制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A*0206基因慢病毒载体构建及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.24.009

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (24): 3813-3817.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.24.009

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制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A*0206基因慢病毒载体构建及鉴定

张修彦，詹纯列，张晓玉

广州军区广州总医院动物实验中心，广东省广州市 510010

出版日期:2015-06-11 发布日期:2015-06-11
通讯作者: 詹纯列，主任医师，广州军区广州总医院动物实验中心，广东省广州市 510010
作者简介:张修彦，女，1986年生，河南省新乡市人，汉族，2010年华南理工大学毕业，硕士，主管技师，主要从事转基因实验动物模型制作工作。
基金资助:
广东省科学技术厅科技基础条件建设项目(2011B060300020)

Establishing transgene mouse models: construction and identification of human leucocyte antigen-A*0206 gene lentiviral vector

Zhang Xiu-yan, Zhan Chun-lie, Zhang Xiao-yu

Animal Experiment Center, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China

Online:2015-06-11 Published:2015-06-11
Contact: Zhan Chun-lie, Chief physician, Animal Experiment Center, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China
About author:Zhang Xiu-yan, Master, Technician-in-charge, Animal Experiment Center, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, Guangdong Province, China
Supported by:
grants from the National Science and Technology Infrastructure Program of the Ministry of Science and Technology of Guangdong Province, No. 2011B060300020

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明人白细胞抗原-A*0206亚型与鼻咽癌的发生正相关，但目前还没有相应的转基因动物模型，以用于从整体水平评价HLA-A*0206与鼻咽癌的关系及进一步研究免疫和基因疗法。
目的：构建pLVX-CMV-人白细胞抗原-A*0206-HA-mCMV-ZsGreen载体，并进行病毒包装，以用于HLA-A*0206转基因小鼠制作。
方法：合成HLA-A*0206序列，利用聚合酶链式反应在5’端引入Eco RⅠ酶切位点，在3’端引入Bam HⅠ酶切位点和流感病毒血凝素标签，Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切目的片段及pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen质粒，连接酶切产物，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞，双酶切及测序鉴定阳性重组质粒，阳性重组质粒与四质粒包装系统共转染表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系293T细胞，产生含目的基因的慢病毒。
结果与结论：凝胶电泳及测序证实人白细胞抗原A*0206基因成功导入pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen骨架质粒，转染293T细胞48 h后的转染率为92%。荧光法测定病毒滴度，获得病毒滴度约为5×108。结果证实，实验成功构建了含巨细胞病毒启动子、HLA-A*0206、流感病毒血凝素标签以及ZsGreen报告基因的慢病毒。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 鼻咽癌, 转基因小鼠, 慢病毒, 人白细胞抗原, 绿色荧光蛋白, 四质粒包装系统, 流感病毒血凝素, 巨细胞病毒启动子, 质粒

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that human leukocyte antigen (HLA)-A*0206 subtype is related to the abscess of nasopharyngeal carcinoma, but there is no corresponding transgenic animal models that could used to judge the relationship between HLA-A*0206 and nasopharyngeal carcinoma on the overall level and further research of immunotherapy and gene therapy.
OBJECTIVE: To construct lentiviral vectors carrying pLVX-CMV-HLA-A*0206-HA-mCMV-ZsGreen and establish HLA-A*0206 transgenic mice.
METHODS: The HLA-A*0206 sequence was synthesized. EcoRI recognition site was introduced in the 5’ end by polymerase chain reaction, and influenza virus hemagglutinin labels and BamHI recognition site were introduced in the 3’ end. Eco RI and Bam HI double enzyme digestion target fragments and the pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen plasmids were connected to the digested productions and transfected JM109 competent cells. The positive clones were selected and identified by double enzyme digestion and sequencing. The positive plasmid and packaging plasmids were transfected into 293T cells, which were human renal epithelial cell line that can express SV40 large T antigen. The lentivirus containing target sequence was produced.
RESULTS AND CONCLUSION: Gel electrophoresis and sequencing results showed that, HLA-A*0206 was successfully inserted into pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen frame plasmids. Transfection efficiency was 92% after 48 hours of transfecting 293T cells. The viral suspension titer was 5 × 108 measured by fluorescence method. Experimental findings indicate that, the lentivirus containing cytomegalovirus promoter, HLA-A*0206, influenza virus hemagglutinin label and Zsgreen report gene was successfully constructed.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lentivirus, Nasopharyngeal Carcinoma, Transgenic Mice, Green Fluorescent Proteins

中图分类号:

R318

张修彦，詹纯列，张晓玉. 制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A*0206基因慢病毒载体构建及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(24): 3813-3817.

