丹参酮ⅡA对子宫缺血再灌注损伤模型大鼠的保护效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：损伤造成的组织器官暂时缺血现象临床常见，但对其缺血再灌注损伤干预的研究甚少。利用大鼠子宫缺血再灌注损伤模型研究丹参酮ⅡA对改善大鼠子宫缺血再灌注损伤作用有意义。
目的：观察丹参酮ⅡA在干预大鼠子宫中抗缺血再灌注损伤中的作用。
方法：采用线栓法建立子宫缺血再灌注损伤模型大鼠，在术前第5，3，1 天及术前30 min 给予腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液20 mg/kg，设为干预组，并设模型组和假手术组作对照。
结果与结论：分光光度计测量和免疫组织化学染色结果显示，缺血再灌注1，3 h，与模型组比较，干预组损伤子宫组织中丙二醛浓度、Bax蛋白的表达显著降低(P < 0.05)，而超氧化物歧化酶活性、Bcl-2蛋白表达显著提高(P < 0.05)。结果证实，丹参酮ⅡA对大鼠子宫缺血再灌注损伤具有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 组织工程, 丹参酮ⅡA, 缺血再灌注损伤, 大鼠, 子宫, 超氧化物歧化酶, 丙二醛, Bax, Bcl-2, 干预, 免疫组织化学

Abstract:

BACKGROUND: The phenomenon of temporary ischemia of the tissues and organs caused by injury is common in the clinic. However, there are few studies on the treatment of ischemia/reperfusion injury. It is significant to investigate the effect of TanshinoneⅡA on improving uterine ischemia/reperfusion injury in a rat model.
OBJECTIVE: To observe the effect of TanshinoneⅡA intervention on improving uterine ischemia/reperfusion injury in rats.
METHODS: The rat models of uterine ischemia/reperfusion injury were established by suture method. The rats that were intraperitoneally injected with Sodium Tanshinone IIA Silate injection (20 mg/kg) at 5, 3, 1 days and 30 minutes before the operation were included in the experimental group. Model and sham operation groups were established for comparison.
RESULTS AND CONCLUSION: Spectrophotometry and immunohistochemical staining results showed that at 1 and 3 hours of ischemia/reperfusion, the malondialdehyde concentration and Bax protein expression in the injuried rat uterine tissue were significantly decreased (P < 0.05), superoxide dismutase (SOD) activity and Bcl-2 protein expression were significantly increased (P < 0.05) in the experimental group than in the model group. The results confirm that TanshinoneⅡA has a protective effect on uterine ischemia/reperfusion injury in rats.

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Key words: Tissue Engineering, Animal Model, Uterus

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：随机对照动物模型实验。
时间及地点：于2011年5月至2011年8月在吉林医药学院中心实验室完成。
材料：
实验动物：选用清洁级8周龄Wistar雌性大鼠48只，体质量183-257 g，由吉林大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(吉)：2008-0005。

子宫缺血再灌注损伤动物模型的构建相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
丹参酮ⅡA磺酸钠注射液	上海第一生化药业有限公司
Bax、Bcl-2、丙二醛、超氧化物歧化酶和 SP免疫组织化学试剂盒	武汉博士德有限公司
ED5A型凯达离心机	湖南凯达科学仪器有限公司
电子精密天平	上海精密仪器厂
UV-755B型外可见光分光光度计，显微镜	上海医疗器械七厂

实验方法：
分组：Wistar大鼠48只按随机数字表法分为3组，每组16只。Ⅰ组为假手术组：只进行开腹未行动脉阻断。Ⅱ组为子宫缺血再灌注组(以下简称模型组)：腹腔动脉阻断 45 min后解除阻断。Ⅲ组为干预组(以下简称干预组)：实验前应用参酮ⅡA干预。
动物模型制备及干预：采用线栓法制备子宫缺血再灌注模型大鼠[2]。大鼠造模前6 h禁食，室温20-25 ℃下，用体积分数10%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，视大鼠角膜反射、是否有肌肉颤动等情况，将大鼠维持一定的麻醉深度，成功后，将其仰卧固定，于下腹部正中做一纵形切口，长(5±1) cm，并以切口下端为中点，向两侧各延长1 cm，形成一“⊥”形切口，以便充分暴露大鼠子宫及邻近脏器，将两侧腹壁组织外翻，4-0丝线缝扎固定，以避免遮挡视野，增加手术时间，用湿润棉签和眼科镊轻柔向上推离大鼠肠管，暴露大鼠子宫，大隐静脉注射50 U/kg肝素5 min后，应用玻璃分针钝性分离大鼠腹腔动脉，注意辨明髂腰动、静脉，避免损伤致大出血，在髂总动脉分叉处上方0.5 cm处用4-0丝线以方结结扎腹腔动脉，剪断下腹壁两侧固定缝扎线，以减少大鼠腹腔脏器水分的流失45 min后去除结扎线，形成再灌注[3]。
干预组在实验前第5，3，1天及术前30 min给予腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液20 mg/kg[4]，模型组和假手术组给予腹腔注射等量生理盐水。
大鼠子宫组织超氧化物歧化酶活性及丙二醛浓度检测：再灌注1，3 h取大鼠子宫组织，将子宫组织在冰冷生理盐水中漂洗干净，除去血液，滤纸拭干，称质量后，加入4 ℃的HEPES缓冲液中，其体积是子宫组织块质量的9倍，用玻璃匀浆器制成匀浆，匀浆液以3 000 r/min，离心15 min，取上清液，-70 ℃冰箱中保存备用。利用分光光度计检测大鼠子宫组织的丙二醛浓度。
免疫组织化学染色：取大鼠子宫组织，40 g/L多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、脱水、切片，厚5 μm。烤片，68 ℃，20 min。常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；体积分数3%H2O2 37 ℃孵育10 min，PBS冲洗3×5 min。抗原修复：置于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中用煮沸95 ℃，15-20 min，自然冷却20 min 以上，正常羊血清工作液封闭，37 ℃孵育10 min，倾去勿洗。滴加山羊抗大鼠Bax、Bcl-2单克隆抗体(1∶50)，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗 3×5 min，用PBS代替一抗作阴性对照)；滴加生物素标记的山羊抗兔工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min；DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木精复染，梯度脱水，透明中性树胶封固。阳性判断：Bax、Bcl-2阳性为胞质及胞膜内侧出现黄至棕黄色颗粒，每只大鼠取4张切片染色，每张切片随机取5个高倍镜视野(×400)，计数每个高倍镜视野内的阳性细胞数和细胞总数，求其平均值。
主要观察指标：各组子宫组织丙二醛浓度、超氧化物歧化酶活性，Bax、Bcl-2蛋白的表达。
统计学分析：采用SPSS 16.0软件进行数据分析，各组数据均服从正态分布，计量资料以x±s表示，组间数据差异的比较采用完全随机设计的单因素方差分析及LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

