氯化钴模拟低氧环境下人脐带间充质干细胞增殖及基因蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (45): 7268-7273.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.010

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氯化钴模拟低氧环境下人脐带间充质干细胞增殖及基因蛋白的表达

韩潇^1，2，白海¹，尹娇娇¹，杨柯¹，韩燕霞¹，欧剑锋¹，王存邦¹

1解放军兰州军区兰州总医院血液科/全军血液病中心，甘肃省兰州市 730050；2兰州大学第二医院血液内科，甘肃省兰州市 730030

收稿日期:2015-09-29 出版日期:2015-11-05 发布日期:2015-11-05
通讯作者: 白海，博士，主任医师，硕士生导师，解放军兰州军区兰州总医院血液科，甘肃省兰州市 750050
作者简介:韩潇，女，1990年生，四川省苍溪县人，汉族，兰州大学在读硕士，主要从事血液病及间充质干细胞的研究。
基金资助:
甘肃省科技重大专项(1102FKDA005)

Effect of cobalt chloride-induced hypoxia on proliferation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and related gene and protein expressions

Han Xiao^{1, 2}, Bai Hai¹, Yin Jiao-jiao¹, Yang Ke¹, Han Yan-xia¹, Ou Jian-feng¹, Wang Cun-bang¹

1Department of Hematology, Center for Hematologic Diseases of Chinese PLA/Lanzhou Military Area General Hospital, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; 2Department of Hematology, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China

Received:2015-09-29 Online:2015-11-05 Published:2015-11-05
Contact: Bai Hai, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Hematology, Center for Hematologic Diseases of Chinese PLA/Lanzhou Military Area General Hospital, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Han Xiao, Studying for master’s degree, Department of Hematology, Center for Hematologic Diseases of Chinese PLA/Lanzhou Military Area General Hospital, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; Department of Hematology, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
the Major Scientific Project of Gansu Province, No. 1102FKDA005

摘要/Abstract

摘要：

背景：氯化钴可促进人脐带源性间充质干细胞的增殖，具有时间和浓度依赖性，并对其基因蛋白表达具有调控作用。
目的：研究氯化钴模拟的低氧环境对人脐带源性间充质干细胞的增殖及基因蛋白表达的影响，旨在建立高效的间充质干细胞体外培养扩增体系。
方法：采用组织块法提取人脐带间充质干细胞，氯化钴模拟化学低氧环境，在不同浓度(0，100，150，200，250 μmol/L)和不同时间(0，1，2，3，4 d)条件下，用流式细胞仪进行细胞表面相关抗原的鉴定及细胞周期检测；CCK-8法测定细胞增殖情况；RT-PCR测定缺氧诱导因子1α、诱导型一氧化氮合酶、基质细胞衍生因子1、白细胞介素6、转化生长因子β mRNA的表达；Western blot测定缺氧诱导因子1α蛋白的表达。
结果与结论：人脐带间充质干细胞表面相关抗原CD29、CD73、CD90、CD105表达阳性，CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR呈阴性表达，且不受氯化钴模拟的低氧环境影响。氯化钴模拟的化学性低氧可促进人脐带间充质干细胞增殖，且具有一定时间及浓度依赖性。RT-PCR检测到低氧组缺氧诱导因子1α、诱导型一氧化氮合酶、基质细胞衍生因子1 mRNA表达上调，而白细胞介素6及转化生长因子β mRNA表达下调，差异有显著性意义(P < 0.05)。低氧组中缺氧诱导因子1α蛋白表达增高。结果表明氯化钴模拟的体外低氧环境能促进人脐带间充质干细胞增殖，最佳浓度为200 μmol/L，但过高浓度(250 μmol/L)时反而抑制其增殖，机制可能与缺氧诱导因子1α基因与蛋白表达增加相关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 人脐带间充质干细胞, 低氧, 氯化钴, 增殖, 基因表达, 缺氧诱导因子1α

Abstract:

