人卵巢颗粒细胞分离培养方法的改进

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.015

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (46): 7456-7460.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.015

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人卵巢颗粒细胞分离培养方法的改进

陈东思，祁秀娟，刘建新，丁钰，马文聪

青岛大学附属医院生殖中心，山东省青岛市 266061

收稿日期:2015-08-25 出版日期:2015-11-12 发布日期:2015-11-12
通讯作者: 刘建新，博士，副教授，硕士生导师，青岛大学附属医院生殖中心，山东省青岛市 266061
作者简介:陈东思，女，1989年生，河南省信阳市人，青岛大学大学在读硕士，主要从事生殖医学专业的研究。
基金资助:
青岛市科技发展计划(1625)

Modified isolation and culture methods of human ovarian granulosa cells

Chen Dong-si, Qi Xiu-juan, Liu Jian-xin, Ding Yu, Ma Wen-cong

Department of Reproductive Medicine, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266061, Shandong Province, China

Received:2015-08-25 Online:2015-11-12 Published:2015-11-12
Contact: Liu Jian-xin, M.D., Associate professor, Master’s supervisor, Department of Reproductive Medicine, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266061, Shandong Province, China
About author:Chen Dong-si, Studying for master’s degree, Department of Reproductive Medicine, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266061, Shandong Province, China
Supported by:
the Scientific Development Plan of Qingdao, No. 1625

摘要/Abstract

摘要：

背景：建立分离培养颗粒细胞快速有效的方法也是提高体外受精-胚胎移植成功率关键的一步。虽然目前文献中有较多关于人卵巢颗粒细胞分离方法的报道，但在细胞数量、纯度及后续生长等方面不尽人意。
目的：建立有效的分离提纯、体外培养人卵巢黄素化颗粒细胞的方法。
方法：收集体外受精-胚胎移植取卵时的卵泡液，用裂解法、沉淀法、密度梯度离心法分离，Ⅰ型胶原酶或透明质酸酶消化颗粒细胞黏液团并接种在培养皿中进行培养，培养液中加入或不加自体卵泡液。
结果与结论：用裂解法得到的颗粒细胞数较沉淀法和密度梯度离心法得到的细胞数多(P > 0.05，P < 0.05)；3种方法提取的颗粒细胞活性比较无明显差异；培养24 h后沉淀法贴壁细胞数最多(P < 0.05)，而密度梯度离心法贴壁细胞数最少(P < 0.05)；透明质酸酶消化颗粒细胞较Ⅰ型胶原酶耗时少且消化彻底；加入自体卵泡液能够促进颗粒细胞生长和存活。结果证实，沉淀法提取颗粒细胞虽然耗时长，但培养的细胞存活率高、培养后收获的细胞数多；透明质酸酶较Ⅰ型胶原酶更适合消化颗粒细胞黏液团；在培养液中加入自体卵泡液更有益于颗粒细胞生长。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 卵巢颗粒细胞, 裂解法, 沉淀法, 密度梯度离心法, Ⅰ型胶原酶, 透明质酸酶, 自体卵泡液

Abstract:

BACKGROUND: To build up an effective method of isolating and culturing granule cells is a pivotal step to enhance fertilization-embryo transfer rate. Current studies mainly focus on the isolation methods of human ovarian granulosa cells rather than cell counting, purity and subsequent growth.
OBJECTIVE: To establish the effective methods of isolating, purifying and culturing human ovarian granulosa cells in vitro.
METHODS: Follicular fluid was harvested from women undergoing fertilization-embryo transfer procedures. Human ovarian granulosa cells were obtained from the follicular fluid by lysis treatment, precipitation method or density gradient centrifugation. Granulosa cell mucus masses were digested with type I collagen enzyme or hyaluronidase and then cultured in the culture medium with or without autologous follicular fluid.
RESULTS AND CONCLUSION: Lysis treatment yielded the largest amount of granulosa cells compared to the precipitation method and density gradient centrifugation (P > 0.05, P < 0.05, respectively). Cells prepared by the three methods showed the same cell viability. After 24 hours of culture, the precipitation method obtained the largest amount of adherent granulosa cells (P < 0.05); and the density gradient centrifugation obtained the least
amount of cells (P < 0.05). Compared with type I collagen enzyme, hyaluronidase took less time to digest the cells thoroughly. Autologous follicular fluid could promote the growth and survival of granulosa cells. These findings indicate that the precipitation method, though time-consuming, can obtain the highest cell viability and harvested the largest amount of granulosa cells after culture; hyaluronidase is more suitable for digesting granulosa cell mucus mass than type I collagen enzyme; autologous follicular fluid added into the culture medium is more conducive to granulosa cell growth.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Ovary, Cells, Cultured, Fertilization in Vitro

陈东思，祁秀娟，刘建新，丁钰，马文聪. 人卵巢颗粒细胞分离培养方法的改进[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(46): 7456-7460.

