垂体腺苷酸环化酶激活肽拮抗lactacystin细胞毒性的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.016

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (46): 7461-7465.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.016

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垂体腺苷酸环化酶激活肽拮抗lactacystin细胞毒性的作用

管丽娜¹，冀永强²，巴茂文³，连培文⁴，李宁⁴，牟贤玉¹，于国平³

烟台毓璜顶医院，1急诊科，2肾内科，3神经内科，4中心实验室，山东省烟台市 264000

收稿日期:2015-08-18 出版日期:2015-11-12 发布日期:2015-11-12
通讯作者: 于国平，博士，主任医师，教授，硕士生导师，烟台毓璜顶医院神经内科，山东省烟台市 264000
作者简介:管丽娜，女，1979年生，山东省蓬莱市人，汉族，2014年青岛大学毕业，硕士，主治医师，主要从事神经变性疾病及神经危重症研究。并列第一作者：冀永强，男，1979年生，山东省聊城市人，汉族，2005年青岛大学毕业，硕士，主治医师，主要从事肾脏病研究。
基金资助:
山东省自然科学基金(ZR2010HM117)；烟台市科技计划项目(2010148-6)

Mechanism of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide against the cytotoxicity of lactacystin

Guan Li-na¹, Ji Yong-qiang², Ba Mao-wen³, Lian Pei-wen⁴, Li Ning⁴, Mu Xian-yu¹, Yu Guo-ping³

1Department of Emergency, 2Department of Nephrology, 3Department of Neurology, 4Central Laboratory, Yantai Yuhuangding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China

Received:2015-08-18 Online:2015-11-12 Published:2015-11-12
Contact: Yu Guo-ping, M.D., Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Neurology, Yantai Yuhuangding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China
About author:Guan Li-na, Master, Attending physician, Department of Emergency, Yantai Yuhuangding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China Ji Yong-qiang, Master, Attending physician, Department of Nephrology, Yantai Yuhuangding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2010HM117; the Scientific Plan Project of Yantai City, No. 2010148-6

摘要/Abstract

摘要：

背景：帕金森病的发病机制未明确，目前尚没有有效的治疗方法能从根本上阻止其病程进展。

目的：分析垂体腺苷酸环化酶激活肽对lactacystin诱导的帕金森病多巴胺能PC12细胞凋亡的影响及其分子机制。

方法：用神经生长因子将PC12细胞诱导分化成神经元的细胞模型，经不同浓度泛素-蛋白酶体抑制剂lactacystin处理，分别作用不同时间，取细胞存活约为50%的lactacystin作用浓度与时间，建立帕金森病细胞实验模型。实验分组：对照组、lactacystin组、垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27干预组(干预1组)、垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27和垂体腺苷酸环化酶激活肽6-27共同干预组(干预2组)。观察各组细胞形态变化；MTT法检测细胞活力；免疫印迹(Western blot)法检测内质网应激特异性蛋白caspase-12的表达情况。并观察垂体腺苷酸环化酶激活肽1-26及垂体腺苷酸环化酶激活肽6-27对lactacystin毒性作用的影响。

