归巢因子基质细胞衍生因子1/CXCR4在角膜上的分布

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.017

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (46): 7466-7471.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.017

• 组织构建与生物活性因子 tissue construction and bioactive factors • 上一篇下一篇

归巢因子基质细胞衍生因子1/CXCR4在角膜上的分布

张伟¹，黄文志¹，张玉平²

广州市第一人民医院，1老年病科眼科，2血液病科，广东省广州市 510180

收稿日期:2015-10-02 出版日期:2015-11-12 发布日期:2015-11-12
通讯作者: 张玉平，博士，主任医师，广州市第一人民医院血液病科，广东省广州市 510180
作者简介:张伟，女，1975年生，安徽省人，汉族，2011年中山大学眼科中心毕业，博士，副主任医生，主要从事眼前段疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学青年科学基金项目(81300733)，课题名称：角膜缘干细胞移植后内外源性干细胞归巢行为及调控机制的研究

Corneal distribution of stromal cell-derived factor-1 and chemokine receptor-4 as homing factors

Zhang Wei¹, Huang Wen-zhi¹, Zhang Yu-ping²

1Department of Geriatric Opthalmology, 2Department of Blood Diseases, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China

Received:2015-10-02 Online:2015-11-12 Published:2015-11-12
Contact: Zhang Yu-ping, M.D., Chief physician, Department of Blood Diseases, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
About author:Zhang Wei, M.D., Associate chief physician, Department of Geriatric Opthalmology, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81300733

摘要/Abstract

摘要：

背景：基质细胞衍生因子1/CXCR4在介导骨髓移植等组织器官的干细胞归巢中起着重要的作用。对于角膜干细胞移植的归巢和目前角膜上基质细胞衍生因子1/CXCR4的具体分布及含量较为少见。
目的：荧光定量PCR检测大鼠角膜组织中基质细胞衍生因子1/CXCR4基因mRNA的表达水平。
方法：取完整正常大鼠角膜组织，细分为角膜中央区，角膜旁中央及角膜缘区，用荧光定量PCR法(染料法)检测相应部位基质细胞衍生因子1/CXCR4基因mRNA的表达水平。
结果与结论：角膜中央区基质细胞衍生因子1及CXCR4基因mRNA的表达水平分别为0.213±0.015，0.189± 0.02；角膜旁中央区基质细胞衍生因子1及CXCR4基因mRNA的表达水平分别为0.529±0.077，0.285± 0.015；角膜缘区基质细胞衍生因子1及CXCR4基因mRNA的表达水平分别为0.666±0.069，0.258±0.067。结果表明，在大鼠角膜组织中，角膜中央区，周边区及边缘区相应基质细胞衍生因子1及CXCR4的基因mRNA的表达水平均存在着显著性的差异，这种差异性对于角膜缘干细胞缺乏症干细胞移植治疗中细胞的归巢及移行起着重要的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 角膜, 大鼠, 归巢, SDF-1/CXCR4, 荧光定量PCR, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) and chemokine receptor-4 (CXCR4) play an important role in stem cell homing during bone marrow, organ and tissue transplantation. But there are few reports on limbal stem cell transplantation and homing as well as the distribution and content of SDF-1/CXCR4 on the cornea.

OBJECTIVE: To detect the expression levels of SDF-1/CXCR4 mRNA in rat corneal tissue by fluorescence quantitative PCR.

METHODS: The normal rat cornea was taken completely, and subdivided into central cornea, peripheral corneal and limbal area. Fluorescence quantitative PCR method was employed to detect SDF-1/CXCR4 mRNA levels at corresponding positions.

RESULTS AND CONCLUSION: The expression levels of SDF-1 and CXCR4 mRNA were 0.213±0.015 and 0.189±0.02 in the central cornea, 0.529±0.077 and 0.285±0.015 in the peripheral cornea, 0.666±0.069 and 0.258±0.067 in the limbal area, respectively. These data show that there are significant differences in the expression levels of SDF-1 and CXCR4 mRNA in the central cornea, peripheral corneal and limbal area, and these differences exert an important role in cell homing and migration during limbal stem cell transplantation for treatment of limbal stem cell deficiency.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cornea, Receptors, CXCR4, Stem Cells

张伟，黄文志，张玉平. 归巢因子基质细胞衍生因子1/CXCR4在角膜上的分布[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(46): 7466-7471.