Zhang Xiu-yan, Zhan Chun-lie, Zhang Xiao-yu. Establishing transgene mouse models: construction and identification of human leucocyte antigen-A*0206 gene lentiviral vector[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(24): 3813-3817.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] Chang ET, Adami HO. The enigmatic epidemiology of nasopharyngeal carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006;15(10):1765-1777.

[2] Jia WH, Huang QH, Liao J, et al. Trends in incidence and mortality of nasopharyngeal carcinoma over a 20-25 year period (1978/2002) in sihui and Cangwu counties in southern China. BMC Cancer. 2006;6:178.

[3] Lin C, Meng X, Hazawa M, et al. The genomic landscape of nasopharyngeal carcinoma. Nat Genet. 2014;46(8):866-871.

[4] Guo X, Winkler CA, Li J, et al. Evaluation and integration of genetic signature for prediction risk of nasopharyngeal carcinoma in Southern China. Biomed Res Int. 2014. doi:10.1155/2014/434072.

[5] Chien YC, Chen JY, Liu MY, et al. Serologic markers of Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma in Taiwanese men. New Engl J Med. 2001;345(26):1877-1882.

[6] Zhang YX, Kang SY, Chen G, et al. ABO blood group, Epstein-Barr virus infection and prognosis of patients with non-metastatic nasopharyngeal carcinoma. Asian Pac J cancer Prev. 2014;15(17):7459-7465.

[7] Hutajulu SH, Kurnianda J, Tan IB, et al. Therapeutic implications of Epstein-Barr virus infection for the treatment of nasopharyngeal carcinoma. Ther Clin Risk Manag. 2014;10: 721-736.

[8] Xie SH, Yu IT, Tse LA, et al. Domestic incense burning and nasopharyngeal carcinoma: a case-control study in Hong Kong Chinese. Environ MoI Mutagen. 2014. doi:10.1002/em.21894.

[9] Simons MJ, Day NE, Wee GB, et al. Nasopharyngeal carcinoma V: immol/Lunogenetic studies of Southeast Asian ethnic groups with high and low risk for the tumor. Cancer Res. 1974;34(5):1192-1195.

[10] Tang M, Zeng Y, Poisson A, et al. Haplotype-dependent HLA susceptibility to nasopharyngeal carcinoma in a Southern Chinese population. Genes Immol. 2010;11(4):334-342.

[11] 蓝轲,乔贵林,沈新民,等.鼻咽癌来源LMP1转基因小鼠的制备[J].动物医学进展,2002,23(1):69-71.

[12] 肖志强,姚开泰.携带EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因小鼠的制备[J].生物化学与生物物理进展,1995,22(2):149-153.

[13] 何迎春,田道法,卢芳国,等.人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立[J].第四军医大学学报,2006,27(1):6-9.

[14] Sakuma T, Barry MA, Ikeda Y. Lentiviral vectors:basic to translational. Biochem J. 2012;443(3):603-618.

[15] Coghill AE, Hildesheim A. Epstein-Barr Virus Antibodies and the risk of associated malignancies: review of the literature. Am J Epidemiol. 2014;180(7):687-695.

[16] Chin YM, Mushiroda T, Takahashi A, et al. HLA-A SNPs and amino acid variants are associated with nasopharyngeal carcinoma in Malaysian Chinese. Int J Cancer. 2015;136(3): 678-687.

[17] Goldsmith DB, West TM, Morton R. HLA associations with nasopharygeal carcinoma in Southern Chinese: a meta-analysis. Clin Otolaryngol Allied Sci. 2002;27(1):61-67.

[18] Demayo JL, Wang J, Liang D, et al. Genetically engineered mice by pronuclear DNA microinjection. Curr Protoc Mouse Biol. 2012;2:245-262.

[19] Liao X, Cui H, Wang F. Establishment of a transgenic mouse model of corneal dystrophy overexpressing human BIGH3. Int J Mol Med. 2013;32(5):1110-1114.