结果与结论：不同浓度及作用时间的lactacystin处理PC12细胞后，细胞活力呈浓度及时间依赖性下降，其中lactacystin 20 μmol/L作用24 h使细胞活力下降约50%。在相同的lactacystin作用条件下(20 μmol/L，24 h)，与对照组比较，lactacystin组细胞发生损伤性改变，细胞活力降低，caspase-12活性明显升高(P < 0.01)；与lactacystin组比较，干预1组细胞损伤性改变明显好转，细胞活力增强，下调凋亡蛋白caspase-12的表达 (P < 0.01)。干预2组细胞状态则明显不如干预1组，与lactacystin组相差不大。结果提示泛素-蛋白酶体抑制剂lactacystin引起内质网应激导致细胞损伤；垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27通过调节上述信号通路发挥保护作用。而作为垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27的受体拮抗剂，垂体腺苷酸环化酶激活肽6-27则减弱了垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27的这一作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 帕金森病, PACAP, lactacystin, 内质网应激, 细胞毒性, 细胞保护, 细胞形态, 细胞活力, caspase-12, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Pathogenesis of Parkinson’s disease is not completely understood, and there is yet no effective therapy that can prevent the neurodegenerative process of the disease fundamentally.
OBJECTIVE: To explore the effects of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) on lactacystin-induced Parkinson’s disease dopaminergic PC12 cell apoptosis and its molecular mechanism.
METHODS: Under induction by nerve growth factors, PC12 cells differentiated into dopaminergic neurons, and then were treated with different concentrations of lactacystin for different time. When the cell survival rate was about 50%,
the concentration and action time oflactacystin were selected to establish cell models of Parkinson’s disease. In the study, there were control group, lactacystin group, PACAP1-27 group (intervention group 1) and PACAP1-27+PACAP6-27 co-intervention group (intervention group 2). Changes of cell morphology were observed under inverted microscope; cell viability was detected with MTT method; the expression of endoplasmic reticulum stress specific protein caspase-12 was detected by western blot. Then the action of PACAP1-27 and PACAP6-27 to the cytoxicity of lactacystin was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: With different concentrations and action time of lactacystin, the viability of PC12 cells presented a concentration- and time-dependent decline. When the lactacystin at 20 μmol/L acted for 24 hours, the cell viability was declined by about 50%. Under same conditions of lactacystin concentration and action time (20 μmol/L, 24 hours), the cells in the lactacystin group appeared to have damaged changes, declined cell viability, and increased caspase-12 activity in comparison with the control group (P < 0.01). Compared with the lactacystin group, the cell damage was relieved and cell viability was increased significantly in the intervention group 1 as well as the expression of caspase-12 was decreased (P < 0.01). Experimental findings in the intervention group 2 were similar to those in the lactacystin group. These results suggest that lactacystin, an ubiquitin proteasome inhibitor, can lead to cell damage; PACAP1-27 plays a protective role by regulating the above-mentioned signal pathway. As one PACAP1-27 receptor antagonist, PACAP6-27 can attenuate this effect of PACAP1-27.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Parkinson Disease, Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide, PC12 cells, endoplasmic reticulum, Caspase-12

管丽娜，冀永强，巴茂文，连培文，李宁，牟贤玉，于国平. 垂体腺苷酸环化酶激活肽拮抗lactacystin细胞毒性的作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(46): 7461-7465.

Guan Li-na, Ji Yong-qiang, Ba Mao-wen, Lian Pei-wen, Li Ning, Mu Xian-yu, Yu Guo-ping. Mechanism of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide against the cytotoxicity of lactacystin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(46): 7461-7465.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

