h时损伤侧可见少量海马神经元死亡(图2D1-2，D5-D6)，对侧无明显死亡(图2C1-2，C5-6)；衣霉素组小白鼠注射后4 h损伤侧CA1区可见海马神经元明显死亡(图2C3，D3)；衣霉素组小白鼠注射后5 h损伤侧可见少量海马神经元死亡，但对侧CA1-3区可见大量海马神经元死亡(图2C4，D4)。与Bederson体征评分结果完全吻合。

2.4 死亡神经元数量 PBS组小白鼠海马神经元未见明显死亡(P > 0.05)。衣霉素组小白鼠注射后4 h损伤侧海马CA1区和注射后5 h对侧海马CA1-3区神经元死亡明显 (P < 0.01)；衣霉素组小白鼠注射后1，2，3，6，8，12 h损伤侧仅见少量死亡海马神经元，而对侧未见海马神经元死亡。红藻氨酸组小白鼠注射后2，3，4，5，6，8 h损伤侧海马神经元死亡明显(P < 0.05)，对侧未见海马神经元死亡。与FJB染色结果和Bederson体征评分结果完全吻合(图3)。

2.5 免疫组织化学染色结果根据Bederson体征评分结果和FJB染色结果，取衣霉素组第4，5小时小白鼠脑片进行免疫组化检测，4 h时损伤侧CA1区可见磷酸化真核翻译起始因子2α的表达明显上调，对侧CA1-3 区未见磷酸化真核翻译起始因子2α表达上调(图4)。

5h时损伤侧除针头注射处有少量磷酸化真核翻译起始因子2α表达上调外，余损伤侧未见磷酸化真核翻译起始因子2α表达，但对侧CA1-3区可见磷酸化真核翻译起始因子2α的表达明显上调(图5)。

参考文献

[1] 袁磊,龚济钦,张海霞,等.KA1亚受体在内质网应激致海马神经元死亡中的作用[J].南方医科大学学报,2015,35(2):191-195.
[2] Luoma PV. Elimination of endoplasmic reticulum stress and cardiovascular, type 2 diabetic, and other metabolic diseases. Ann Med. 2013;45(2):194-202.
[3] Mihailidou C, Chatzistamou I, Papavassiliou AG, et al. Improvement of chemotherapeutic drug efficacy by endoplasmic reticulum stress. Endocr Relat Cancer. 2015; 22(2):229-238.
[4] Wang H, Wang X, Ke ZJ, et al. Tunicamycin-induced unfolded protein response in the developing mouse brain. Toxicol Appl Pharmacol. 2015;283(3):157-167.
[5] Imai T, Kosuge Y, Endo-Umeda K, et al. Protective effect of S-allyl-L-cysteine against endoplasmic reticulum stress-induced neuronal death is mediated by inhibition of calpain. Amino Acids. 2014;46(2):385-393.
[6] Carlisle RE, Brimble E, Werner KE, et al. 4-Phenylbutyrate inhibits tunicamycin-induced acute kidney injury via CHOP/GADD153 repression. PLoS One. 2014;9(1):e84663.
[7] Jiang H, Zou J, Zhang H, et al. Unfolded protein response inducers tunicamycin and dithiothreitol promote myeloma cell differentiation mediated by XBP-1. Clin Exp Med. 2015;15(1): 85-96.
[8] Cabral Miranda F, Adão-Novaes J, Hauswirth WW, et al. CHIP, a carboxy terminus HSP-70 interacting protein, prevents cell death induced by endoplasmic reticulum stress in the central nervous system. Front Cell Neurosci. 2015;8:438.
[9] 付政祺.GSK-3β介导了内质网应激诱导的tau蛋白过度磷酸化及大鼠空间记忆障碍[D].武汉:华中科技大学,2010.
[10] Ono Y, Tanaka H, Tsuruma K, et al. A sigma-1 receptor antagonist (NE-100) prevents tunicamycin-induced cell death via GRP78 induction in hippocampal cells. Biochem Biophys Res Commun. 2013;434(4):904-909.
[11] Ono Y, Shimazawa M, Ishisaka M, et al. Imipramine protects mouse hippocampus against tunicamycin-induced cell death. Eur J Pharmacol. 2012;696(1-3):83-88.
[12] 袁磊,张海霞,钱诗蕾,等.红藻氨酸诱导内质网应激模型的途径[J].中国组织工程研究,2014,18(36):5861-5867.