[20] Meng Q, Xiao Z, Yuan H, et al. Transgenic mice with overexpression of mutated human optineurin (E50K) in the retina. MoI Biol Rep. 2012;39(2):1119-1124.

[21] Chandrashekran A, Sarkar R, Thrasher A, et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB J. 2014;28(2):569-576.

[22] Moreira PN, Montoliu L. Intracytoplasmic sperm injection (IC SI)-mediated transgenesis in mice. Methods MoI Biol. 2014; 1194:141-156.

[23] García-Vázquez FA, Ruiz S, Matás C, et al. Production of transgenic piglets using IC SI-sperm-mediated gene transfer in combination with recombinase RecA Reproduction. 2010; 140(2):259-272.

[24] Nickerson HD, Colledge WH. A LacZ-based transgenic mouse for detection of somatic gene repair events in vivo. Gene Ther. 2004;11(17):1351-1357.

[25] Delzor A, Escartin C, Déglon N. Lentiviral vectors: a powerful tool to target astrocytes in vivo. Curr Drug Targets. 2013; 14(11):1336-1346.

[26] Monzani PS, Sangalli JR, De Bem TH, et al. Breeding of transgenic cattle for human coagulation factor Ⅸ by a combination of lentiviral system and cloning. Genet MoI Res. 2013;12(3):3675-3688.

[27] Liu C, Wang L, Li W, et al. Highly efficient generation of transgenic sheep by lentivirus accompanying the alteration of methylation status. PLoS One. 2013;8(1):e54614.

[28] Baxa M, Hruska-Plochan M, Juhas S, et al. A transgenic minipig model of Huntington’s Disease. J Huntingtons Dis. 2013;2(1):47-68.

[29] Matsuzaki Y, Oue M, Hirai H. Generation of a neurodegenerative disease mouse model using lentiviral vectors carrying an enhanced synapsin 1 promoter. J Neurosci Methods. 2014;223:133-143.

[30] Tomkowiak M, Ghittoni R, Teixeira M, et al. Generation of transgenic mice expressing EGFP protein fused to NP68 MHC classⅠepitope using lentivirus vectors. Genesis. 2013;51(3):193-200.

引言

材料方法

设计：基因学实验。
时间及地点：于2013年4月在广州军区广州总医院医学实验科完成。
实验方法：

人白细胞抗原A*0206基因慢病毒载体的构建及鉴定实验相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
HLA-A0206*	Invitrogen
pLVX-CMV-mCMV-A-ZsGreen载体，JM109感受态细胞，HET高效转染试剂盒	深圳百思维生物科技有限公司
限制性内切酶Eco RⅠ，限制性内切酶 Bam HⅠ，T₄ DNA 连接酶	美国NEB公司
大型冷冻高速离心机Thermo Sorvall Evolution^TM RC，超微量高精度分光光度计Nanodrop ND-2000 Thermo落地式培养摇床Forma 481	美国Thermo公司
Bio-Rad DNA电泳系统Sub-Cell GT Cell电泳槽，Bio-Rad凝胶成像系统Gel Imager	美国Bio-Rad公司
超净工作台BCM-1600A	苏州苏净安泰公司

引物序列信息如下：

序列名称

序列信息

pLVX-HLA-A*0206-Eco RⅠ-F

5’-CCG GAA TTC GCC ACC ATG GCC GTC ATG GCG CCC CGA ACC C-3’

pLVX-HLA*0206-HA-R1

5’-AGC GTA ATC TGG AAC ATC GTA TGG GTA CAC TTT ACA AGC TGT GAG AGA CAC-3’

pLVX-HLA-HA*0206-

Bam HI-R2

5’-CGC GGA TCC TCA AGC GTA ATC TGG AAC ATC GTA T-3’