帕金森病是种常见的神经系统变性疾病，临床上主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势步态障碍。作为常见的神经退行性疾病之一，其在65岁以上人群中帕金森病的发病率为1%，给社会及家庭带来沉重负担。目前帕金森病病因尚不明确，所有治疗都是控制症状，不能根治。以左旋多巴等为主的主要治疗，长期用药会出现一系列的临床问题，至今尚未得到有效解决。帕金森病的病理特征是中脑黑质纹状体系统多巴胺能神经元变性死亡，导致脑内多巴胺神经递质减少，及残余多巴胺能神经元出现路易小体。其黑质区的泛素蛋白酶体系统存在结构和功能异常，在多巴胺能神经元变性坏死中起重要作用。泛素蛋白酶体是由多个调节及催化亚单位构成的26S/20S复合体，是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解系统，通过对细胞内异常蛋白的清除，维持内环境稳定。目前认为泛素蛋白酶体系统在帕金森病的发病机制中发挥重要作用。
垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，pACAP)是1989年Miyata研究下丘脑促垂体激素时，在绵羊下丘脑组织中发现并提取出来的具有极强腺苷酸环化酶活性作用的神经多肽，广泛分布于中枢和外周神经系统中，能够促进神经元生长[1]。PACAP具有抗氧化应激[2]、抗炎、抗凋亡、调控基因等多种生物活性，其中抗凋亡作用是通过调控caspase-12等细胞凋亡相关调控基因来实现的。近期的研究发现PACAP对包括兴奋性氨基酸及β淀粉样蛋白、朊蛋白等造成的体外神经细胞损伤模型具有明显的保护作用[3]。PACAP以其本身无毒性，易透过血脑屏障，可静脉、鼻内或脑室内注射应用简便等优势而有望成为治疗神经变性疾病的新兴候选药[4-5]。
Lactacystin通过作用于内质网应激特异性蛋白Caspase-12引起内质网应激导致细胞损伤，从而使多巴胺能细胞呈现类似帕金森病表现[6]，PACAP通过拮抗上述信号通路发挥保护作用，但具体涉及胞内信号转导途径及相关的分子机制的报道比较少见。因此，本实验采用体外培养的PC12细胞，以泛素-蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导内质网应激作为帕金森病细胞模型[7]，对PACAP是否能有效抑制lactacystin诱导的细胞凋亡及其细胞内分子机制进行研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验研究。

1.2 时间及地点实验于2011年10月至2013年6月在烟台毓璜顶医院中心实验室完成。

1.3 材料 PC12细胞购自中科院上海生物化学和细胞生物学研究所细胞库；二喹林甲酸蛋白检测试剂盒(Pierce，美国)；兔抗大鼠caspase-12抗体(abcam，英国)；lactacystin (cayman公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养与分组用神经生长因子将鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞诱导分化成神经元的细胞模型。

PC12细胞在含体积分数10%胎牛血清、1640培养液中，体积分数5%CO₂，37 ℃培养箱中培养，隔天换液，当单层培养细胞汇合以后，接种传代培养。PC12细胞培养液中加入0.1 ng/L神经生长因子进行诱导分化，共7 d。PC12细胞诱导为多巴胺能神经元样细胞后，按上述培养法进行传代培养。实验分为对照组、lactacystin组(20 μmol/L)、PACAP1-27(1×10^-8)干预的帕金森病模型组(干预1组)、PACAP1-27(1×10^-8)和PACAP6-27(1×10^-5)共同干预的帕金森病模型组(干预2组)。

1.4.2 细胞形态学观察予药物干预24 h后，各组细胞置于倒置显微镜下，观察细胞形态并摄像，观察神经元及轴突数目变化。
1.4.3 噻唑蓝比色法检测上述每个实验组设4个复孔，同时设与实验孔平行的空白对照，即除了不含细胞外其他条件相同的对照孔，最后比色时以对照孔调零。培养细胞于传代接板24 h(进入对数生长期)后，加入不同药物处理24 h，进行MTT细胞活性检测。孵育24 h后，每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，37 ℃，体积分数5%CO₂培养4 h，弃培液，加入200 μL二甲基亚砜，37 ℃孵育20 min，至颗粒溶解，在酶标仪上测定570 nm的吸光度(A)值，减去对照孔的A值作为净A值，记录结果。细胞存活率=(加药组A值-不加细胞组A值)/(不加药对照组A值-不加细胞组A值)×100%。

1.4.4 Western blot检测细胞经药物分别处理24 h，常规收集细胞，1×十二烷基硫酸钠缓冲液裂解细胞，二喹林甲酸蛋白检测试剂盒蛋白定量。取各组蛋白质15 μg，12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h(90 V，0.5 h；150 V，1 h)，电转膜(200 mA，1.5 h，BIO-RAD电泳及转膜装置，美国)，5 %脱脂奶粉封固1 h，分别加入磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、兔抗大鼠caspase-12抗体1∶500于4 ℃孵育过夜，次日分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，室温孵育1 h后行化学发光法显示结果。计算目的条带蛋白的吸光度值。为减少差异，结果以该条带蛋白的吸光度值/ GAPDH的比值来表示该蛋白表达的相对水平。

