血管冻干前后的显微变化分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管纵向方面的拉伸力学特性、径向方面必要的血管张力，是组织灌注和压力维持的重要保证。

目的：通过拉伸、穿刺指标的测试和分析表征血管性能，侧面地预测移植入受体后血管的健康状况。

方法：采用猪主动脉血管为材料，利用动态力学分析仪对血管周向拉伸、轴向拉伸及穿刺方面的力学性能进行了测试实验，并结合切片及染色分析，分析冻干后的血管移植入体内后，能否承受血液对其造成的各个方向的压力。

结果与结论：冻干后血管的周向拉伸、轴向拉伸及穿刺过程曲线都分别与新鲜血管该段过程曲线的趋势比较接近，说明血管在冻干后结构成分及排列方式没有发生大的改变；同时结合切片及拉伸断面的显微观察，研究和解释了各项力学性能实验数据和结果出现的原因，利用微观结构的变化分析了宏观力学的实验结果。结果说明真空冷冻干燥的方法能够较好地保持血管力学方面的各项性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 冻干血管, 拉伸, 穿刺, 苏木精-伊红染色

Abstract:

BACKGROUND: Mechanical properties of the blood vessels include axial and radial tension which is important to guarantee the tissue perfusion and its pressure.
OBJECTIVE: To test and analyze stretching and puncture parameters that can fully characterize the performance of blood vessels, so as to predict the health condition of the vessels transplanted into recipients.
METHODS: Mechanical properties as circumferential tension, axial tension and puncture were tested on the porcine aorta, and then pathological and staining analysis was done to explore whether freeze-dried vessels can withstand the blood pressure in all directions after transplanted into the body.
RESULTS AND CONCLUSION: Specific trend on the curves of freeze-dried vessels during circumferential tension, axial tension and puncture process was closer to that of fresh vessel curves, suggesting that structural components and arrangement of the freeze-dried vessels were not changed greatly. Meanwhile, the microscopic observations of slice and tensile section were taken into account so that the reason was studied and explained for the mechanical properties of the experimental data and results. The macroscopic mechanical result was analyzed based on the change of microstructure. These findings indicate that the vacuum freeze-drying is a better method to maintain the performance of blood vessels.

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Key words: Freeze Drying, Freeze Drying, Tensile Strength

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

2.1 血管冷冻干燥过程的温度变化血管预冻过程3 h，一次干燥过程2 h，二次干燥过程持续4 h。见图2。 2.2 不同冻干方法的血管拉伸过程曲线与分析图3为DMA的软件描绘出的血管周向拉伸时，由开始拉伸直至拉断整个过程的冻干前后拉伸力与拉伸应力随长度(Length，mm)的变化图。图中2种血管拉伸曲线的趋势基本相似，开始时，只需要较小的力即可使血管长度产生较大的变化，新鲜血管在拉伸至13 mm左右，冻干复水血管拉伸至8.5 mm左右时，曲线的趋势发生了较之前不同的变化，这样的转折点出现前，新鲜血管伸长了约7 mm，冻干复水的血管伸长了6.5 mm左右；之后，拉伸力增加，而长度变化减小，至过程结束，新鲜血管该段中拉长了约4 mm，冻干复水的血管拉长了2-2.5 mm，两种血管拉断时的最大拉伸力也有不同。