BACKGROUND: Cobalt chloride (CoCl2) may promote the proliferation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) in a time- and concentration-dependent manner, and meanwhile, CoCl2 can regulate the expression of genes and proteins in hUC-MSCs.
OBJECTIVE: To explore the effects of CoCl2 induced-hypoxia on the proliferation of hUC-MSCs and gene and protein expressions in hUC-MSCs, thereby establishing an effective method for MSCs culture and amplification in vitro.
METHODS: hUC-MSCs were extracted using tissue explant method. Under hypoxia conditions induced by CoCl2 (0, 100, 150, 200, 250 μmol/L) for different periods (0, 1, 2, 3, 4 days), flow cytometry was used to identify cell surface-associated antigens; cell counting kit-8 was used to detect cell proliferation; RT-PCR was used to
determine levels of hypoxia inducible factor-1α, inducible nitric oxide synthase, stromal cell-derived factor-1, interleukin-6, transforming growth factor-β mRNA; western blot assay was used to detect protein expression of hypoxia inducible factor-1α.
RESULTS AND CONCLUSION: The cells were positive for CD29, CD73, CD90, CD105, while negative for CD31, CD14, CD34, CD45, CD11b, HLA-DR. Moreover, the antigen expression was not affected by CoCl2 induced-hypoxia. CoCl2 induced-chemical hypoxia could promote the proliferation of hUC-MSCs in a time- and concentration-dependent manner. RT-PCR results showed that under hypoxia, hypoxia inducible factor 1α, inducible nitric oxide synthase and stromal cell-derived factor-1 mRNA expressions were significantly up-regulated, but interleukin-6 and transforming growth factor-β mRNA expressions were down-regulated significantly (P < 0.05). Additionally, the protein expression of hypoxia inducible factor 1α was increased under hypoxia conditions. These findings indicate that CoCl2 induced-hypoxia environment may promote the proliferation of hUC-MSCs and the optimal concentration of CoCl2 is 200 μmol/L. However, a higher concentration of CoCl2 (≥ 250 μmol/L) inhibits the proliferation of hUC-MSCs, and the mechanism may be related to the increase of hypoxia inducible factor-1α at protein and mRNA levels.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Cell Hypoxia, Cell Proliferation, Hypoxia-Inducible Factor 1, Tissue Engineering

韩潇，白海，尹娇娇，杨柯，韩燕霞，欧剑锋，王存邦. 氯化钴模拟低氧环境下人脐带间充质干细胞增殖及基因蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7268-7273.

Han Xiao, Bai Hai, Yin Jiao-jiao, Yang Ke, Han Yan-xia, Ou Jian-feng, Wang Cun-bang. Effect of cobalt chloride-induced hypoxia on proliferation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and related gene and protein expressions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7268-7273.

图/表（结果） 6

2.1 人脐带间充质干细胞的形态组织块培养7-10 d后，可见组织块周围有细胞游出，且在组织块周围形成50%-75%的融合，其细胞形态呈多角形或短梭形，不规则。继续培养8-10 d去除组织块，并换液培养3-5 d，贴壁细胞迅速增殖，达80%-90%融合，形态类似于短成纤维细胞，胞浆丰富，核偏大，呈平行排列、漩涡状、网状、辐射状生长，细胞界限不清楚。传代细胞在4-12 h内完全贴壁，继续培养3-5 d后，重新变为长梭形成纤维样细胞，细胞大小均一，低倍镜下观察见细胞呈漩涡状或单极向放射状生长(图1)。

2.2 人脐带间充质干细胞表面抗原特性流式细胞仪检测结果显示，脐带间充质干细胞表面抗原CD29、CD73、CD90、CD105表达阳性，而CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR呈阴性表达(图2)。说明分离获取的贴壁细胞符合脐带间充质干细胞的特点，且不受CoCl₂模拟的低氧环境影响。

2.3 氯化钴对细胞增殖能力的影响氯化钴模拟的化学性低氧促进人脐带间充质干细胞增殖，其增殖作用具有一定时间及浓度依赖性。

0.5 d时低氧组细胞增殖低于常氧组(P < 0.01)。24 h及24 h以后，除250 μmol/L氯化钴组细胞增殖低于常氧组外，其余各低氧组细胞增殖均高于常氧组，100 μmol/L氯化钴组与常氧组间差异无显著性意义(P > 0.05)，而 150 μmol/L和200 μmol/L氯化钴组增殖均明显高于常氧组(P < 0.01)。5 d时低氧组细胞增殖仍高于常氧组，但其差异已无显著性意义(P > 0.05)，优势也逐渐减弱。7 d时这种低氧促增殖的效应消失(表2)。