[13] 郭东华,刘湘华,曾杰,等.KA1表达再分布对神经元兴奋毒性的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(2):287-290.
[14] Paxinos G, Franklin KB. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates(Second Edition).New York: Academic Press, 2001:90-110.
[15] Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 1986;17(3):472-476.
[16] Chen ZL, Yu H, Yu WM, et al. Proteolytic fragments of laminin promote excitotoxic neurodegeneration by up-regulation of the KA1 subunit of the kainate receptor. J Cell Biol. 2008; 183(7):1299-1313.
[17] 袁磊,龚济钦,张海霞,等.红藻氨酸受体与神经退行性变疾病相关性的研究进展[J].中国临床新医学,2014,7(4):367-371.
[18] 袁磊,徐斌,张海霞,等.以内质网应激浅谈糖尿病及其并发脑病的研究进展[J].解剖学研究,2014,36(5):380-384.
[19] Xia JG, Xu FF, Qu Y, et al. Atorvastatin post-conditioning attenuates myocardial ischemia reperfusion injury via inhibiting endoplasmic reticulum stress-related apoptosis. Shock. 2014;42(4):365-371.
[20] Solanki S, Dube PR, Tano JY, et al. Reduced endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and impaired unfolded protein response in TRPC3-deficient M1 macrophages. Am J Physiol Cell Physiol. 2014;307(6):C521-531.
[21] Schönthal AH. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress signaling in cancer. Biochem Pharmacol. 2013;85(5):653-666.
[22] Zhang R, Piao MJ, Kim KC, et al. Endoplasmic reticulum stress signaling is involved in silver nanoparticles-induced apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 2012;44(1):224-232.
[23] 高伟娜.孤核受体NR4A家族的表达与内质网应激的关系及其在胰岛β细胞中调控胰岛素基因表达的机制研究[D].济南:山东大学,2014.
[24] 马美娟,李妍,张英梅,等.不同程度内质网应激对巨噬细胞自噬的影响[J].现代生物医学进展,2014,14(2):209-213.
[25] Fu Z, Zou F, Deng H, et al. Estrogen protects SGC7901 cells from endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by the Akt pathway. Oncol Lett. 2014;7(2):560-564.
[26] Jiang L, Kon N, Li T, et al. Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression. Nature. 2015;520(7545): 57-62.
[27] Wang Y, Feng ZY, Wang J, et al.Somatosensory stimulation suppresses the excitability of pyramidal cells in the hippocampal CA1 region in rats. Neural Regen Res. 2014;9 (11): 1138-1144

引言

近年来衣霉素在细胞凋亡的机制、内质网凋亡通路与临床疾病的关系等研究中已得到广泛的应用^[1-2]。衣霉素是放线菌产生的一种蛋白N-糖链抑制剂^[3]，是目前国际公认的一种高度特异的用于体外诱导内质网应激反应性细胞凋亡的经典药物^[4-5]，其诱导的凋亡模型被认为是一种经典的模型^[6-7]。衣霉素诱导海马神经元凋亡多见于体外应用，如体外孵育海马神经元诱导内质网应激的发生^[8]。体内应用的文献报道不多，偶尔可见有侧脑室内直接注射衣霉素诱导细胞内质网应激的实验研究报道：如国内华中科技大学付政祺^[9]于其博士论文中始采用侧脑室注射(25-75 μmol/L)衣霉素10 μL诱导内质网应激；国外日本Gifu Pharmaceutical大学Ono等^[10-11]在侧脑室内直接注射衣霉素也取得了较好的效果。但鲜有海马CA1区内直接注射衣霉素诱导海马神经元凋亡的研究。海马神经元具有高度发达的内质网，对内质网内稳态紊乱极为易感，理论上是衣霉素诱导内质网应激的理想场所^[12]。作者前期研究衣霉素海马内给药诱导内质网应激已取得突破性的进展^[1]，已成功地应用脑立体定位仪直接海马内注射高浓度衣霉素诱导内质网应激介导海马神经元凋亡发生，并创造性地使得这一合理猜想变成了现实可行的凋亡诱导途径。基于前期研究结果，作者所在团队还发现衣霉素海马内注射诱导的海马神经元死亡过程与红藻氨酸海马内注射诱导海马神经元死亡过程不同^[12-13]。文章拟比较衣霉素和红藻氨酸海马内注射诱导神经元死亡的情况，探索海马CA1区内注射衣霉素后出现海马神经元同侧给药对侧死亡现象的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2013年12月至2015年1月在长沙医学院湖南省重点建设学科人体解剖与组织胚胎学省级重点实验室及长沙医学院神经生物学研究所完成。
1.3 材料
实验动物：8-10周龄雄性昆明小白鼠96只，体质量(23±2) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。动物室内温度(18±3) ℃，湿度(50±20)%，每日光照12 h。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animals experimentation》相关动物伦理学。

