不同突出类型腰椎髓核中缺氧诱导因子1α的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：椎间盘内为缺氧的环境，研究发现缺氧诱导因子1在调节缺氧诱导的基因表达中起重要作用。缺氧诱导因子1由α和β两种亚基组成，其中缺氧诱导因子1α决定缺氧诱导因子1的稳定和活性。
目的：观察缺氧诱导因子1α在人不同突出类型腰椎间盘突出症髓核中的表达，判断各组之间的关系。
方法：取腰椎髓核组织标本60例，41例取自L4-5髓核组织，19例为L5-S1。髓核组织分为突出组、游离组各30例。同时选取腰椎骨折脱位患者的腰椎髓核组织标本10例作为对照组。采用苏木精-伊红、链霉素-过氧化物酶复合物免疫组织化学技术，观察各组突出腰椎髓核组织学变化并测定缺氧诱导因子1α的表达。
结果与结论：游离组、突出组和对照组都可观察到缺氧诱导因子1α的表达，分别为(58.2±7.5)%，(27.3±2.3)%和(10.5±4.7)%。游离组缺氧诱导因子1α在髓核的表达显著高于突出组和对照组(P < 0.01)。结果提示腰椎间盘突出症髓核组织中缺氧诱导因子1α的表达与突出类型有关，在脱垂游离型中表达最高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 椎间盘突出, 髓核组织, 缺氧诱导因子1α

Abstract:

BACKGROUND: Under hypoxic environment, hypoxia inducible factor-1 plays an important role in regulation of hypoxia-induced gene expression in the intervertebral disc. Hypoxia-inducible factor-1 consists of α and β subunits, and which hypoxia inducible factor-1α determines the stability and activity of hypoxia-inducible factor-1.
OBJECTIVE: To observe the expression of hypoxia inducible factor-1α in the human lumbar nucleus pulposus of different herniated types and to judge their relationships.
METHODS: A total of 60 nucleus pulposus samples were harvested from the lumbar vertebra, including 41 from L4-5 and 19 from L5-S1, and then divided into protruded group and sequestered group, with 30 cases in each group. Meanwhile, another 10 samples of lumbar nucleus pulposus served as controls. Hematoxylin-eosin staining and streptavidin-biotin peroxidase complex immunohistochemical technique were used to observe the expression of hypoxia inducible factor-1α in the human lumbar nucleus pulposus in different groups.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression level of hypoxia inducible factor-1α was (58.2±7.5)% in the sequestered group, (27.3±2.3)% in the protruded group, and (10.5±4.7)% in the control group, which was significantly higher in the sequestered group than the other two groups (P < 0.01). These findings indicate that the expression of hypoxia inducible factor-1α in the lumbar nucleus pulposus is associated with the herniated types, which is the highest in the prolapse sequestered type.

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Key words: Intervertebral Disk Displacement, Spinal Cord, Hypoxia-Inducible Factor 1

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：分组对照观察。
时间及地点：实验于2010年1月至2014年2月在上海交通大学医学院附属第三人民医院完成。
材料：

缺氧诱导因子1α在不同突出类型腰椎髓核中的表达试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
小鼠抗人单克隆抗体缺氧诱导因子1α(即用型)	SANTA CRUZ BIOTECHOLO- GY
二抗(羊抗小鼠，即用型)、二氨基联苯胺溶液(DAB显色剂)	SANTA CRUZ BIOTECHOLOGY
枸橼酸溶液(即用型)、PBS溶液(即用型)	上海长岛生物技术有限公司，中国
微升微量进样器	上海安亭微量进样器厂
石蜡切片机、光学显微镜、OLYMPUS IX51型倒置荧光显微镜	上海交通大学附属第三人民医院病理科、实验中心提供

