体外培养条件下兔脊柱运动节段髓核组织的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.008

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (51): 8241-8246.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.008

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体外培养条件下兔脊柱运动节段髓核组织的变化

冯敏山¹，展嘉文¹，朱立国¹，张平²，王源²，白建琦²

中国中医科学院望京医院，¹脊柱二科，中医正骨技术北京市重点实验室，
²病理科，北京市 100102

收稿日期:2015-10-07 出版日期:2015-12-10 发布日期:2015-12-10
通讯作者: 展嘉文，博士，医师，中国中医科学院望京医院脊柱二科，北京市 100102
作者简介:冯敏山，男，1979年生，广州省人，汉族，2013年中国中医科学院毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱退行性疾病研究。
基金资助:
骨关节退行性病变中医防治创新团队(YS1304)；骨与关节退行性病变研究专项课题(WJYY2014-ZX-06)

Changes of the nucleus pulposus after in vitro culture of rabbit spinal motion segments

Feng Min-shan¹, Zhan Jia-wen¹, Zhu Li-guo¹, Zhang Ping², Wang Yuan², Bai Jian-qi²

¹Second Department of Spine, Beijing Key Laboratory of Palasy Technology, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China; ²Department of Pathology, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China

Received:2015-10-07 Online:2015-12-10 Published:2015-12-10
Contact: Zhan Jia-wen, M.D., Physician, Second Department of Spine, Beijing Key Laboratory of Palasy Technology, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China
About author:Feng Min-shan, M.D., Attending physician, Second Department of Spine, Beijing Key Laboratory of Palasy Technology, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China
Supported by:
TCM Innovation Team of Prevention and Control Osteoarticular Degenerative Diseases, No. YS1304; Bone and Joint Degenerative Diseases Subject Research, No. WJYY2014-ZX-06

摘要/Abstract

摘要：

背景：椎间盘器官体外培养模型作为体内试验和细胞培养的联系，能够在原生基质中维持细胞活性，从而保留了重要的细胞与细胞及细胞与基质的相互作用。
目的：观察体外培养兔脊柱运动节段模型髓核组织的变化。
方法：将13只新西兰白兔处死后在无菌条件下取出脊柱运动节段50个，在高渗培养基中进行整体培养 (410 mOsm/kg)，于培养前及培养后第3，7，14，21天，各取10个椎间盘分别进行苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学、蛋白多糖含量和髓核细胞活力测定。
结果与结论：培养14 d苏木精-伊红显示椎间盘组织结构基本保持完整，21 d椎间盘组织形态学破坏；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色强度14 d无显著差异(P > 0.05)，21 d染色变浅，与之前各时间点相比有显著差异(P < 0.05)；蛋白多糖PAS/AB染色7 d内强度无降低，14 d强度有所减弱，21 d染色强度进一步减弱；髓核细胞荧光检测21 d髓核细胞荧光强度减弱，细胞活性降低，与之前各时间点比较差异明显(P < 0.05)。结果表明，培养14 d兔脊柱运动节段椎间盘髓核组织退变不显著，培养21 d模型髓核退变明显，脊柱运动节段目前在14 d内可作为研究生物力学对椎间盘影响的体外实验模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 椎间盘, 脊柱运动节段, 体外培养, 髓核, 兔

Abstract:

BACKGROUND: In vitro organ culture model of the intervertebral disc as a contact between in vivo tests and cell culture can maintain cell activity in a native matrix, thus retaining the important cell-cell and cell-matrix interactions.
OBJECTIVE: To observe the changes in the nucleus pulposus during in vitro culture of rabbit spinal motion segments.
METHODS: A total of 50 spinal motion segments were harvested from 13 New Zealand white rabbits under aseptic conditions. These specimens were maintained for organ culture with hyperosmotic media (410 mOsm/kg), then 10 discs were observed by hematoxy-eosin staining and immunohistochemistry of type II collagen as well as proteoglycan content and viability of nucleus pulposus cells were determined before and at 3, 7, 14, 21 days after culture, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed the structure of intervertebral disc tissue remained intact after 14 days of culture, but severely degenerated at 21 days of culture. The intensity value of type II collagen immunohistochemical staining in the nucleus pulposus had no significant changes within 14 days (P > 0.05), but the staining became shallow at 21 days, which was significantly different from that at 3, 7, 14 days
(P < 0.05). PAS/AB staining of proteoglycan of the nucleus pulposus showed no decrease in tinting strength within 7 days, but the strength became weakened slightly at 14 days and further weakened at 21 days. The intensity value of fluorescence staining of nucleus pulposus cells decreased at 21 days and the viability of nucleus pulposus cells decreased significantly as compared with that at 3, 7, 14 days (P < 0. 05). These findings indicate that the degeneration of the nucleus pulposus of rabbit spinal motion segment showed no significant changes at 14 days of culture, but became remarkable at 21 days of culture, indicating that the spinal motion segement can be used as an in vitro experimental model to study the biomechanical changes of the intervertebral disc within 14 days of culture.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中图分类号:

R318

冯敏山，展嘉文，朱立国，张平，王源，白建琦. 体外培养条件下兔脊柱运动节段髓核组织的变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(51): 8241-8246.

Feng Min-shan, Zhan Jia-wen, Zhu Li-guo, Zhang Ping, Wang Yuan, Bai Jian-qi. Changes of the nucleus pulposus after in vitro culture of rabbit spinal motion segments [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(51): 8241-8246.

图/表（结果） 4

2.1 组织学观察模型培养前椎间盘苏木精-伊红染色可见中央致密的髓核与周围同心圆排列的纤维环结构，髓核内富含细胞与基质，分布均匀，纤维环层次清楚，与髓核组织界限清晰；培养至7 d基本有效维持了椎间盘结构的完整性；培养14 d纤维环出现部分裂伤，髓核与纤维环出现部分断离，但完整性仍好；21 d纤维环排列紊乱、与髓核组织明显分离、髓核细胞数目减少、轻度分散、组织结构轻度分解，与培养前相比有明显改变(图1)。

2.2 蛋白多糖检测 PAS/AB染色组织中的蛋白多糖，其中过碘酸一雪夫氏(PAS)染色呈紫红色主要反映中性蛋白多糖含量，阿利新蓝(AB)染色主要反映基质中酸性蛋白多糖(硫酸软骨素)的含量，细胞周围呈深蓝色，基质呈淡蓝色。培养前髓核内蛋白多糖染色均匀，深蓝色与紫红色着色明显；与培养前相比，培养至7 d蛋白多糖着色均匀，但细胞数目轻度减少，培养14 d着色强度减弱，细胞数目减少，培养21 d着色进一步减弱，改变明显(见图2)。

2.3 免疫组织化学观察培养前椎间盘Ⅱ型胶原免疫组织化学检测可见髓核细胞外基质呈棕黄色染色，颜色较深；模型培养至7 d髓核细胞及基质组织内呈棕褐色阳性反应，至14 d染色不均匀，但染色强度与培养前相比无显著差异(P > 0.05)，21 d染色变浅，与之前各时间点比较均差异显著(P < 0.05)，见图3、表1。

2.4 细胞活性检测 Mitotracker Green荧光检测，培养前椎间盘髓核细胞活力好、数量多，荧光强度较高；培养至7 d髓核细胞荧光强度无明显变化，培养14 d时强度略有降低，但与培养前比较仍无显著差异(P > 0.05)，培养21 d时强度降低明显，与培养前及其余各时间点比较差异显著(P < 0.05)，见图4、表1。