Chen Dong-si, Qi Xiu-juan, Liu Jian-xin, Ding Yu, Ma Wen-cong . Modified isolation and culture methods of human ovarian granulosa cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(46): 7456-7460.

图/表（结果） 3

2.1 颗粒细胞形态特征接种后倒置显微镜下发现颗粒细胞散在漂浮在培养液中，细胞呈圆形，体积约为红细胞的5倍，胞质内见黑色颗粒。培养24 h内颗粒细胞贴壁，红细胞仍呈漂浮状态，换液后倒置显微镜下观察，发现培养液中红细胞几乎全部去除，贴壁的颗粒细胞呈多突形或梭形，细胞伸出伪足相互连接，细胞核大，圆形，核仁明显，胞质颗粒均匀丰富。继续培养发现颗粒细胞在体外生长第2天增殖迅速，贴壁、伸展良好，生长旺盛；在培养第3-5天达到分裂高峰，第6-7天细胞开始出现退化现象，漂浮的颗粒细胞逐渐增多，贴壁细胞类似成纤维细胞形态，伸出的伪足逐渐消失。

2.2 三种分离方法所得颗粒细胞数及活率裂解法获得的颗粒细胞数(1.6×10⁷)明显多于密度梯度离心法(1.0×10⁷)，差异有显著性意义(P < 0.05)，但稍多于沉淀法得到的细胞数(1.5×10⁷)，差异无显著性意义(P > 0.05)。锥虫蓝染色3 min后，用细胞计数板计数蓝染细胞和细胞总数，依据公式计算：活细胞率=(细胞总数-蓝染细胞数)/细胞总数。

计算出不同方法分离出的人卵巢颗粒细胞活率，发现 3种方法得到的颗粒细胞活率差异无显著性意义(图1)。

2.3 三种分离方法的耗时沉淀法耗时(46.0±1.8) min，裂解法(29.8±3.1) min、密度梯度离心法(36.3±1.8) min，沉淀法耗时最长，裂解法耗时最短，3组之间差异均有显著性意义(P=0.000)(图1)。

2.4 两种消化酶消化时长 Ⅰ型胶原酶消化时间需要 1 h，而透明质酸酶需20 min，两种消化酶消化后的颗粒细胞活率差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 培养24 h后不同方法颗粒细胞存活量及生长状态培养24 h后显微镜下发现裂解法提纯的颗粒细胞大量漂浮，培养皿底部有大量红细胞碎片，换液后发现贴壁生长的颗粒细胞量少，伸展欠佳(图2A)；沉淀法提纯的颗粒细胞漂浮大量红细胞，换液后红细胞被去除，发现颗粒细胞铺满整个皿底，细胞生长呈多突状或梭形，细胞与细胞间有延长的伪足相互连接(图2B)；密度梯度离心法提纯的颗粒细胞外观纯净，颗粒细胞伸展良好，但细胞数量较少(图2C)。

Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶消化的颗粒细胞均生长状态良好，并无明显差异。加入自体卵泡液的颗粒细胞体积明显增大，外延的足突也明显增多，细胞汇合增加(图3)。

参考文献

[1] Jancar N, Kopitar AN, Ihan A, et al. Effect of apoptosis and reactive oxygen species production in human granulosa cells on oocyte fertilization and blast development. J Assist Reprod Genet.2007;24( 2-3) : 91-97.

[2] Shi Ft, Cheung AP, Huang HF, et al. Growth differentiation factor 9 (GDF9) suppresses follistatin and follistatin-like 3 production in human granulose-lutein cells. PloS One.2011; 6(8):e22866.

[3] Yata A, Nakabayashi K, Wakah ashi S, et al. Suppression of progesterone production by stresscop in/ urocortin 3 in cultured human granulose-lutein cells. Hum Reprod, 2009; 24(7):1748-1753.

[4] Ma M, Wang J, Xu L,et al.Effects of two human chorionic gonadotropin doses administered to the ovarian states during the <i>in vitro</i> fertilization and embryo transfer program. Biomed Rep. 2015;3(2):215-219.