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图/表（结果） 3

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引言

角膜位于眼球表面，是高度透明性的组织，具有无血管、光滑、高度透光性的生理特征，占据了正常人眼总屈光力的很大一部分，在眼部是极为重要的屈光介质。它同时还作为眼内结构的外屏障，避免内部结构受到外界刺激，对于保护眼球内部结构的安全起着不可或缺的作用。严重外伤、重度感染、化学烧伤、热烧伤、翼状胬肉反复复发手术等意外或疾病会造成眼球表面组织严重损伤，致使角膜溃疡、混浊、血管化，视力下降成为必然结果，更为严重的会导致盲的发生。而这些角膜盲，很大程度上是由于角膜缘干细胞遭受严重损失，导致代偿能力的极度困乏造成的。由于角膜缘干细胞缺乏严重危及视力，使角膜上皮失去再生和修复的能力，且该病所致失明者在角膜盲患者中占据相当的比例，进行积极有效的治疗被提上日程。

传统的治疗方法为异体穿透性角膜移植，但供体来源非常有限，且条件欠佳的植床加大了植片血管化和溶解的风险，最为常见的并发症为移植排斥反应。结膜或黏膜移植也存在着很大的局限性，因为其组织来源上有别于正常的角膜组织，因而难以恢复眼表正常的形态与功能，新生血管化是一个较为常见的并发症，这将严重导致患者痛苦不堪，难以接受。人工角膜的主要缺点是人工合成材料与人体组织的组织相容性问题，且视野范围小，异物感等缺陷严重导致患者不适。

干细胞移植以其独特的优势，成为当前进行眼表功能重建极具希望前景的治疗方法之一^[1-5]，但角膜材料的短缺导致治疗非常困难^[6-9]。满足治疗数量的角膜缘干细胞的获取和传代培养困难仍是世界性难题^[10-12]，且其修复眼表的作用机制目前尚不清楚。角膜缘干细胞归巢的研究则有助于提高干细胞移植治疗机制的认识，增强干细胞的归巢以提高移植的效率和成功率。

现有研究证实，基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)/CXCR4 轴可能是多种细胞归巢的共同通路，干细胞只对SDF-1/CXCR4 配体显示出反应性的移动，该轴在干细胞归巢的过程中起着决定性的作用^[13-14]。资料查询显示，对于角膜缘干细胞的归巢，SDF-1/CXCR4轴是否发挥作用目前的研究较为少见。

归巢因子SDF-1/CXCR4在角膜上的详细分布当前罕有报道，作者拟通过荧光定量PCR检测大鼠角膜组织中SDF-1/CXCR4基因mRNA的表达水平，以期为角膜缘干细胞缺乏干细胞移植提供较高价值的翔实资料。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点实验于2014年6月至2015年8月在广州市第一人民医院血液病实验室完成。

1.3 材料

实验动物及角膜的取材：健康的SD大鼠，雌雄兼用，体质量为150-200 g。手术显微镜下检查双眼眼前段和附属器，排除眼部病变，同时做双侧角膜荧光素钠染色检查。动物饲养及处死过程按照美国视光学与眼科协会(ARVO)中关于在眼科及视光学研究中动物使用的规定。处死大鼠后迅速摘除眼球，剪除角膜周围结膜及眼周附属组织，将角膜及角膜缘组织分离，再细分为角膜中央区，旁中央区，角膜缘区，为下一步实验使用材料。

SDF-1/CXCR4在大鼠角膜分布实验用试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
RNAiso™ Plμs提取试剂，	购自TAKARA
KAPA PROBE FAST qPCR试剂，RNA反转录试剂盒 ReverTra Ace qPCR RT Kit	购自TOYOBO
PCR仪器(型号：L96G)	杭州朗基科学仪器有限公司
荧光PCR仪(型号：Mx3005P)	安捷伦公司
核酸浓度测定仪(型号：SMA1000)	MERINTON