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引言

材料方法

1.1 设计单一样本观察。
1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年2月在中国中医科学院望京医院及中医正骨技术北京市重点实验室完成。
1.3 材料 4-6月龄健康新西兰兔13只，雌雄不限，体质量2.5-3.0 kg，中国中医科学院实验动物中心提供。
1.4 实验方法
1.4.1 脊柱运动节段模型建立实验新西兰兔麻醉后，耳缘静脉给予肝素钠，5 min后空气栓塞处死，带入超净工作台，立即在无菌条件下自背部纵切口，自尾部完整取出腰段及下位胸段脊柱，入高渗肝素PBS冲洗。在2.5倍放大镜下应用咬骨钳、手术刀片切取T12/L1、L2/L3、L4/L5、L6/S1(4节段)椎间盘运动节段，自相邻椎间盘的软骨终板与骨性终板结合处锐性分离，得到50个完整椎间盘运动节段，包括髓核(NP)、纤维环(AF)及上下软骨终板(EP)及相邻椎体(VB)。用带有18号针头的无菌注射器吸取含肝素的高渗PBS冲洗标本表面的碎屑及终板上的血凝块，于含肝素的HBSS液(含1 000 U/mL青霉素，1 g/L 链霉素)中漂洗2 min后放入六孔板中。
1.4.2 椎间盘组织学观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、蛋白多糖含量和髓核细胞活力测定两组六孔板中予细胞培养液DMEM(含有20%胎牛血清、25 mg/L 抗坏血酸、 50 g/L庆大霉素，并用NaCl将细胞培养液的渗透压调整到 410 mOsm/kg[2])。两组均置于体积分数5% CO2、37 ℃恒温培养箱进行整体培养，每两天更换培养液。分别在培养前(0 d)和培养后第3，7，14，21天，取10个椎间盘分别进行椎间盘组织学观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、蛋白多糖含量和髓核细胞活力测定。
1.5 主要观察指标
1.5.1 组织学观测每个时间点取椎间盘 5个，体积分数10%甲醛固定，EDTA脱钙，石蜡包埋，切取一半行连续切片，厚4-6 μm，另一半行免疫组织化学检测，切片应用标准苏木精-伊红染色方法观察两组椎间盘的组织学变化。
1.5.2 免疫组织化学染色每个时间点用5个组织学观测中的另一半椎间盘，使用Ⅱ型胶原抗体对髓核组织切片行免疫组织化学染色观察，应用NIS-Elements D2.30图像分析系统对Ⅱ型胶原免疫组织化学染色切片行Ⅱ型胶原半定量分析。
1.5.3 髓核蛋白多糖检测每个时间点应用组织学观测中的5个椎间盘，切片后常规脱蜡，脱水入水，3%醋酸水溶液(pH 2.5)略漂洗，阿利新蓝染液(pH 2.5)染5 min，流水冲洗后入蒸馏水，1%高碘酸水溶液5 min，蒸馏水充分漂洗，雪夫试剂15 min，流水冲洗10 min，苏木精淡染后水洗使胞核显淡蓝色，无水乙醇冲洗及脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，倒置显微镜下观察拍片。
1.5.4 细胞活性检测每个时间点取椎间盘 5个，尖刀切开椎间盘纤维环，用无菌小刮匙将髓核刮出至含有5 μmol/L Mitotracker Green工作液的无血清培养基中，在37 ℃培养箱中染色1 h，离心并倾倒上清液，用不含荧光染料的无血清培养液吹洗2次，在新鲜无血清培养基中培育1h，倾倒上清液并用PBS吹洗2遍后，将组织浸入载玻片上的PBS中，盖上盖玻片。荧光显微镜进行观察，髓核组织中有活性的细胞线粒体被 Mitotracker Green染色而发出绿色荧光。采用 NIS-Elements D2.30图像分析系统进行灰度值比较。
1.6 统计学分析应用SPSS 16.0统计学软件，所有计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