1.4 方法
1.4.1 动物模型制作 96只成年雄性昆明小白鼠随机等分为PBS组、红藻氨酸组和衣霉素组。3组小鼠腹腔内注射2.5%的三溴乙醇(0.02 mL/g)麻醉，然后将其固定在脑立体定位仪上，使用微量注射器将PBS 300 nL、0.15 nmol红藻氨酸(300 nL×0.5 mmol/L)或衣霉素(2 g/L×300 nL)分别注射进CA1区域(药物注射定位坐标依照立体定位图谱进行定位[14]，确定前后囟在同一水平线上后，以前囟为零点，前囟以后1.8 mm，旁开1.7 mm，深度1.6 mm)，注射时间为60 s。注射完后将针头后撤0.1 mm，停留2 min便于所注射的液体在CA区域扩散吸收^[12]。
1.4.2 Bederson体征评分造模后1，2，3，4，5，6，8和12 h，每组每个时间段各取4只小鼠进行Bederson体征评分。1.4.3 取材进行Bederson体征评分后，小鼠心脏灌注生理盐水，再灌注体积分数为4%甲醛，取全脑，置于4 ℃的冰箱中固定过夜(18-24 h)。次日置于30%蔗糖PBS溶液 48 h，至脑沉底。将小鼠全脑在-30 ℃条件下用冷冻切片机切片，厚度20 μm，切片保存在0.02%叠氮化钠的PBS溶液里。

1.4.4 FJB染色将固定的脑切片移至载玻片于4 ℃过夜，55 ℃干燥2 h；待玻片冷却后，浸入含1%NaOH的体积分数80%的乙醇中2 min；体积分数70%乙醇浸泡2 min；水洗2 min×1次；0.06%高锰酸钾浸泡10 min；水洗2 min×1次；使用0.000 4%FJB染色20 min；水洗1 min×3次；将载玻片于50 ℃干燥10 min后，荧光显微镜观察^[12]。
应用剖面计数法，在油镜(10×100倍)下对FJB染色有神经元死亡的脑切片进行细胞计数，每个脑切片对应的5个不同海马区域均被计数，计数5张脑切片中设定的CA区域的所有死亡神经元^[13，16]。
1.4.5 免疫组织化学染色取衣霉素组造模后4，5 h的脑片进行免疫组化染色。
具体方法：将固定的脑切片移至载玻片于4 ℃过夜，取片、复温干燥、画蜡圈；水洗5 min×3次；体积分数3%H2O2常温浸泡10 min；超纯水洗5 min×2次；1×PBS-T(1×PBS/0.1% Triton-100)洗5 min×1次；体积分数5%小牛血清的1×PBS-T溶液常温封固1 h；切片置于4 ℃含P-eIF2α多克隆兔抗(1︰400)的体积分数为3%小牛血清和0.1%Triton-100的PBS溶液中反应过夜；次日，1×PBS-T洗5 min×3次；山羊抗兔IgG，TRITC红色荧光二抗和山羊抗兔IgG，FITC绿色荧光二抗(工作浓度都为1︰200)分别浸润4 h和5 h切片，常温黑暗环境孵育1 h。然后水洗烘干后在荧光显微镜下观察检测^[1]。
1.5 主要观察指标小鼠Bederson体征评分，海马神经元细胞的形态和死亡细胞数量。
1.6 统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计学处理。组内比较采用Student t-test检验，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