髓核组织标本选择及分组：髓核组织标本选自本院2010年1月至2014年2月腰椎间盘突出症患者60例。手术方法均为腰椎后路椎板开窗髓核摘除。男34例，女26例，年龄20-71岁，平均年龄52.0岁，41例取自L4-5髓核组织，19例为L5-S1髓核组织。髓核组织分为突出组、游离组各30例。同时选取腰椎骨折脱位患者的腰椎髓核组织标本10例作为对照组，男9例，女1例，年龄27-55岁，平均年龄为40.0岁。每组患者均知情同意。
诊断标准：符合腰椎间盘突出症的诊断标准，采用1983年Mcculoch制定的标准，即：①腿痛大于腰痛。②神经支配区的感觉减退。③直腿抬高小于正常的50%。④腱反射异常。⑤加强试验阳性。
纳入标准：不伴有腰椎管狭窄及其他退行性疾病，经X射线、CT和MRI证实腰椎间盘突出症者。
排除标准：慢性呼吸系统疾病、糖尿病、贫血等缺血缺氧性疾病除外。
实验方法：
标本处理：将手术中取出的3组髓核组织，体积分数4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋。每个髓核标本4 μm连续贴邻切片共4张，2张行苏木精-伊红染色，2张用于缺氧诱导因子1α免疫组织化学染色。所有检测对象都经过患者本人同意。
髓核组织切片苏木精-伊红染色：髓核标本二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，苏木精染色，5 min，标记细胞核。乙醇分化，10 s，去除非特异性染色。伊红染色，1min，标记细胞浆。乙醇梯度脱水。二甲苯溶液增强切片透光度。干燥后封固。
髓核组织切片缺氧诱导因子1α染色：髓核标本二甲苯脱蜡。乙醇梯度水化。体积分数3% H2O2溶液，30 min，封闭内源性过氧化物酶。切片浸入枸橼酸溶液中，微波加热15 min，抗原修复。室温下冷区，PBS冲洗3遍，5 min/次。单克隆抗体缺氧诱导因子1α，50 μL，室温下1 h。PBS冲洗3遍，5 min/次。二抗，50 μL，室温下1 h。PBS冲洗3遍，5 min/次。DAB溶液染色，显微镜观察后中止染色。室温水冲洗5 min。苏木精复染5 min，标记细胞核。乙醇分化10 s，去除非特异性染色。室温水冲洗5 min。乙醇梯度脱水。二甲苯溶液增强切片透光度。干燥后封固。
结果判读：单克隆抗体缺氧诱导因子1α免疫组织化学染色标记后，显微镜下可见髓核细胞核或细胞浆呈棕褐色，即为阳性细胞。每个标本计数8个高倍镜(×200)下视野内的所有阳性细胞个数和所有细胞数，求其比值。
计算公式：
每张切片由2名观察者分别读片得出，如2位观察者读片结果相差较大，则重复行免疫组织化学实验。
主要观察指标：①各组髓核组织苏木精-伊红染色形态学观察。②免疫组织化学方法观察各组髓核组织缺氧诱导因子1α表达情况。
统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件，采用单因素方差分析法中SNK检验分析总体差异及各组间差异，P < 0.01时被认为差异有显著性意义。