1.4 实验方法

1.4.1 荧光定量方法检测大鼠眼角膜中SDF-1、CXCR4基因的表达量 GenBank上查找大鼠眼角膜组织SDF-1、CXCR4基因及GAPDH的mRNA，设计特异性引物(如表1)，设计引物所用软件为Primer premier 5.0 软件。送华大基因科技服务有限公司(BGI)合成，仪器为BIOAUTOMATION高通量DNA合成仪。

使用Trizol试剂提取总RNA，以看家基因GAPDH作为内参，利用定量PCR方法分别检测角膜中角膜缘区、旁中央区和中央区的SDF-1及CXCR4基因的mRNA表达情况。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30-34个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 10 min的程序进行反应。每个处理3个样品，每个样品重复3次。扩增产物

经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察、记录结果。

反转录反应程序：37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，10 ℃ END。PCR反应条件：95 ℃ 15 s，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s 40 cycles，72 ℃ 30 s FAM，plate read，95 ℃ 10 s， 56 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。

1.5 主要观察指标 ①角膜中央区归巢因子的分布。②角膜旁中央归巢因子的分布。③角膜缘区归巢因子的分布。

1.6 统计学分析荧光定量PCR仪反应结束后，由电脑自动分析并计算结果，电脑分析结果为原始结果，需后期分析运算。

结果计算按2-?Cp来计算，利用实时定量 PCR技术通过2-??Cp方法分析相对基因表达差异， METHODS 25， 402-408，其中?Cp=[Cp(处理组目的基因)-Cp(处理组内参基因)]。

使用SPSS 13.0软件利用ANOVA方法进行统计分析，所有数据均表示为平均数±标准误，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

眼科角膜盲的主要病因是角膜和眼表疾病^[15-20]。对于这种严重疾病的惟一复明手段是采取角膜移植术^[21-27]。角膜缘干细胞严重缺失的病例，采用供体角膜同种异体角膜移植或者进行角膜缘干细胞自体移植治疗。但目前摆在全世界面前的一个难题是供体材料的来源非常困难，有限，因而严重制约了这些治疗方法的广泛开展，大量的角膜盲患者难以得到救治。为了替代治疗，自体结膜移植术曾被采用，起到一定的疗效作用。然而，角膜上皮与结膜上皮组织来源不同，修复后的角膜上皮结膜化，角膜透明性不佳，细胞黏附性不够，容易脱落。采用自体角膜材料移植，则需从健眼采取手术方式获得健康的角膜缘组织，对于严重病例，有时需很大范围的角膜缘组织，若独眼或对侧眼有疾病的患者则不能冒着巨大的风险进行这种治疗。基于上述种种困难，积极寻找合适的角膜重建方式则不可避免的被提上研究日程。Kenyon等^[28]于1989年第1次提出自体角膜缘组织移植这种治疗方法。该手术方式自健眼采取含括角膜缘干细胞组织的结膜片，在修复眼表中起到了一定的疗效。Pellegrini等^[29]于1997年首次在治疗角膜缘干细胞缺乏症患者中利用了体外培养的角膜上皮细胞。其方法是将自体原代角膜上皮细胞放置于软性接触镜上，培养至两三层的复层组织，将其移植到去除了新生血管的患眼上，术后2周检查发现，上皮的完整性一直得以保持。Ang等^[30]研究了培养的角膜缘干细胞移植，发现这种移植方式较传统的角膜缘组织移植更能够促进角膜病患者眼表的修复，且有效降低瘢痕的形成，更加适合于临床应用。角膜缘干细胞、表皮干细胞^[31-34]、口腔黏膜上皮干细胞等干细胞移植重建眼表功能也成为了近年来研究的热点。

但是，获取有效数量的角膜缘干细胞，角膜缘干细胞的传代培养也非常困难，这是摆在角膜缘干细胞移植这种治疗方法面前的难点。干细胞移植对于眼表的修复作用机制也尚不清楚。角膜上皮的再生重建是靠载体、移植物或者手术等刺激受体残存的干细胞进行了再生增殖^[35-37]?