[5] Liang Y, Du HL, Chang XF,et al.[Effect of bushen tiaojing recipe on the quality of the oocytes and reproductive hormones in the follicular fluid in IVF-ET patients].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2014;34(8):911-916.

[6] Simopoulou M, Nikolopoulou E, Dimakakos A,et al. Cell adhesion molecules and in vitro fertilization.In Vivo. 2014; 28(5):683-690.

[7] Song CM, Yang HM, Lu J,et al. [Effect of Bushen Tiaojing Recipe containing serum on FSH/cAMP-PKA pathway in in vitro cultured human ovarian granular cells].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2014;34(3):317-323.

[8] Gao X, Chang X, Du H,et al.Effect of soothing liver therapy on oocyte quality and growth differentiation factor-9 in patients undergoing in vitro fertilization and embryo transfer.J Tradit Chin Med. 2013;33(5):597-602.

[9] Mehta BN, Chimote MN, Chimote NN, et al. Follicular-fluid anti-Mullerian hormone (FF AMH) is a plausible biochemical indicator of functional viability of oocyte in conventional in vitro fertilization (IVF) cycles.J Hum Reprod Sci.2013;6(2): 99-105.

[10] Jin HX, Xin ZM, Song WY,et al.Effects of human cumulus cells on in vitro fertilization outcomes and its significance in short-term insemination.J Reprod Med. 2013;58(1-2):51-54.

[11] Karuputhula NB, Chattopadhyay R, Chakravarty B,et al. Oxidative status in granulosa cells of infertile women undergoing IVF.Syst Biol Reprod Med. 2013;59(2):91-98.

[12] Havelock JC, Rainey WE, Carr BR. Ovarian granulose cell lines. Mol Cell Endocrinol.2004;228(1): 67-78.

[13] 叶婧,丁婷,杜小芳,等.不同分离方法对人卵巢颗粒细胞体外培养的影响 [J].中国现代医学杂志,2013,23(17):1-5.

[14] Sutton ML, Gilchrist RB, Thompson JG. Effects of in-vivo and in-vitro environments on the metabolism of the cumulus-oocyte complex and its influence on oocyte developmental capacity. Hum Reprod Update. 2003;9(1): 35-48.

[15] Liu JY, Qian Y, Mao YD, et al. In vitro maturation, fertilization and embryo transfer of human immature oocyte. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi.2003 ;38(4):230-232.

[16] Somigliana E, Viganò P, La Sala GB,et al. Follicular fluid as a favourable environment for endometrial and endometriotic cell growth in vitro. Hum Reprod.2001; 16(6):1076-1080.

[17] Malamitsi-Puchner A, Sarandakou A, Baka SG, et al. Concentrations of angiogenic factors in follicular fluid and oocyte-cumulus complex culture medium from women undergoing in vitro fertilization: association with oocyte maturity and fertilization. Fertil Steril.2001;76(1):98-101.

引言

体外受精-胚胎移植目前仍是治疗不孕症的重要手段，自1978年世界首例试管婴儿诞生以来，体外受精-胚胎移植技术在世界范围内迅速得到发展。随着不孕症患者日益增多，人们对该技术的成功率要求越来越高，所以在体外受精-胚胎移植技术中，如何提高胚胎质量及临床妊娠率一直是生殖医学领域的热点和难点，而其中如何提高卵子质量是重中之重。

颗粒细胞为附着于卵泡腔面的复层立方上皮，是组成卵泡的最大细胞群，是卵巢合成和分泌抑制素、雌激素和孕激素的主要功能细胞，以自分泌和旁分泌的方式调节卵泡的生长、发育和成熟，维持有利于卵母细胞成熟的微环境，维持黄体功能，已有研究报道，颗粒细胞能力减弱或凋亡，不能分泌足够的激素及生长因子，会导致卵泡闭锁。所以颗粒细胞的质量对卵泡的发育及胚胎的质量至关重要^[1]。

卵巢颗粒细胞体外培养模型目前在研究领域应用广泛，不仅用于研究颗粒细胞的超微结构变化及其凋亡状态与卵子及胚胎质量的关系，也用于研究多囊卵巢综合症胰岛素抵抗的发生机制、女性生殖系统恶性肿瘤体外化疗模型及各种药物毒理学研究等，为指导临床治疗提供理论基础。