同样，轴向血管也按照此方法拉伸至断裂。冻干血管前后轴向拉伸力与拉伸应力随长度变化过程见图4。图中两种血管拉伸的整体趋势基本相同，血管的拉伸应力与长度变化出现多个转折点，呈现了几个不同的阶段，冻干血管这种不同阶段的变化更加明显。总体来讲，轴向拉伸时，最终的拉断应力都较周向拉伸大；血管拉断所用的时间也比周向拉伸长。血管是由各种结缔组织、纤维及不可压缩成分构成的粘弹性体，根据相关学者提出的生物软组织拟弹性理论^[29]，大多数生物软组织的应力-应变关系可借用弹性理论来分析血管的黏弹性力学性质。猪血管各膜层结构示意图见图6。管腔周围是血管的内膜，表面光滑，由致密的结缔组织构成，并存在有内皮细胞。中膜含有大量的弹性纤维及少量的平滑肌纤维，是决定血管弹性的主要区域，中膜层也是血管管壁中最厚的一部分。血管外膜主要构成为疏松结缔组织，在内膜与中膜、中膜与外膜之间分别存在有弹性纤维构成的内弹性膜和外弹性膜作为各膜层的分界并起到连接作用。血管的中膜层较厚，轴向拉伸的力学性能及血管机能主要取决于中膜层的弹性纤维和平滑肌纤维的空间构型及状态^[30]，而这些纤维在后面提到的显微镜观察结果中是呈现纵向排列的，因此纵向拉伸所需的力定会大于横向拉伸力，且弹性范围内的长度变化量会小于周向拉伸。将周向及轴向拉伸，长度与应力变化的关系的数据进行整理，进一步计算应力-应变的关系。 2.3 不同冻干方法的血管切片结果及断层观察新鲜及冻干复水的血管制成切片，经苏木精-伊红染色后，于显微镜下观察。新鲜、冻干复水血管组织观察见图5。新鲜血管组织致密，状态较为均匀，各种纤维排列良好，可以看到左侧很薄、接近透明的内膜层；冻干血管复水后，各种组织结构也得到了一定的保持，中膜、外膜十分明显，内膜层基本无法看到，结构上产生了一定程度的裂隙，但各种纤维的纵向排列顺序没有改变。由于两组实验取自于不同的血管段，所以在管壁的厚度方面无法用这两幅图做出比较，但以多组冻干实验后的观察结果来看，复水后的血管较新鲜状态的壁厚略有变薄。周向拉伸的前一阶段，相同拉伸力下新鲜血管的长度改变较冻干血管小，结合显微观察见图5，新鲜血管排列紧密，结构均匀，而冻干血管内膜的消失、管壁中间纵向孔隙的形成都造成了血管横向和纵向结构的破坏，材料的耐拉强度除与其成分组成有关外，对材料的缺陷也十分敏感^[31]，这种缺陷的存在及较为疏松的结构使得血管在拉伸时，相对于新鲜紧密的结构来说更易使产生形变，弹性模量E变小，随着拉伸力的增加，较为脆弱的组织逐渐被拉断，后阶段拉断致密的弹性组织需要更大的拉伸力，形变相对较小，两血管的弹性模量明显增大直至最终的拉断，轴向拉伸时，冻干后血管轴向的弹性性能有所减弱，并且由于弹性纤维等纵向排列的特点，轴向方向更加抗拉，拉伸应力值较周向方向高出许多，即使拉伸后期发生弹塑性变形或塑性变形，拉伸率依然较周向拉伸高。除各方向的拉伸弹性及强度外，血管硬度也是一个十分重要的指标。冻干前后血管硬度变化量的测定，实验中主要利用质构仪对血管穿刺过程的力学变化分析加以完成。

2.4 不同冻干方法的血管穿刺过程曲线血管穿刺时，质构仪软件可将穿刺过程中传感器获得的数据以曲线图绘制出来。冻干前后血管穿刺力随时间变化见图7。穿刺时管壁内侧向上，刺针由贴近壁面开始，逐渐深入，在曲线最高点即最大穿刺力出现之前，曲线出现几个小阶段的回缩，直至最终穿透管壁，此时穿刺力达到最大。图中除最大穿刺力的值有所不同外，曲线最高点出现的时间也略有不同，冻干复水血管的时间早于新鲜血管。在最高峰值出现前，有几个小峰值的波动，说明此时的血管正依次由刺破血管的表面而渐渐深入，穿刺力也在增加，中间各膜层组织结构不同，承受的力也有不同，在穿透这些组织时，穿刺力出现了一定的波动；最大峰值的出现，表明这时的血管被完全刺穿。两种血管的穿刺力曲线的趋势基本相同，说明冻干虽对组织结构和弹性等有一定的破坏，但是组织的排列方式、各膜层的相对位置并没有改变，冻干复水的血管在很大程度上依然保留了新鲜血管的各项结构。

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引言

心血管疾病如脉管炎、血管严重栓塞等，已成为影响人类健康的主要疾病，对于这类疾病，血管移植是一个良好的治疗方式。而待移植血管材料的使用就成为了此种方法能否取得效果的关键^[1-2]。移植的血管材料主要有活体材料和人工复合材料两大类。其中，人工复合材料由于研究技术及方法的局限性，还不能完全满足血管复杂的生理结构及功能，在使用时受到很大的限制；而活体组织材料的获取恰能弥补这方面的不足。活体材料移植前，必须经过保存、去除抗原等环节，目前主要的方法有低温保存、真空冷冻干燥保存等。真空冷冻干燥技术是近年来广泛用于食品^[3-5]、生物^[6-7]、医疗领域的一项重要方法^[8-10]，将冷冻干燥技术用于血管密封保存，能够在4 ℃甚至常温下长时间保存，大量减少液氮等制冷物质的消耗，降低成本，具有良好的前景。对于待移植的血管，血管的各项功能能否适应受体环境、满足受体各项生命活动的需要，成为移植是否成功的关键因素。其中，冻干前后血管力学性能的变化也成为移植进行过程的重要检测指标。移植后的血管应能抵抗血液流动方向的冲刷及流向管壁方向的各类应力，因此轴向、周向方向的拉伸，血管的硬度等成为冻干前后血管力学性能测试的重要方面。血管本身的结构分为内膜、中膜及外膜，这些又分别由致密的结缔组织、胶原纤维及弹性显微构成，根据各膜层的特性不同，这些成分的组成各有差异^[11-12]。在对血管的各项力学性能有了数值方面的分析和形变过程的认知基础上，切片染色处理，显微观察不同处理方法所造成的组织纤维结构变化。针对力学的各项数据，通过微观的结构分析力学变化的原因和机制，即宏观力学与微观机制相结合，在微观层次中观察组织结构，建立其与宏观力学之间的联系。本实验采用猪主动脉血管为材料，利用动态力学分析仪(DMA-Dynamic Mechanical Analyzer)测定拉伸应力变化情况^[13-14]，质构仪(Texture Analyzer)测定其穿刺变化情况^[15-18]，使用常规方法对血管进行石蜡包埋及切片处理，行苏木精-伊红染色。通过拉伸曲线，并结合微观结构的观察，分析血管内部结构及力学性能之间的影响，为动脉的生理功能及相关移植研究提供必要的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点实验于2013年10月至11月在上海理工大学完成。