鉴于诸多疑问，针对许多几乎截然相反的研究结果，作者拟通过干细胞归巢研究，进行翔实的探询，以期提供较为精准的研究成果。

首先，是什么促使移植细胞走向受体角膜?目前研究证实，干细胞只对SDF-1/XCR4配体显示出反应性的移动，因此SDF-1/XCR4轴对于干细胞的归巢过程中起着决定性的作用。但该轴是否对于角膜干细胞移植发挥作用？目前尚属未知。目前所知，CXCR4是SDF-1的惟一受体，两者具有高度的亲和力，生物学功能实现的基础是其特异性结合后形成的SDF-1/XCR4轴。1997年Aiuti等^[38]发现了SDF-1的一个重要特性，其对骨髓干细胞具有明显的趋化作用。其后，关于干细胞迁移修复受损病灶的报道逐渐增多，诸如心肌组织、缺血的脑组织、肢体肌肉组织中均见此类报道。Jo等^[39]的研究结果显示，CXCR4受体阻断剂可有效阻断骨髓间充质干细胞对SDF-1的反应性移动，这表明了这种途径可能是干细胞迁移至损伤组织并进行组织修复的第一步。这提示，提高SDF-1或者CXCR4的表达可能提高干细胞移植治疗相关疾病的效率。趋化因子SDF-1及其受体CXCR4在体内是广泛存在，其产生的效应也是广泛的，CXCR4在多种细胞上都有表达，是调控机体各种细胞移动的一个关键的因子。Ratajczak等^[40]研究发现，在妊娠的终末期，胚胎肝的造血干细胞和全身各个组织的组织干细胞在SDF-1的浓度梯度的趋化作用下聚集在骨髓中，使骨髓成为干细胞库。少量的组织定向分化干细胞群存在于外周血液循环中，当组织器官损伤后，在SDF-1浓度梯度的趋化作用下，调节定向分化干细胞在骨髓和定向靶组织之间的定向迁移，从而广泛参与到损伤修复中，SDF-1/CXCR4相互作用参与多种疾病创伤愈合的过程。

SDF-1/CXCR4轴在视网膜损伤修复过程中也发挥着重要作用，Machalińska等^[41]和Li等^[42]在网膜色素上皮受损的动物模型中发现，受损的视网膜色素细胞SDF-1表达量明显增多，趋化骨髓来源和非骨髓来源的内源性干细胞，使定居于骨髓内的视网膜定向分化干细胞向外周血迁移，从而参与修复受损的视网膜。Bourcier等^[43]研究了培养的正常人角膜基质细胞上是否有功能性SDF-1/CXCR4的表达。结果发现培养的角膜成纤维细胞上有特异性SDF-1和CXCR4的结合。体外细胞培养研究发现SDF-1主要表达于角膜缘上皮细胞^[44]，而CXCR4则主要表达于角膜缘基质细胞。但对于正常角膜组织上SDF-1及CXCR4的详细表达分布及含量在作者的资料查询范围内则未见报道。

本研究取得了很好的结果，角膜中央区SDF-1及CXCR4 mRNA的表达水平分别为0.213±0.015，0.189±0.02；角膜旁中央区SDF-1及CXCR4 mRNA的表达水平分别为0.529±0.077，0.285±0.015；角膜缘区SDF-1及CXCR4 mRNA的表达水平分别为0.666±0.069，0.258±0.067。

上述数据表明在大鼠角膜组织中，角膜中央区，周边区及边缘区相应SDF-1及CXCR4 mRNA的表达水平均存在着显著的差异，这种差异性可能对于角膜缘干细胞缺乏症干细胞移植治疗中细胞的归巢及移行起着重要的作用。体外细胞培养研究显示SDF-1主要表达于角膜上皮细胞中，而正常角膜组织上的研究数据也表明SDF-1在角膜中央区，旁中央和周边区的表达量呈渐增的趋势，而角膜周边区的上皮细胞层最厚，也是niche所在的部位，因此对于干细胞归巢具有较大的意义。体外细胞培养研究显示，CXCR4主要表达于角膜基质细胞上，本研究显示CXCR4在角膜中央区，角膜缘区及旁中央区的表达呈增长态势，与之吻合。

针对目前正常角膜SDF-1及CXCR4数据空白问题，作者进行了探询，为解析角膜缘干细胞移植治疗修复LSCD的治疗机制和角膜缘干细胞归巢的调控因素打下坚实的基础，向为临床需要提供干细胞数量要求少、移植效果好、治疗明确的眼表修复方法迈出了重要的一步。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

归巢因子基质细胞衍生因子1/CXCR4在角膜上的分布

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