建立卵巢颗粒细胞体外培养模型的重要基础是获得大量高质量的卵巢颗粒细胞。因此建立分离培养颗粒细胞快速有效的方法也是提高体外受精-胚胎移植成功率关键的一步。虽然目前文献中有较多关于人卵巢颗粒细胞分离方法的报道^[2-11]，但在细胞数量、纯度及后续生长等方面不尽人意。作者通过显微镜下观察卵泡液发现，卵泡液中混杂最多的细胞成分是红细胞，这是由于经阴道超声引导下穿刺取卵时局部少许出血导致的。卵泡液中游离散在的颗粒细胞极少，而黏液团中存在大量颗粒细胞，故提取颗粒细胞必须解决两个关键问题：①怎样高效快速地去除混杂红细胞。②如何提取黏液团中的颗粒细胞。

针对以上两个关键问题作者从细胞分离、纯化、培养的关键环节分别用不同的方法和试剂进行比较，旨在寻找提纯、培养颗粒细胞最快速有效的方法。首先采用3种不同的分离方法进行比较，其中裂解法和密度梯度离心法是目前文献中常用的方法，而沉淀法是作者在实验过程中摸索出的新方法。既往研究显示，裂解法虽然获得颗粒细胞数量多，但培养后存活率低，密度梯度离心法获得细胞数量少。而沉淀法在细胞数量和存活率方面能否优于其他两种方法正是本研究的主要探讨内容。分离颗粒细胞后分别使用I型胶原酶和透明质酸酶进行消化，比较两种消化酶的耗时及对颗粒细胞生长的影响。最后培养时在培养液中加入自体卵泡液观察自体卵泡液是否对颗粒细胞的生长有促进作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计人卵巢颗粒细胞分离培养3种方法对比观察。

1.2 时间及地点试验于2015年3至5月在青岛大学附属医院完成。

1.3 对象选择2015年3至5月于青岛大学附属医院行体外受精-胚胎移植治疗的患者共30例。

1.3.1 纳入标准 ①年龄25-35岁，月经周期正常。②均为输卵管因素或男方因素不孕者。③月经第3天性激素水平在正常范围内。④体质量指数(BMI)在18-25 kg/m²。⑤均采用超排卵长方案。⑥取卵周期中获卵数≥ 5个。

1.3.2 排除标准 ①年龄> 35岁。②月经第3天性激素水平异常。③输卵管阻塞或盆腔粘连是由于子宫内膜异位症导致的。④既往有卵巢肿瘤病史。⑤不明原因性不孕。⑥既往促排卵周期中卵巢对药物反应不良或超排卵周期获卵数少于5个。

参与试验的患病个体及其家属自愿参加，所有供者、受者均对试验过程完全知情同意，在充分了解本治疗方案的前提下签署“知情同意书”。

人卵巢颗粒细胞分离培养所用主要试剂：
试剂	材料
Percoll分离液	Pharmacia公司
DMEM/F12培养基	Gibco公司
Ⅰ型胶原酶、透明质酸酶	Sigma公司
红细胞裂解液、PBS缓冲液	武汉博士德公司
胎牛血清	Hyclone公司
锥虫蓝染色细胞存活率检测试剂盒	碧云天生物制剂公司

1.4 方法

1.4.1 材料收集收集控制性超排卵后穿刺取卵抽吸出的全部卵泡液(卵母细胞-放射冠细胞-卵丘细胞复合体已经挑出)。将第1瓶卵泡液平均分为3份，分别采用裂解法、沉淀法及密度梯度离心法分离3种方法进行分离，分离后均用透明质酸酶消化、普通培养液进行培养。第2瓶卵泡液用沉淀法分离后用微量移液器均分为2份，分别用Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶消化，普通培养液培养。第3瓶卵泡液用沉淀法分离、透明质酸酶消化后均分为2份，分别用加入一半自体卵泡液的培养液和普通培养液进行培养。

1.4.2 细胞分离纯化

裂解法：穿刺取卵时收集获得的卵泡液，以300×g离心10 min，留取上清备用。1 mL沉淀加入3倍体积的红细胞裂解液，37 ℃孵育5 min后300×g离心5 min，弃上清，若沉淀仍有红色，可重复上诉步骤一两次。再用无Ca²⁺、Mg²⁺的0.01 mol/LPBS(后面所提PBS均与此相同)洗涤2遍，弃上清，待消化。

沉淀法：穿刺取卵时收集获得的卵泡液，静止10 min沉淀后留取上清离心备用，沉淀物用PBS重悬后再次静止 5 min，反复静止沉淀弃上清大约4次，液体变透明后以300×g离心5 min，弃上清，待消化。