红藻氨酸是一种具有强烈致痫作用的兴奋性离子型谷氨酸受体激动剂，于1953年由Murakami等从日本红海藻海人草(Digenea simplex)中提取的谷氨酸结构类似物，作为实验经典的神经毒性药物，能作用于脊椎动物中枢神经系统的谷氨酸受体，不仅能直接兴奋神经元，而且能增强细胞膜对Na+的通透性导致神经元去极化^[17]。作者前期实验发现海马内注射红藻氨酸诱导内质网应激介导神经元凋亡已取得了很好的结果，本实验结果发现，海马内注射红藻氨酸后2，3，4，5，6，8 h损伤侧海马神经元死亡明显，对侧未见明显死亡，与前期实验结果基本一致^[12-13]。作者既往研究已经证明，海马内CA1区注射红藻氨酸或衣霉素后，膜外受体KA1亚受体首先接受凋亡信号，并向细胞内传导，引起内质网功能紊乱，诱发内质网应激，并进一步促使神经元凋亡^[1]。本实验结果也说明海马内注射红藻氨酸后海马神经元同侧给药同侧死亡，红藻氨酸无损伤侧给药对侧死亡的现象，与郭东华等^[13]和Rockefeller大学Zu-Lin Chen博士等^[16]研究结果基本一致。
近年来研究中，内质网应激介导的凋亡途径被认为是调控细胞凋亡的重要原因，越来越受到重视^[18]。内质网应激主要通过激活其下游的凋亡信号分子如caspase、CHOP/GADDl53、Bcl-2家族等，在调控细胞凋亡中发挥重要作用^[19-20]。内质网应激有3个感受器激酶：蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、肌醇需求激酶1(IREl)和转录活化因子6(ATF6)^[21]。真核细胞中有三条应对内质网应激的关键未折叠蛋白反应信号通路即PERK-eIF2α-ATF4- CHOP通路、IRE1-XBP-1通路和BiP-ATF6通路^[22]。检测内质网应激的发生通常通过检测参与未折叠蛋白反应的标志分子，包括IREl磷酸化、XBP-1剪接形式比例、磷酸化真核翻译起始因子2α表达、促凋亡因子CHOP表达、促折叠分子伴侣GRP78表达、裂解型ATF6形成等^[23]。适度的内质网应激可促进细胞存活，但内质网应激过强或持续存在时，将最终诱导细胞凋亡^[12]。例如，马美娟等[24]最近研究发现小剂量衣霉素可引起一定程度的内质网应激，而减少细胞的凋亡；大剂量衣霉素则可明显增加细胞凋亡。目前诱导内质网应激常用的的化学试剂有衣霉素、毒胡萝卜素、二硫苏糖醇和棕榈酸钠盐等^[23，25]。天然核苷酸类抗生素衣霉素，能抑制N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移到脂质载体上来影响天冬酰胺的糖蛋白糖链合成和膜蛋白、分泌蛋白的功能，破坏内质网的平衡，导致Ca2+紊乱、未折叠/错误折叠蛋白质蓄积，而激活未折叠蛋白反应，诱发内质网应激^[6-7]。本实验在昆明小鼠海马CA1区内注射高浓度衣霉素(2 g/L)后，免疫组织化学方法检测内质网应激发生的标志物PERK激酶底物磷酸化真核翻译起始因子2α。实验观察海马神经元凋亡的情况主要根据作者前期实验证明的海马注射红藻氨酸或衣霉素后主要通过诱导内质网应激介导神经元凋亡的理论^[1]，通过对未折叠蛋白反应信号通路中PERK通路的检测(磷酸化真核翻译起始因子2α)和FJB染色海马神经元死亡结果观察，来推测海马CA1区内注射衣霉素后主要通过诱导内质网应激的关键未折叠蛋白反应信号通路PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径来介导海马神经元凋亡的发生。
内质网应激在细胞凋亡的调控中有重要意义，内质网应激和蛋白质错误折叠与各种神经退行性疾病密切相关^[8]。海马CA1区被认为是海马传出的门户，是脑内参与记忆贮存功能的重要部位，也是海马内对损伤最敏感的部位^[27]，有研究发现糖尿病脑病早期海马CA1区与海马生长相关蛋白就已发生了变化，CA1区是神经退行性变相关疾病研究中给药较理想的部位^[13，16]。基于此，本实验设计创新的应用脑立体定位仪直接在海马CA1区内注射红藻氨酸或衣霉素诱导海马神经元凋亡，并致力于阐明海马内注射衣霉素后第5小时出现海马神经元同侧给药对侧死亡现象的发生过程及机制。