组织工程肌腱离临床应用有多远：如何解决力学性能、组织融合性及后期退化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：组织工程肌腱已经被应用到修复破坏的肌腱组织，作为肌腱损伤修复过程中重要的方法，已成为研究的热点。
目的：通过对种子细胞的种类及优缺点、支架材料的设计及优缺点以及诱导肌腱形成的因素进行阐述，促进每个关节点的优化，有利于组织工程肌腱的成熟构建。
方法：检索中国生物医学文献数据库(CBM)、中国知识资源总库(CNKI)系列数据库、中文科技期刊数据库、PubMed数据库2000年1月至2015年1月收录的肌腱组织工程相关综述和论文报告，检索词为组织工程Tissue Engineering)；肌腱(tendon)；肌腱缺损，并分析其种子细胞、支架及诱导途径的研究进展。
结果与结论：总结近年来组织工程肌腱在肌腱损伤中的研究工作，讨论包括种子细胞、支架、诱导因素在内的研究方法。肌腱干细胞作为种子细胞是目前组织工程肌腱研究过程中的首选，不仅具有与同种或者同体肌腱的同源性，而且分化增殖能力较强。但目前对于肌腱干细胞的获取及增殖培养无系统的方案；目前组织工程肌腱的支架材料及支架设计不能达到临床上对于组织工程肌腱力学的要求，形成的肌腱组织力学性能差，与宿主组织融合差，后期容易退化甚至功能性废用等原因；诱导因素作为最后的关键因素，对于其诱导因子的选取和利用是调控肌腱组织发育的必备条件。但诱导因子的种类与利用途径之间的联系及相互关系尚不完全明确，也有待进一步发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 肌腱缺损, 种子细胞, 支架, 诱导因子, 肌腱干细胞, 力学性能, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tissue-engineered tendons have been used to repair the damaged tendon tissue. Use of tissue-engineered tendons for repair of tendon injury has become a hot spot in this research field.
OBJECTIVE: To elaborate the types, advantages and disadvantages of seed cells, the design method, advantages and disadvantages of scaffold materials, and the factors that induced the formation of tendon, so as to promote the optimization of each joint, all of which benefit for mature construction of tissue-engineered tendons.
METHODS: The related reviews and paper reports of tendon tissue engineering published from January 2000 to January 2015 were retrieved from Chinese Biomedical Literature Database (CBM), China Knowledge Resources Database (CNKI) series database, Chinese Citation Database and PubMed database. The key words were “tissue engineering; tendon; tendon defect”. The research progress of seed cells, scaffold material and induction factors were analyzed.
RESULTS AND COMCLUSION: The recent research of tissue-engineered tendons for repair of tendon injury has