尽管对椎间盘退变有大量的研究，但对生物和机械途径综合导致椎间盘退变的机制仍不清晰^{[6- 8]}，治疗退行性椎间盘疾病也多限于提供减轻症状的疗法，这种治疗上的不足很大程度是由于缺乏对该病生化和分子学机制的详细了解^[9]，因此构建理想的实验模型对椎间盘退变的发病机制和临床研究有非常重要的意义。
3.1 椎间盘退变体外模型
3.1.1 椎间盘退变体外器官培养模型体内模型提供了大量研究椎间盘退变的生化信息，也对引起和阻止椎间盘退变的生物力学方面做了许多研究，但由于对体内环境缺乏严密的控制与监视，故很难控制所有生物化学与生物力学因素，不利于研究特定因素对椎间盘退变的影响^[10-11]；体外细胞培养技术被广泛采用，该模型可以观察椎间盘细胞生长、增殖、分化过程的生物学特点和对不同干预措施的反应，但由于失去了特有的细胞外基质环境，导致椎间盘细胞营养系统的改变，难以维持原有的细胞特性以及各种类型细胞之间的相互作用，细胞增殖率低、表型易缺失^[12]，达不到研究的目的^[13]。将完整的椎间盘在体外进行整体培养，能够在可控的条件下研究椎间盘代谢和退变的相关机制，为观察椎间盘对外界刺激的反应和正常与退变椎间盘的组织学变化创造了良好的实验平台^{[2，11，14-26]}。
3.1.2 体外培养脊柱运动节段模型相关研究认为对于该类体外培养模型没有椎体和终板可以使营养物更好的扩散至椎间盘内部^[23，26]，以促进细胞的生存能力，但除去终板使椎间盘的完整性被破坏，不适合长期培养研究^[24]，另有许多实验保留了终板与椎体^{[2，14-15, 27]}，实际上终板作为椎间盘整体的一部分通过锚定纤维环和防止髓核组织错位可以维持椎间盘整体的生物学性质，并且终板通路是椎间盘的主要营养供给通路^[11]，所以取材时应当带有终板组织以观察椎间盘整体器官的性质。在此基础上，为了更好的研究椎间盘生物力学，Lim等^[27]培养了大鼠的脊柱运动节段，包括两端完整椎体及椎间盘器官，该模型培养14 d后组织形态保持良好，故认为该模型可被广泛应用于椎间盘生物力学的研究。该模型一方面更接近体内环境，另一方面为加载装置提供了固定的施力处，为进一步控制和研究生物力学对椎间盘的影响提供条件。Seol等^[28]还对体外培养的SD大鼠和新西兰白兔腰椎运动节段进行了比较，结果表明兔的椎间盘更加稳定，对于生物力学的研究兔脊柱运动节段更加适合。因此本实验选择新西兰兔脊柱运动节段作为培养对象。另外，以上研究培养周期仅为14 d，本实验延长培养周期至21 d，以进一步观察该类模型长期培养后的组织变化。
3.2 培养条件
3.2.1 防止组织膨胀研究表明离体后椎间盘器官容易出现肿胀现象^[3，29]。在体外培养中缺少负荷将使间盘不受约束的膨胀，引发蛋白多糖减少导致失衡。一些研究采取了控制膨胀的方法：如用聚乙二醇调整介质的渗透浓度[25]，利用藻酸盐凝胶降低组织膨胀。目前通过调节渗透压、取材时带有终板等措施可在无外力加载环境下维持该类模型的形态、防止过度膨胀。Haschtmann等^[18]培养时加蔗糖使渗透压达到485 mosmol/kg，结果显示培养4周后渗透刺激使最初降低的细胞脱氢酶活性恢复，相关基因表达可以被推迟下降；Risbud等^[2]也调整培养液至高渗态，成功维持了大鼠椎间盘的细胞形态、减少了组织膨胀。本研究中细胞培养液DMEM/F12的渗透压约为300 mOsm/kg的等渗状态，在该培养液中加入80 mmol/L的NaCl调整培养液渗透压至410 mOsm/kg的高渗状态，结果表明短时期内在高渗状态下能够维持椎间盘结构与功能。