2.4 脐带间充质干细胞的细胞周期分析与常氧组相比，12 h时低氧组的S和G₂/M期细胞均明显减少，细胞增殖受到了抑制；随着时间延长，低氧组细胞增殖指数明显高于常氧组；72 h时，除250 μmol/L氯化钴组，其余各低氧组增殖指数均明显高于常氧组(P < 0.01，图3)。

2.5 实时定量RT-PCR检测结果与常氧组相比，除 100 μmol/L氯化钴组外，其余各组的诱导型一氧化氮合酶 mRNA均增加，其中又以200 μmol/L氯化钴组最为明显 (P < 0.01)。缺氧诱导因子1α及基质细胞衍生因子1 mRNA含量随氯化钴浓度的增加而增加(P < 0.05)。白细胞介素6及转化生长因子β mRNA含量相对于常氧组有所降低(P < 0.05，表3)。

2.6 Western blot检测缺氧诱导因子1α蛋白表达与对照组相比，低氧组高表达缺氧诱导因子1α蛋白，且其表达量随氯化钴浓度的增加而增加(图4)。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计分组对照实验研究。

1.2 时间及地点实验于2014年8月至2015年8月在解放军兰州军区兰州总医院血液病研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 脐带标本取自解放军兰州军区兰州总医院产科足月剖宫产健康产妇，符合伦理学要求且均获知情同意，收集标本后4 h内处理。

1.3.2 试剂与仪器 DMEM/F12培养液、胎牛血清及胰蛋白酶购自美国Gibco公司；培养皿、培养瓶及冻存管购自美国Corning公司；流式细胞仪(FACSCalibur)及CD29-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD31-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD11b-PE、CD45-Percp、Anti-HLA-DR-FITC购自美国Becton Dickinson公司；水合氯化钴(CoCl₂•6H₂O)购于美国Sigma公司；CCK-8购自日本Dojindo研究所；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；Trizol试剂、反转录试剂盒与Power SYBR@ Green PCR Master Mix购自美国罗氏公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成；RIPA裂解液购于北京普利莱基因技术有限公司，抗鼠缺氧诱导因子1α多克隆抗体购于美国BD公司，抗鼠β-actin购于中国中杉金桥公司，ECL显影剂购于美国Thermo公司；CO₂恒温培养箱购自德国Heracell公司，倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，酶联免疫分析仪购自美国BioTek仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞分离、培养及原始扩增人脐带在无菌条件下置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，4 ℃保存。在超净工作台内取出脐带，用PBS反复冲洗直至无血液及血块，在含DMEM/F12培养基的大皿中操作，剔除动静脉血管及外膜，用培养基清洗，剪为约1 mm³的组织块，以适当的密度接种于直径15 cm的大皿中，加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于 37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度的孵箱内培养。第2天加入10 mL培养基，第3-5天后首次半量换液，以后每5-7 d更换培养基，培养10-14 d后去除组织块。待贴壁细胞长至80%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶(含1 mmol /L EDTA )消化，按1︰3的比例传代培养。

1.4.2 流式细胞术分析细胞表面抗原接种第3代人脐带间充质干细胞，24 h后换含200 μmol/L CoCl₂的培养基孵育48 h，收集细胞，用PBS制成1×10⁹ L^-¹的单细胞悬液，分别加入CD29-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD31-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD45-Percp、CD11b- PE、HLA-DR-FITC抗体各5 μL，室温孵育30 min，流式细胞仪检测，Cell-Quest(Mac)软件分析。每个样本至少分析10 000个细胞。