密度梯度离心法：穿刺取卵时收集获得的卵泡液，以300×g 离心10 min，留取上清备用，沉淀物用PBS配成悬液，以1∶1的比例将细胞悬液缓慢加入到已准备好的50%Percoll分离液上，以400×g离心20 min，吸取中间白色颗粒细胞层，加入PBS洗涤2次，留取沉淀待消化，若分离不完全，可重复上诉步骤一两次。

消化：将沉淀的黏液团平均分为2份后分别加入含0.1%透明质酸酶的灭菌磷酸缓冲液和Ⅰ型胶原酶1 mL，将细胞悬浮，置37 ℃水浴箱孵育，直至黏液团消失，液体变黏稠。

细胞计数及存活率检测：消化后的颗粒细胞以300×g离心5 min，弃上清后的沉淀用DMEM/F12培养液(含体积分数15%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L链霉素)重悬后，吸取100 μL重悬的颗粒细胞到一塑料EP管内，加入等体积锥虫蓝染色液(2×)，轻轻混匀，染色3 min。吸取10 μL经过染色的细胞，用血细胞计数板计数。

细胞培养：根据细胞计数调整细胞浓度为2×10⁸L^-1[4]，并平均分为2份接种到培养皿中，其中一个培养皿加入自体卵泡液和含体积分数15%血清的DMEM/F12培养液各一半，另一皿单纯用含体积分数15%血清的DMEM/F12培养液，置37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱。24 h后换液。

1.5 主要观察指标 ①颗粒细胞形态特征。②3种分离方法所得颗粒细胞数及活率。③3种分离方法的耗时。④两种消化酶消化时长。⑤培养24 h后不同方法颗粒细胞存活量及生长状态。

1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析，P < 0.05 则认为差异有显著性意义。所有实验均重复至少10次。

讨论

颗粒细胞作为卵泡中最大的细胞群^[12]，目前不仅应用于辅助生殖技术研究，而且在卵巢肿瘤化疗、凋亡、药物毒理学等方面也成为主要研究对象。作者通过显微镜下观察卵泡液的成分及性状，分析提纯颗粒细胞的难点，针对细胞分离、纯化、培养的关键环节分别用不同的方法和试剂进行比较，旨在建立人卵巢颗粒细胞体外培养模型有效而稳定的方法。

3.1 分离方法的选择通过3种分离方法比较，本试验倾向于沉淀法。因为裂解法虽然提取的颗粒细胞数最多，耗时最短，且红细胞裂解液能有效的除去红细胞，但在裂解红细胞的同时，也在一定程度上影响了颗粒细胞的活性，且裂解后残存的细胞碎片也影响颗粒细胞的贴壁。故培养24 h后裂解法得到的颗粒细胞数量少，生长状态欠佳。密度梯度离心法是根据不同细胞比重的差异，借助分离液和离心进行细胞的分离纯化，由于颗粒细胞主要存在于黏液团中，离心后大部分黏液团随红细胞沉于管底，故获得的颗粒细胞数很少^[13]。

沉淀法虽然耗时较长，不能完全去除红细胞，但由于减少了各种试剂的影响及离心导致的机械损伤，且存留的红细胞并未明显影响颗粒细胞贴壁，换液后红细胞几乎完全去除，故培养24 h后贴壁颗粒细胞数量多且生长好。

3.2 消化酶的选择 Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶均能消化颗粒细胞黏液团，但通过比较，透明质酸酶消化时间不仅明显短于Ⅰ型胶原酶，且消化更彻底。两种消化酶对颗粒细胞活率的影响并无明显差异。这可能与黏液团的成分有关，有研究指出，黏液团的主要组成成分是透明质酸。且酶的消化时间越长对细胞的损伤就会越大，可能影响细胞贴壁及生长。

3.3 培养液中是否加入自体卵泡液通过在培养液中加入自体卵泡液，发现颗粒细胞伸展良好，生长状态优于单纯使用普通培养液。所以在培养液中加入自体卵泡液可以促进颗粒细胞的生长和成熟。因为卵泡液中含有多种、多量的营养成分、细胞因子、激素以及其他到目前为止尚未确认的有益于颗粒细胞生长、成熟的组分^[14-17]。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[5]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[6]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[7]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[8]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[9]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[10]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[11]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[12]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[13]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.
[14]	刘畅, 李大同, 刘元, 孔令擘, 郭瑞, 杨利学, 郝定均, 贺宝荣. 急性症状性骨质疏松性胸腰椎压缩骨折椎体强化手术后疗效欠佳：与骨水泥、骨密度、邻近骨折的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3510-3516.
[15]	刘利永, 周雷. 组织工程用水凝胶研发现状和发展趋势：基于专利信息的分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3527-3533.