前期在衣霉素地不断实验中显示^[1]：高浓度衣霉素(2 g/L)海马内注射后第4小时段海马CA1-3区KA1亚受体和磷酸化真核翻译起始因子2α表达上调处明显在针头注射的同侧，对侧未见明显表达上调；而衣霉素第5 h段KA1亚受体和磷酸化真核翻译起始因子2α表达上调处未见针头，而对侧在前期实验过程中并没有拍摄，可能对侧由于取材染色切片的平面不在针头平面(因每只小鼠的上百张脑片中，切面在针头处仅几张)，或者是由于前期实验并未注意对侧，所以前期实验并未发现海马神经元在衣霉素 5 h时的同侧给药对侧死亡现象，总结前期实验基础上，发现衣霉素海马CA1区内注射诱导海马神经元凋亡过程与红藻氨酸大有不同，存在衣霉素海马内注射后神经元同侧给药对侧死亡现象。根据实验结果和总结以往研究的基础上，推测海马内注射高浓度衣霉素诱导内质网应激介导神经元死亡途径为：高浓度衣霉素注射4 h后注射同侧海马神经元达到凋亡时间阈值，并迅速凋亡达峰值，且同时凋亡迅速向对侧蔓延，注射5 h后针头注射同侧海马神经元已通过凋亡介导死亡检测不到凋亡标志物，而对侧于衣霉素注射第 5 h海马神经元迅速凋亡达峰值。高浓度衣霉素海马内注射诱导海马神经元凋亡的过程持续时间短暂，出现海马神经元同侧给药对侧死亡的现象，是由于海马内注射衣霉素后随着药物浓度的扩散在4.0-5.0 h间神经元凋亡可能有一个由同侧向对侧迅速蔓延的过程，这是不同于红藻氨酸海马内注射诱导海马神经元凋亡过程的又一新的发现。2015年3月18日Nature杂志在线发表了著名华人科学家Wei Gu团队[26]在细胞凋亡和p53介导的非凋亡形式的细胞死亡——“铁死亡”的最新发现，很大程度上更新的人们对凋亡和“铁死亡”的认知。作者利用红藻氨酸KA1亚受体拮抗剂在神经元死亡中对大脑活动无明显有害影响优点和内质网应激在神经退行性疾病海马神经元凋亡研究热点的前提下^[16]，创新得引入体外经典的内质网应激诱导剂衣霉素，并成功地将其直接海马CA1区内注射诱导内质网应激介导神经元凋亡^[1]，且在不断实验中发现高浓度衣霉素海马内注射后海马神经元损伤同侧给药对侧死亡现象，阐明这一新现象，对衣霉素体内(海马内)应用诱导内质网应激提供了初步理论。衣霉素诱导海马神经元内质网应激的每一点进步，对研究内质网应激介导海马神经元凋亡的产生机制和阻断KA1亚受体在神经元凋亡中的保护作用都有进步意义，对神经退行性变相关疾病^[8]，如糖尿病脑病、帕金森病、阿尔茨海默病等的临床研究及药物作用靶点的寻找有重要的价值和临床应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

衣霉素海马内给药诱导海马神经元死亡的新现象与假说

Tunicamycin-induced neuronal death in the hippocampus: new phenomenon and new hypothesis

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	赵祥, 魏翠兰, 张业廷. 神经发生和炎性环境在运动条件下的改变与调节[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 813-820.
[5]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[6]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[7]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[8]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[9]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[10]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[11]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[12]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[13]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[14]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.
[15]	刘畅, 李大同, 刘元, 孔令擘, 郭瑞, 杨利学, 郝定均, 贺宝荣. 急性症状性骨质疏松性胸腰椎压缩骨折椎体强化手术后疗效欠佳：与骨水泥、骨密度、邻近骨折的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3510-3516.