1.4.3 CCK-8法对细胞增殖能力的评估取第3代人脐带间充质干细胞，按2×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于96孔培养板内，每板连续接种48孔，每孔200 μL细胞悬液，共计5板。孵育24 h后换含浓度分别为0，100，150，200，250 μmol/L氯化钴的完全培养液，继续避光培养，分别至12 h及1，2，3，4，5，6，7 d时，每板取6个孔加入CCK-8 10 μL，混匀。37 ℃继续孵育3 h后在酶标仪上测定加药孔的吸光度(A_{450 nm})值，以检测细胞在不同培养条件下的增殖情况。每个样本3次重复。

1.4.4 流式细胞仪行细胞周期检测将第3代人脐带间充质干细胞按每瓶2.5×10⁶个接种于培养瓶中，培养24 h细胞贴壁后，使细胞同步于G₀期。分别换含浓度为0，100，150，200，250 μmol/L氯化钴的完全培养液孵育0，12，24，48，72 h后收集各组细胞。经扩增传代的间充质干细胞消化后用PBS洗涤2遍，加入1 mL -20 ℃的体积分数为70%乙醇，混匀，4 ℃固定24 h，离心，加入1 mL冷浴PBS，混匀，离心去上清，每个样本中加入0.5 mL配好的PI染液，混匀，37 ℃避光温浴30 min，流式细胞仪检测，ModFitLT V3.2(Mac)软件分析结果。每个样至少分析20 000个细胞。根据各组细胞周期阳性细胞数结果，计算细胞分裂增殖指数(PI)，PI=(S+G₂/M)/(G₀/G₁+S+G₂/M)×100%。

1.4.5 实时定量RT-PCR 将第3代人脐带间充质干细胞按每瓶2.5×10⁶个接种于培养瓶中，共接种5瓶，培养24 h后，分别换含浓度为0，100，150，200，250 μmol/L氯化钴的完全培养液孵育48 h收集各组细胞。按说明书用Trizol试剂提取总RNA，并用反转录试剂盒反转录得到cDNA，取5 μL进行RT-PCR反应，反应条件为：50 ℃ 2 min为加入UNG做准备；95 ℃ 10 min为DNA酶活化；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环为扩增及实时分析。以GAPDH mRNA为内参照，计算目的基因mRNA的相对表达量。所有样本均做3个复孔。各基因上、下游引物序列(5’-3’)见表1。
1.4.6 Western blot检测缺氧诱导因子1α蛋白表达将第3代人脐带间充质干细胞按每瓶2.5×10⁶个接种于25 cm²培养瓶中，共接种5瓶，培养24 h后，分别换含浓度为0，100，150，200，250 μmol/L氯化钴的完全培养液孵育48 h后收集各组细胞。用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。每泳道40 μg蛋白，10% SDS-PAGE电泳分离后湿转至PVDF膜，摇床封闭1 h，加一抗4 ℃封闭孵育过夜，洗膜，加相应二抗室温封闭孵育1 h，漂洗后用ECL显色，图像分析系统灰度扫描。

1.5 主要观察指标 ①脐带间充质干细胞的形态、表面抗原表达。②在不同氧浓度下，细胞增殖能力及细胞周期。③诱导型一氧化氮合酶、缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1、转化生长因子β1、白细胞介素6等基因的表达及缺氧诱导因子1α蛋白的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件分析，数据以x(_)±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用非参数检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

当前，几乎所有间充质干细胞的体外扩增均在常氧条件(体积分数约为20% O₂)下进行，为体内壁龛O₂体积分数的4-10倍^[7-8]。近年大量研究表明，环境高O₂对间充质干细胞具有早期衰老、群体倍增时间较长、DNA损伤和移植后低存活率等负面影响^[9-10]，揭示了O₂体积分数能影响间充质干细胞的生物学特性，从而影响其生物安全性和治疗效应。综上，本研究利用氯化钴模拟体内低氧环境，探讨低氧环境对人脐带源性间充质干细胞增殖、基因蛋白表达等影响，从而提高人脐带间充质干细胞的体外扩增效应，以增强其在再生医学领域中的疗效。