1.5 主要观察指标 ①PC12细胞形态学观察结果。②各组细胞存活率比较。③内质网应激相关蛋白caspase-12比较。

1.6 统计学分析采用SAS 6.12统计软件，实验数据以 x(_)±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

帕金森病是中枢神经系统变性疾病，多发生于老年人，病因未明^[8]，其主要病理表现是中脑黑质多巴胺能神经元的选择性变性死亡，纹状体多巴胺含量明显减少，以神经细胞胞浆中路易小体形成为主要特征^[9-10]。利用lactacystin建立伴有路易小体的帕金森病模型，不仅揭示了黑质细胞蛋白酶体功能削弱，不能及时清除胞浆内α-突触核蛋白等蛋白，是引起路易小体形成、黑质变性最终导致帕金森病的一个重要因素^[8^，^11-12]，为进一步研究帕金森病提供了较为理想的实验模型^[13-14]，了解多巴胺神经元变性的机制，开发新的治疗及预防策略以预防神经元损伤，是目前帕金森病研究的主要方向^[15]。

Lactacystin是链霉菌的一种代谢产物，可有效特异性抑制20S蛋白酶体的活性，可消弱及抑制细胞的异常蛋白清除能力，泛素蛋白酶体功能缺陷导致多巴胺能神经元内蛋白聚集体沉积，诱发内质网应激，导致细胞变性坏死。

PC12细胞以其在形态、生理、生化功能特别是膜受体及递质合成上与中脑多巴胺能神经元十分接近的特性而通常被视为体外替代多巴胺能神经元的细胞模型^[16]。因此本实验选择lactacystin诱导的PC12细胞毒性模型进行神经肽PACAP1-27保护效应的研究。本研究发现lactacystin对PC12细胞的活力影响呈剂量依赖性的下降，且在低剂量 (5 μmol/L)即出现毒性作用，说明低剂量接触lactacystin就可以造成细胞损伤；并且通过倒置显微镜观察发现其诱导的细胞死亡以细胞核固缩凋亡为主，进一步证实了lactacystin具有致凋亡的神经毒性作用，是一种较为理想的体外帕金森病细胞模型诱导剂。

PACAP由38个氨基酸残基组成，属于促胰液素/胰高血糖素/血管活性肠肽家族，PACAP的第28个氨基酸—甘氨酸跟随着2个碱性氨基酸，此处可裂解产生具有27个氨基酸残基的PACAP27，所以PACAP有两种结构形式：PACAP27和PACAP38，其中PACAP27能够通过非饱和性的跨膜扩散方式而自由穿越血脑屏障，而PACAP38则无此功能。PACAP的受体有3类：PAC1、VPAC1、VPAC2，它们广泛分布于中枢神经系统和外周组织，PAC1受体对PACAP有较高的亲和力高，PAC1受体又由于不同的剪切方式至少可分为8种亚型。PACAP27有两种形式：PACAP1-27，PACAP6-27。PACAP有很高的生物活性，10^-7mol/L即有显著的生理效应。PACAP的功能与结构密切相关，其结构的完整性同它与受体的亲和力及活化腺苷酸环化酶的能力有关。PACAP6-27与受体PAC1的亲和力比PACAP1-27降低300倍；PACAP6-27可作为PACAP1-27的竞争性拮抗剂。

已有的一些研究发现PACAP1-27对包括兴奋性氨基酸及β淀粉样蛋白、朊蛋白等造成的神经细胞损害具有明显的保护作用，而对于PACAP1-27是否对lactacystin诱导的细胞毒性模型具有保护作用则未见报道。本研究显示PACAP1-27可以明显地抑制lactacystin诱导的细胞凋亡。同时实验结果发现PACAP1-27的这种保护效应可以被PACAP/VIPⅠ型受体(即PAC1)特异性拮抗剂PACAP6-27所逆转，并且已有的研究已发现PC12细胞中存在PAC1受体mRNA的表达^[17-18]，因此推测PACAP27抑制lactacystin诱导的细胞凋亡效应可能主要是通过PAC1受体介导的，PAC1受体是lactacystin诱导细胞凋亡过程的关键部位。