子宫缺血再灌注损伤是临床妇产科手术中及手术后无法回避的问题，也是造成子宫缺血坏死创口愈合不良造成子宫切除亦或影响生育功能的原因之一。
缺血再灌注损伤发生的最基本机制是氧自由基的大量产生和细胞内钙超载以及随之而来的微血管功能障碍^[5]。超氧化物歧化酶存在于细胞中，对机体的氧化与抗氧化平衡、保护细胞免受损伤起着至关重要的作用，超氧化物歧化酶活性的高低直接反映了机体清除自由基的能力。丙二醛是脂质过氧化反应的代谢产物，因其能与膜磷脂-蛋白质分子等形成共轭交联和聚合结构，使膜的基本特性改变，蛋白质活性丧失，进而致细胞死亡测定丙二醛浓度可以反映机体内脂质过氧化的程度^[6-7]，间接反映组织中氧自由基的含量及机体细胞受氧自由基攻击而损伤的程度。本次实验中模型组超氧化物歧化酶活性明显降低而丙二醛浓度明显增高，说明子宫缺血在损伤对子宫组织细胞代谢功能有直接影响。
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，它是细胞受其内在基因调控，以凋亡小体形成为特点，与细胞凋亡有关的基因中bcl-2基因是最先发现的抑制细胞凋亡的长寿基因，表达产物Bcl-2蛋白是一种跨膜蛋白，在抗凋亡中发挥重要作用，可阻断因氧自由基、辐射、缺血缺氧、抗肿瘤药物等刺激引起的细胞凋亡^[8]。缺血、再灌注损伤过程中细胞凋亡的发生受到细胞内凋亡调节蛋白的调控，这些凋亡调节蛋白分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两大类，细胞凋亡的发生是这两类相互拮抗的蛋白之间平衡丧失的结果。研究表明，Bax、Bcl-2蛋白水平高低与凋亡调控直接相关：Bax蛋白水平增高，促进细胞凋亡；Bcl-2蛋白水平增高，抑制细胞凋亡。因而有人提出细胞在受凋亡刺激后的生存能力由Bcl-2与Bax的比率决定，Bcl-2蛋白表达水平较高时，比率上调，可形成Bcl-2/Bax的异二聚体，细胞凋亡受到抑制；Bax表达水平较高时，比率下调，可形成Bax/Bcl-2二聚体，导致细胞凋亡。实验中模型组与假手术组Bcl-2表达水平下降Bax表达水平明增高。说明子宫缺血损伤的机制与细胞凋亡密切相关。
丹参酮是中药丹参根的超临界(二氧化碳)提取物，或者是醚、醇等有机溶剂的提取物，其中含有多种成分，临床观察和动物实验都证明它具有广泛而复杂的药理作用^[8-28]，除具有免疫调节、抗肿瘤[^29]、抗感染等外，近年来研究还发现其通过改善缺血再灌注损伤起到修复损伤细胞的作用^[30-36]。实验采用丹参酮中具有较高活性物质丹参酮ⅡA作用于子宫缺血在灌注损伤模型，并研究其抗损伤的作用。实验中丹参酮ⅡA干预后超氧化物歧化酶活性增强，丙二醛浓度降低，这说明丹参酮ⅡA可能通过增强清除受黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶系统产生的氧自由基，减少脂质过氧化反应代谢产物，达到抑制子宫缺血再灌注损伤的作用。实验中发现参酮ⅡA作用于子宫缺血在灌注损伤模型后其Bcl-2表达增高，Bax表达降低，更进一步说明丹参酮ⅡA对子宫缺血在灌注损伤通过抑制细胞凋亡蛋白发挥修复和保护最用。本次实验中缺血模型建立1，3 h缺血时间而且随着组织再灌注损伤时间的延长，Bcl-2、Bax表达无明显差异，但不能说明长时间无变化，故丹参酮ⅡA干预保护作用的有效时限需进一步研究。
综上所述，通过实验借助已建立的成功的大鼠缺血再灌注模型，证实在酮ⅡA大鼠子宫缺血再灌注损伤中的保护作用，为探讨中药抗子宫缺血再灌注损伤，改善生殖功能，提供客观的理论依据。

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