普遍认为低氧环境可加速多种细胞系增殖，其中包括间充质干细胞^[11]，这与本研究结果一致。氯化钴模拟低氧机制为：Co²⁺竞争性替代Fe²⁺结合血红蛋白，致细胞内血红蛋白处于脱氧合状态，由此阻断氧信号传导系统中氧感受器与氧结合，使细胞中含氧量下降^[12]。Moriyama等^[13]发现O₂体积分数为5%时，细胞通过糖酵解途径进行代谢，从而对人脂肪间充质干细胞进行有利生长，提高增殖效率、防止细胞衰老并维持未分化状态。本实验结果显示，12 h时低氧组人脐带间充质干细胞增殖低于常氧组，继续培养24 h以后低氧组增殖能力反而明显高于常氧组，增殖能力随氯化钴浓度及培养时间的增加而增加，其差异有显著性意义(P < 0.05)，这可能与人脐带间充质干细胞在低氧状态下的增长动员有关^[14]。250 μmol/L氯化钴组增殖能力却低于常氧组，表明人脐带间充质干细胞的增殖具有CoCl₂浓度和时间依赖性。此外，氯化钴模拟的低氧环境不影响其细胞表面标记的表达。

在体外培养的低氧环境下，RT-PCR检测到缺氧诱导因子1α、诱导型一氧化氮合酶、基质细胞衍生因子1 mRNA表达上调，而白细胞介素6及转化生长因子β mRNA表达下调，差异有显著性意义(P < 0.05)，这结果暗示低氧可促进缺氧诱导因子1α、诱导型一氧化氮合酶、基质细胞衍生因子1 mRNA上调，且缺氧诱导因子1α还可能进一步促进基质细胞衍生因子1上调。诱导型一氧化氮合酶是炎症刺激下产生的一氧化氮合成酶的一种亚型。一氧化氮是一种生物活性复合物，具有血管扩张效应且在间充质干细胞免疫抑制效应中具有重要作用^[15]。Ren等^[16]发现诱导小鼠间充质干细胞免疫抑制的关键效应分子正是诱导型一氧化氮合酶。基质细胞衍生因子1对多种干细胞功能具有调节作用，包括迁移与分化^[17]，因此低氧环境下其高表达可促进间充质干细胞归巢。本实验中，低氧组白细胞介素6 mRNA的表达较常氧组低，与之前研究相反^[18-19]，可能是低氧致人脐带间充质干细胞的旁分泌功能减弱，其具体机制还有待进一步研究。

缺氧诱导因子1α的表达受O₂依赖的羟基化作用调节，其羟基化可阻止缺氧诱导因子1α与共活化剂的相互效应，从而导致缺氧诱导因子1α泛素化与降解^[20]。本实验在氯化钴模拟的低氧环境中，缺氧诱导因子1α基因与蛋白表达均增加，这可能是在低氧条件下，基层O₂丧失和缺氧诱导因子1α堆积，羟基化作用被限制，从而致使基因表达改变，因此缺氧诱导因子1α是低氧环境中自我平衡反应的一个主要调节者^[21]。Welford等^[22]证明低氧条件下(体积分数为2% O₂)，缺氧诱导因子1α可延迟小鼠胚胎纤维的过早衰老。Tsai等^[23]报道低氧(体积分数为1% O₂)可通过促进缺氧诱导因子1α表达而抑制衰老，并维持间充质干细胞的潜能。最近，也有研究证实，低氧通过缺氧诱导因子1α与Notch信号在细胞内部相互作用并激活Notch通路，由此维持多种干祖细胞群的未分化能力和干细胞潜能^[24]。

综上所述，实验模拟的低氧环境可提高人脐带间充质干细胞的增殖效率、促进基质细胞衍生因子1、缺氧诱导因子1α等基因蛋白的表达，预示着低氧培养条件可成为一个有效解决方法，从而克服上述困难。以后的研究应进一步明确低氧环境中缺氧诱导因子1α对人脐带间充质干细胞增殖及基因表达调节的相关性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

氯化钴模拟低氧环境下人脐带间充质干细胞增殖及基因蛋白的表达

Effect of cobalt chloride-induced hypoxia on proliferation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and related gene and protein expressions

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
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