大量的研究表明，细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡过程，又被称为程序化细胞死亡，其形态特征为染色质固缩边集、DNA片段化、细胞胞质浓缩、细胞膜皱缩并发泡形成凋亡小体。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-12作为内质网凋亡信号途径在细胞凋亡中起着关键作用，已引起广泛重视^[19-20]。有研究发现内质网应激不能使Caspase-12缺陷鼠引发凋亡，而其他死亡刺激仍可引发其细胞凋亡，这说明Caspase-12与内质网应激介导的凋亡机制有关，而与非内质网应激介导的凋亡无关^[21]。

内质网的主要功能是调节蛋白质的合成与运输。内质网功能紊乱时出现蛋白错误折叠、未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca²⁺平衡紊乱的状态，称为内质网应激^[22-23]。内质网腔内积聚的错误折叠和未折叠蛋白是通过泛素-蛋白酶体或自噬溶酶体途径来降解的^[24]。正常情况下，内质网腔内异常蛋白被转位至胞液中在泛素蛋白酶体作用下迅速降解，而泛素-蛋白酶体功能障碍将使异常蛋白无法被有效清除而诱发内质网应激。

Lactacystin能够特异性抑制20S蛋白酶体的活性，使泛素蛋白酶体功能障碍，消弱及抑制其清除异常蛋白的能力，导致多巴胺能神经元内蛋白聚集体沉积，诱发内质网应激，导致细胞变性坏死。

内质网应激是lactacystin介导的皮质神经元凋亡的主要原因^[25]。Caspase-12是内质网应激活化诱发凋亡的一个特异性指标^[26]。Caspase-12以酶原形式存在于内质网膜细胞质侧，在内质网应激时被特异激活，是内质网应激介导凋亡途径的关键蛋白酶。本研究结果显示：活化Caspase-12蛋白表达在lactacystin处理后24 h明显升高，与细胞凋亡率成平行变化，提示lactacystin亦可诱发内质网应激，通过诱发内质网上相关特异蛋白，最终通过caspase-12介导的内质网特异性凋亡途径有关。Caspase-12被激活后进入细胞液激活其他caspase家族成员来完成凋亡途径。Caspase-12被激活后，表达增高，产生活性片段，进入细胞浆与其他caspase家族成员相互作用，启动特异性的内质网应激相关的凋亡途径。Caspase-12的激活导致了很多系统的疾病:常见的有帕金森病等，提示可以把caspase-12作为疾病防治的靶点。本研究表明PACAP1-27可对lactacystin诱导的caspase-12升高进行了有效抑制，可PACAP6-27可拮抗这种效应，提示PACAP是通过抑制内质网应激来发挥保护作用。

实验以lactacystin处理的分化PC12细胞为帕金森病细胞模型，以分化PC12细胞为对照，以PACAP1-27、PACAP1-27+PACAP6-27分别干预帕金森病模型组，从细胞形态学，MTT法测定细胞活力，Western blot测定caspase-12三方面，来揭示PACAP对帕金森细胞模型的有效治疗作用，同时从内质网应激路径揭示PACAP的神经保护作用。同时作为PACAP1-27的受体拮抗剂，PACAP6-27对PACAP1-27神经保护作用的影响。为进一步理解帕金森病的病理机制提供了理论基础，也为相关药物研发提供了新的药物靶点^[17]。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

垂体腺苷酸环化酶激活肽拮抗lactacystin细胞毒性的作用

Mechanism of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide against the cytotoxicity of lactacystin

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