讨论

腰椎间盘突出症的分型方法较多，各有其根据及侧重点。从病理变化及CT、MRI发现，结合治疗方法可分为膨隆型、突出型、脱垂游离型、Schmorl结节及经骨突出型。其中突出型和脱垂游离型常需手术治疗。该病严重时可以压迫马尾神经造成尿便失禁，或压迫神经根造成足下垂，严重影响患者的生活质量。在成人丧失劳动能力的原因中，下腰痛位居第3位，腰椎间盘突出为下腰痛的主要病因[5-6]。因此，腰椎间盘突出症的治疗应引起足够的重视。椎间盘退行性变是椎间盘突出症的基本原因。骨髓核细胞的可替代表型细胞存活减少、代谢活性降低、基质产生减少和营养不良性钙化或许可能成为椎间盘退化的关键促进因素[7]。有研究表明人类椎间盘组织在20岁后逐渐退变，而衰老、遗传、心理、肥胖、脊柱过度轴向负荷等多种因素都可以加快椎间盘退变[8]。椎间盘退变的主要组织形态改变表现为髓核细胞坏死、变性，细胞外基质的合成减少[9]。随着年龄增长，纤维环和髓核含水量逐渐减少，使髓核张力下降，椎间盘变薄。
椎间盘是人体最早发生退行性变的组织之一，正常椎间盘是一个无血管的组织。椎间盘营养供应主要是通过两个途径被动扩散而来，一是终板途径，即椎体内血管的营养物质通过骨髓腔血窦-软骨终板界面扩散到椎间盘，营养髓核与纤维环内层，是椎间盘主要的营养途径；二是纤维环途径，即纤维环表面血管营养纤维环外层[10-11]，营养范围相对较小，是椎间盘营养的次要途径。椎间盘所需的氧、葡萄糖和基质代谢所需的氨基酸、硫酸盐等主要营养成分，通过周围的毛细血管，经椎间盘致密的细胞外基质来营养位于中心的髓核内细胞，而椎间盘的代谢废物通过相反的途径排泄至周围的毛细血管中。机体生长发育和老化过程中，椎间盘中央部位细胞和基质的改变主要是营养供应减少，营养不足被认为是造成椎间盘退变的基本因素。椎间盘细胞需要营养成分以维持其活性和功能，其能量的主要提供形式是糖酵解，椎间盘以较高的比例消耗葡萄糖和产生乳酸，故充足的葡萄糖是维持椎间盘细胞活性所必须的。椎间盘细胞主要以糖酵解形式生成ATP，同时也产生乳酸，椎间盘中心为低氧浓度，为缺氧的环境[12]。
缺氧诱导因子1是一个普遍存在于人和哺乳动物细胞内的缺氧应答因子，是细胞在缺氧环境下重要的转录因子[13]。缺氧诱导因子属于核蛋白[14]，通常在组织处于缺血缺氧的状态下形成，缺氧诱导因子可以和靶基因结合，从而造成机体对缺血缺氧形成耐受性。它最先由Semenza于1992年在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现[15]。缺氧诱导因子1的发现使人们对缺血、缺氧状态下机体各种应答反应机制的研究更加深入。缺氧诱导因子1属于DNA结合蛋白，主要以异源二聚体的形式存在，由缺氧诱导因子1α和缺氧诱导因子1β两种亚基组成[16-17]。缺氧诱导因子1的稳定和活性是由缺氧诱导因子1α决定的[18]，缺氧诱导因子1α蛋白可作为低氧的指标[19]。
缺氧诱导因子1α的调节受到多种因素的影响，且缺氧诱导因子1α是专一受O2调节的亚基，在常氧下极不稳定，而缺氧则抑制其降解，缺氧诱导因子1α可促进糖酵解蛋白酶的表达和激活,从而对细胞起保护作用[20]。缺氧抑制因子可阻断α亚基与转录共激活因子的结合，从而抑制缺氧诱导因子1的转录[21]。在缺氧条件下，线粒体活性氧(ROS)的增加可阻止缺氧诱导因子1α羟基化，从而可上调缺氧诱导因子1α和其下游靶基因[22]。
缺氧诱导因子1α家族还包括缺氧诱导因子2α和缺氧诱导因子3α，其中缺氧诱导因子2α在结构和功能上与缺氧诱导因子1α类似，而缺氧诱导因子3α由于缺少一个缺氧诱导域，所以在功能上和前两者存在区别。缺氧诱导因子1α的研究最为透彻，在很多有关缺氧的研究中，它被作为主要的调控因子来研究，且被证实在很多的生理及病理过程中起重要作用[23]。缺氧诱导因子1α在人类关节软骨及大鼠髓核细胞中可检测到其表达。椎间盘是人体最大的无血管组织，其组织形态及生理结构与软骨细胞相似；并且椎间盘内是一个缺氧的环境，而缺氧诱导因子1α在缺氧的条件下比较稳定。近来国内外学者在患者突出的椎间盘中监测到了缺氧诱导因子1α的表达[24-25]。王俊丰等[26]研究发现退变椎间盘组织中缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子呈高表达，且各组中缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子的表达均高度相关。
本实验同样在退行性变的人腰椎间盘髓核组织中检测到了缺氧诱导因子1α的表达。结果显示缺氧诱导因子1α在游离组的表达明显高于突出组，突出组高于对照组。推测：①椎间盘内为缺氧的环境，缺氧诱导因子1α是专一受O2调节的亚基，在常氧下极不稳定，而缺氧则抑制其降解，与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点－缺氧反应元件(HRE)结合，从而启动靶基因的转录表达。这些靶基因分别与能量代谢、血管生成、细胞生长、细胞增殖、细胞凋亡、缺氧条件下的基质产生、糖代谢、铁代谢、血管舒缩和肿瘤耐药等密切相关[27]，从而对细胞起保护作用[20]。②缺氧诱导因子1α在各组的表达不同，可能与各组髓核营养来源有关，游离组缺氧程度大于突出组。椎间盘是一个无血管组织，其营养和代谢的提供主要依靠周围血管通过软骨终板的扩散﹑渗透来完成[28]。破裂型髓核已突破纤维环，但因后总韧带的限制，其突出区域不会太大，可部分依靠周围的软骨终板﹑纤维环获取营养；游离型髓核游离于椎管内，突出的区域范围大，营养来源匮乏，故缺氧程度较突出组严重[29]。
缺氧诱导因子1α作为机体细胞适应低氧的重要转录调节因子，在椎间盘细胞的低氧生存过程中一定起到了至关重要的作用，缺氧诱导因子1α的高表达可能是机体为延缓椎间盘退行性变而做出的保护反应，机体可能通过上调缺氧诱导因子1α的表达，并进而通过一系列复杂的机制来延缓椎间盘细胞的衰老。腰椎间盘突出是一个复杂的过程，受多因素多环节的影响，其机制至今不明，不同年龄段腰椎间盘突出病因也不全相同，进一步阐明缺氧诱导因子1α在不同类型椎间盘突出中的表达，有望进一步阐明椎间盘退行性变的病理生理过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程