been summarized. Seed cells, scaffold, induction factors were discussed. Tendon stem cells, as a kind of seed cells, are currently the first choice in the process of tissue engineering tendon research, because tendon stem cells have the homology of the homogenous or autologous tendons and possess strong differentiation and proliferation capacities. However, there have been no systematic schemes regarding acquisition and proliferation and culture of tendon stem cells. The currently designed tissue-engineered tendons cannot meet the clinical requirements because of poor mechanical properties of tendon tissue, poor integration with the host tissue, being susceptible to degradation in late period and functional disuse. Induction factors are the laft key factors for tissue-engineered tendons for repair of tendon injury. The selection and use of induction factors are prerequisites for the regulation of tendon tissue development. But the categories of induction factors and the association and interrelationship between induction factors have not been fully clear and studies are needed to further investigate these uncertainties.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tendons, Tendon Injuries, Stents, Stem Cells

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

2.1 种子细胞种子细胞的选择是组织工程肌腱中最基本也是首要环节，要具备多分化、来源广、易培养、增殖分化程度较高等特点[7]。目前常用的种子细胞有肌腱细胞、皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞、脂肪源干细胞、骨髓间充质干细胞和诱导的多能干细胞等[8]。
2.1.1 肌腱细胞肌腱细胞是组织工程肌腱理想的种子细胞之一，因为自体肌腱细胞诱导成肌腱的微环境因素相对于其他同种异体或异种的肌腱细胞影响要小[9]。但是，其来源有限，供区并发症明显，细胞增殖慢，体外扩增时间长等限制了这一细胞的使用[10]。以猪的自体肌腱细胞作为种子细胞介导修复肌腱缺损，虽然能再生出与自体肌腱相似的组织，但是经过多次传代后丧失分泌基质的功能，而且随着老化和凋亡，肌腱细胞增殖缓慢，影响了功能传代，最终得到肌腱的困难程度明显增加，诱导的肌腱组织功能也会显著折扣[11]。所以找到一种能使肌腱细胞快速增殖，又不影响功能传代的方法，是当前研究的方向，也为未来肌腱细胞成为理想的种子细胞提供广阔的前景。
2.1.2 皮肤成纤维细胞电镜观察皮肤成纤维细胞与肌腱细胞在形态和组织学上十分相似，而且来源广泛，增值能力也很强。除此之外，在胶原排列方向和生物力学特性等方面也较为相似，其生物力学强度能达到正常肌腱功能的一半以上[12]。这意味着成纤维细胞能够应用于肌腱组织工程。Liu等[13]分别用猪的皮肤成纤维细胞和肌腱细胞作为组织工程化肌腱的种子细胞，并将二者进行比较，结果显示皮肤成纤维细胞可以替代肌腱细胞应用于肌腱组织工程。但是，皮肤成纤维细胞在增值过程中，排列紊乱，修复部位易出现骨化，并且存在畸胎瘤发生的可能性。
2.1.3 骨髓间充质干细胞研究表明，骨髓干细胞在组织工程学中的应用十分广泛[14]。在适宜的条件下可以分化成骨组织、软骨组织、神经组织及肌腱组织。这种分化的潜能不会轻易受到影响，即使是体外培养和冷冻保存后也一样[15]。Dressler等[16]将不同年龄时期兔的骨髓间充质干细胞种植于Ⅰ型胶原支架，并植入兔体内，结果显示所形成的肌腱样组织在组织学及力学性能方面都无明显差别，因此可以证明骨髓间充质干细胞能够修复肌腱缺损。但是，骨髓穿刺可能导致严重的疼痛、感染、等并发症，再加上骨髓干细胞所能获取的数量较少，限制了其在修复骨骼肌肉等疾病的广泛应用[17]。而且培养扩增骨髓间充质干细胞的方案还没有十分完善，其在组织工程中的应用仍待于研究。
2.1.4 脂肪干细胞脂肪干细胞在适宜的刺激下，具有骨髓基质干细胞相同的向多种细胞分化的潜能与强大的自我增值能力。而且其获得的途径简单易行。研究表明，通过脂肪抽吸及穿刺活检等方法所获得的血管基质部分含有脂肪干细胞及其他祖细胞，其细胞数量约为经骨髓穿刺获得的骨髓干细胞数量的2 500倍[18]。Yin等[19]在纳米纤维支架上培养的脂肪干细胞明显高表达肌腱特异性标志基因，说明脂肪干细胞能够作为种子细胞诱导产生肌腱组织。但是正由于脂肪干细胞的来源较广，没有统一的培养渠道，导致其不可预见性较大。