1.3 材料

1.3.1 材料及制备猪主动脉血管，上海复新屠宰场新鲜宰杀后，取主动脉血管，洗净，置于生理盐水中，放置在 4 ℃环境下2 h，取出，将血管剪成15 mm的血管段，待实验用。

1.3.2 切片制作相关仪器密封式组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡包埋组织轮转切片机、烤片机、隔水式电热恒温水浴箱、显微镜(LH-M100C-1，Nickon，日本)、动态力学分析(Q800，TA，美国，用于研究材料或各种分子聚合物不同力学性能^[19-23])、质构仪(AGS-H EZTest，岛津公司，日本，即物性分析仪^[24]，反映与力学特性有关的样品质地特性，以评价样品品质^[25-28])。

1.4 实验方法

1.4.1 力学测试方法血管周向及轴向示意图见图1。取新鲜血管的中间部分，剪成宽3 mm的小血管段，再将此血管段两边分别剪断，成为同一个周向上大小基本相同的2血管条，一段做新鲜状态时的DMA拉伸实验，另一段冻干复水后再进行拉伸测试并与新鲜时得到的结果比较。

同样，对轴向拉伸、穿刺实验的血管剪取和处理时，依然选择同一周向方向的血管，分别剪成3 mm×15 mm、7 mm×7 mm的多段血管条和血管片，用于新鲜及复水后轴向拉伸、穿刺的分析比较。

DMA工作条件设定为初始应力0 N，以3 N/min增大至18 N，此过程中以血管拉断作为过程结束。

质构仪的工作负载设定为500 N、30 mm/min穿刺，以刺针穿透管壁作为穿刺结束。

每项实验分别做3组平行实验以减小个体误差。

1.4.2 冷冻干燥方法血管冻干时，预冻的搁板温度设置为-70 ℃，一次干燥及二次干燥温度分别为-20 ℃和10 ℃。

1.4.3 制作切片及染色方法对血管进行包蜡、切片、苏木精-伊红染色、脱水、透明和封固处理。

1.5 主要观察指标新鲜与冻干复水猪血管切片的结构、形态、组织排列等。

讨论

文章快阅

延伸阅读

真空冷冻干燥基本原理：与其他干燥方法一样，要维持升华干燥的不断进行，必须满足两个基本条件，即热量的不断供给和生成蒸汽的不断排除。在开始阶段，如果物料温度相对较高，升华所需要的潜热可取自物料本身的显热。但随着升华的进行，物料温度很快就降到与干燥室蒸汽分压相平衡的温度，此时，若没有外界供热，升华干燥便停止进行。在外界供热的情况下，升华所生成的蒸汽如果不及时排除，蒸汽分压就会升高，物料温度也随之升高，当达到物料的冻结点时，物料中的冰晶就会融化，冷冻干燥也就无法进行了。

供给热量的过程是一个传热过程，排除蒸汽的过程是一个传质的过程，因此，升华干燥过程实质上是一个传热、传质同时进行的过程。自然界中所发生的任何过程都有驱动力，升华干燥中的传热驱动力为热源与升华界面之间的温差，而传质驱动力为升华界面与蒸汽捕集器（或冷阱）之间的蒸汽分压差。温差愈大，传热速率愈快；蒸汽分压差愈大，传质（即蒸汽排除）速率愈快。

冻干时，既要保持产品的优良品质，又要取得较快的干燥速率。升华所需要的潜热必须由热源通过外界传热过程传送到被干燥物料的表面，然后再通过内部传热过程传送到物料内冰升华的实际发生处。所产生的水蒸气必须通过内部传质过程到达物料的表面，再通过外部传质过程转移到蒸汽捕集器（冷阱）中。任何一个过程或几个过程一起都可能成为干燥过程的“瓶颈”，它取决于冻干设备的设计、操作条件以及被干燥物料的特征。只有同时提高传热、传质效率，增加单位体积冻干物料的表面积，才能取得更快的干燥速率。

水有固态、液态、气态三中态相.根据热力学中的相平衡理论,随压力的降低,水的冰点变化不大,而沸点却越来越低,向冰点靠近.当压力降到一定的真空度时,水的沸点和冰点重合,冰就可以不经液态而直接汽化为气体,这一过程称为升华.食品的真空冷冻干燥,就是在水的三相点以下,即在低温低压条件下,使食品中冻结的水分升华而脱去。

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