3.2.2 抗凝处理本实验中模型保留了终板组织，使椎间盘整体的生物学特性得以维持，但终板毛细血管内的血液在取材过程中可能会凝结成块，堵塞椎间盘的营养通路与液体流通，影响椎间盘内部的营养供应^[23]。为此实验在处死动物前使用了肝素钠防止动物死后凝血过快，取到标本后立即用含肝素的高渗PBS冲洗表面，除去碎屑及终板上的血凝块，并于含肝素的HBSS液中漂洗2 min以疏散终板血管内凝血。以上措施对保持椎间盘营养通路的通畅，维持细胞性能起到重要作用[11]，实验结果表明，经抗凝处理后的椎间盘器官可维持活性及功能达21 d。
3.3 培养的评价指标椎间盘组织和细胞活力、功能及代谢的检测是评价椎间盘体外培养系统优劣的必备条件。
3.3.1 组织学检查苏木精-伊红染色法能显示椎间盘组织的结构形态^[31]，本实验横切面观察显示培养14 d模型有效维持了椎间盘髓核和纤维环结构的完整性，至21 d出现明显退变。
3.3.2 蛋白多糖检测基质的变化反映了细胞合成代谢的功能，蛋白多糖主要由髓核细胞分泌，具有重要功能，其丢失是椎间盘退变的标志，相关研究常通过多种方法测定蛋白多糖的含量^{[2，11，28，38，31]}。本实验应用PAS/AB染色法观察GAG的变化，该法中PAS染色呈紫红色反映中性蛋白多糖含量，阿利新蓝(Alcian Blue AB)染色反映中酸性蛋白多糖的含量^[32]，培养14 d内GAG含量无明显改变，培养21 d着色强度有所减弱，表明蛋白多糖含量21 d时有所减少。
3.3.3 Ⅱ型胶原的测定除了蛋白多糖，胶原也是椎间盘基质内最主要的成分，对于基质结构和功能的完整性不可或缺。Ⅱ型胶原含量下降可导致椎间盘结构变形、破坏，与退变程度密切相关^[33]，本实验应用免疫组化检测Ⅱ型胶原含量，显示与培养前相比14 d时髓核细胞及基质组织内Ⅱ型胶原含量仍然较高，21 d时含量显著减少。
3.3.4 细胞活性检查髓核细胞活性可用多种方法检测，荧光标记法^[3]、复染法为常用的检测手段^[27，34]。实验用Mitotracker Green荧光测定髓核细胞活性，Mitotracker Green为线粒体高选择性荧光染料，活细胞能够被染色并在荧光显微镜下发出绿色荧光^[35-36]。相关研究用该法测定，显示培养的椎间盘器官可以维持髓核细胞活性4周^[32]。本实验培养前髓核细胞活力好、数量多，有较高的荧光强度，14 d内髓核荧光强度逐渐降低，21 d降低明显。
综上所述，本研究在体外条件下培养了兔脊柱运动节段21 d。结果表明14 d时椎间盘髓核的活性与功能与新鲜取材时标本相似，但21 d时显示出明显的退变。其原因可能是由于椎间盘的营养主要通过软骨终板通路供应，血管内的营养物质经软骨终板渗透入内部^[29]，而椎体会阻碍营养物质的扩散^[37]。虽然作者在操作过程中进行了抗凝处理以期保持营养供应的通畅，可椎体在一定程度上还是会阻碍部分培养液的渗透，短期内存活的细胞尚可代偿以平衡基质的分解代谢^[38]，随培养时间延长其营养障碍最终导致细胞性能整体下降，从而导致退变，因此该模型目前只适合在短周期内(14 d)作为体外实验模型。但脊柱运动节段为加载装置提供了固定的施力处，且使椎间盘更接近体内环境，所以在14 d内仍可作为研究生物力学对椎间盘影响的理想模型，为作者下一步控制和观察力学刺激对椎间盘生化与退变的研究提供条件。作者也将对该体外培养体系不断改进以长期维持模型的细胞性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

体外培养条件下兔脊柱运动节段髓核组织的变化

Changes of the nucleus pulposus after in vitro culture of rabbit spinal motion segments

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