2.1.5 肌腱干细胞除以上介绍的几种种子细胞以外，有研究报道从小鼠、大鼠、成人和家兔的肌腱组织内均发现肌腱干细胞[20]，该细胞具有自我更新的能力，其增殖速度相对于间充质干细胞更快[20]，而且，肌腱干细胞来源于肌腱组织本身，移植后的微环境更有利于细胞的生长和分化[21]，更重要的是，移植后肌腱干细胞能从组织学和生物力学方面达到肌腱修复的效果[1]。所以，肌腱干细胞将成为组织工程肌腱构建的理想种子细胞[22]。随着细胞生物学的发展，组织工程肌腱的种子细胞将逐渐被完善，并被统一化。
2.2 支架材料的选择和设计
2.2.1 支架材料的选择和制备选择合适的支架非常关键，它必须具有一定的机械强度、合适的降解速度、稳定的张力、耐磨性好、无免疫原性及良好的生物相容性[19]。目前常用的有天然材料、人工合成材料、复合材料及生物衍生材料等。其中天然生物材料主要有蚕丝、小肠黏膜下层、胶原、衍生肌腱支架材料等，保留了组织正常的三维网架结构，组织相容性好，但力学性能较差、降解速度快[23]。人工合成高分子材料主要为聚乳酸和聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚磷酸钙纤维等[24]，它们有良好的力学性能和降解性，但存在亲水性低、细胞黏附性能差的缺点[24-25]。复合材料作为以上两者的结合，取精华去糟粕，在临床应用中具有一定的潜力[26]。复合生物材料最接近人体的网状结构、生物力学性能，有类似自然组织的构型和功能[27]，有望成为肌腱组织工程理想的材料。常用的组织工程肌腱支架的制备方法包括静电纺丝，自组装多肽，相位分离等；其中静电纺丝是一种多功能的实用的可以编制多种合成材料和复合材料支架的方法，可以模拟正常肌键的结构和纳米组成，同时拥有较大的内部空间和孔隙率利于种子细胞生长。
2.2.2 支架的设计为了使制造出来的肌腱组织有更好的力学功能，支架的设计也是至关重要的。有限元在骨科领域的应用越来越广泛，基于化整为零，集零为整的基本思想，能够对许多结构进行精确的力学分析。将支架与有限元分析结合起来，通过建立支架材料的三维模型，用有限元数值方法来计算、模拟该材料的受力情况[28]，找出最佳应力范围，既可以使细胞在支架上沿受力方向定向生长又可以避免超出肌腱的受力范围，造成肌腱疲劳，合成代谢下降[29-30]。与支架的材料相比，应力刺激不但对支架结构强度有很大的影响[30]，而且可以促进种子细胞的活性与细胞外基质的表达[30-32]。通过对支架进行周期性拉力或持续性拉力不同方式的试验，长出来的组织才能具有与正常人体肌腱组织接近的力学性能。Legerlotz等[33]通过实验获得，不同的应力幅度和时间作用于体外肌腱细胞，其合成和分解代谢的主次不同。雷星等[34]通过对比组织工程肌腱在持续动态拉力刺激和静态非受力状况发现，前者胶原基质不断沉积，排列逐渐有序、规则，细胞/基质比例逐渐增加，而后者肌腱胶原基质缓慢降解，结构渐无序、松散。
2.3 组织工程肌腱的诱导因素多数组织工程研究集中在支架材料的设计、制作及对其生物相容性，降解性的检测上，而对肌腱诱导能力的相关机制则少有研究。如今，国际上对于支架的研究从简单的物理支架设计已经转移到生物学诱导功能[35]，此生物功能重点强调支架材料具有促进种子细胞定向分化，使其高效诱导分化为肌腱细胞。比如种子细胞的分化受细胞周围环境中物理、化学及生物因素的调控。
2.3.1 诱导因子的种类 ①多数生长因子都能促进种子细胞增殖并向腱细胞方向分化，强化组织工程肌腱的生物力学的活性。常用的生长因子有骨形态发生蛋白12、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、转化生长因子β、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子。②有研究报道Mohawk(Mkx)在肌腱发育中的重要作用。通过Mkx敲除的小鼠，观察其尾部形态呈波浪形且大多数肌腱发育不正常。说明Mkx参与肌腱发育过程，是肌腱发育所必须的关键转录因子[36-38]。
2.3.2 诱导因子的利用途径给予外源性诱导因子的途径有直接加入诱导因子和通过载体缓释诱导因子。但是组织工程研究过程中，由于换液和各种操作的复杂性，再加上细胞因子活性的不稳定，直接加入可能造成浓度的波动较大，影响生物学效果。采用病毒或质粒等载体缓释诱导因子，可使因子达到稳定释放，蛋白稳定表达。但是缓释因子的载体很难制备、体内不能重复利用、可能导致感染等的缺陷以至于临床上对于非病毒载体的研究越来越多[39]。研究表明，非病毒的基因载体容易批量生产，安全性能好，携带的遗传物质容量大[40]。其中，聚乙烯亚胺已经成为非病毒载体领域衡量其他类型载体效率的一个“金标准”[41]。

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