表注：曲线下划线为Eco RⅠ酶识别位点，双下划线为HA序列。单下划线为 Bam HⅠ酶识别位点。

构建pLVX-CMV-HLA-A*0206-HA-mCMV-ZsGreen载体：PCR扩增目的片段：在NCBI查找HLA-A*0206基因的CDS序列(GI:56790909)，合成HLA-A*0206基因序列，通过PCR扩增，在引物中引入Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切位点，并在序列3’端引入HA标签。利用Primer Premier 5.0设计引物序列。
首先用正向引物pLVX-HLA-A*0206-Eco RⅠ-F及反向引物pLVX-HLA-A*0206-HA-R1，引入Eco RⅠ酶切位点和HA标签，曲线下划线为Eco RⅠ酶识别位点，双下划线为HA序列，回收DNA片段后，再用正向引物pLVX-HLA-A*0206-EcoRⅠ-F及反向引物pLVX-HLA-HA*0206-Bam HⅠ-R2，引入Bam HⅠ酶切位点和终止密码子，单下划线为Bam HⅠ酶识别位点。
PCR体系如下：在0.2 mL PCR管中依次加入5×Fast pfu buffer 10 μL，dNTP M x(2.5 mmol/L)4 μL，正向引物 (10 μmol/L)2 μL，反向引物(10 μmol/L)2 μL，Fast pfu polymerase 1 μL，模板DNA(100 mg/L)1 μL，灭菌ddH2O，补足反映体系至50 μL，混匀。95 ℃预变性3 min，然后 95 ℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。琼脂糖凝胶回收目的条带(1 125 bp)。
Eco RⅠ+Bam HⅠ双酶切载体质粒pLVX-CMV- mCMV-ZsGreen及目的基因：酶切反应在37 ℃水浴反应 2 h，酶切体系如下：质粒pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen (图1) 1 μg，10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，Eco RⅠ 1 μL，Bam HⅠ 1 μL，灭菌ddH2O补足反映体系至20 μL。分别回收质粒pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen酶切大片段和目的基因酶切产物。
连接质粒及目的基因：连接反应在22 ℃反应2 h，连接反应体系如下：目的基因 6 μL，pLVX-CMV-mCMV- ZsGreen 2 μL，10×DNA Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL。
连接产物转化：取10 μL上述连接产物与100 μL JM109感受态细胞混匀后冰浴30 min，42 ℃热激45 s，立即置冰上放置2 min，加入预热至室温的400 μL LB培养基，37 ℃恒温摇床培养1 h，4 000 r/min离心1 min，弃去400 μL培养上清，剩余100 μL用移液器混匀后均匀涂布于含质量浓度100 mg/L Ampicillin抗性的LB平板上，37 ℃恒温培养箱倒置培养过夜。
挑选阳性克隆：挑取单菌落接种于含5 mL，质量浓度100 mg/L Ampicillin抗性的LB培养液中，250 r/min，37 ℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，经质粒Eco RⅠ+Bam HⅠ双酶切鉴定，阳性克隆可切出1 125 bp的条带。鉴定正确的重组克隆进行测序验证。测序引物为：CMV-F(5’-CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-3’)。挑选鉴定正确的重组质粒进行病毒包装。
pLVX-CMV-HLA-A*0206-HA-mCMV-ZsGreen慢病毒包装：用体积分数0.25%胰蛋白酶消化293T细胞，每10 cm细胞培养皿中接种(6-8)×10⁶个细胞，16-24 h后，待细胞密度生长到80%-90%时用于转染。pLVX-CMV-HLA- A*0206-HA-mCMV-ZsGreen 5 μg，包装质粒15 μg共转染293T细胞，培养12-16 h后弃去培养基，用10 mL新鲜的完全培养基(DMEM+10%FBS+P/S)换液，换液后48 h，收集上清液。1 000 r/min离心5 min，弃去细胞碎片，上清液用0.45 μmol/L PVDF滤器过滤收集病毒原液。4 ℃，50 000×g高速离心2 h，小心弃去上清，晾干，重悬于1 mL DMEM培养液中，分装后-80 ℃保存备用。分别于转染后换液前，转染后48 h观察细胞及绿色荧光表达情况。在高倍显微镜下计数表达ZsGreen蛋白的细胞数，计数5次，取平均值计算质粒转染效率。
慢病毒滴度测定：3×104/孔接种HEK293细胞到48孔板中。用含8 g/L polybrene的完全培养基(DMEM+体积分数10%胎牛血清+青链霉素)10倍梯度稀释病毒，稀释105。各吸取10 μL病毒稀释液到对应的48孔板中，37 ℃，体积分数5% CO2培养过夜，16-24 h后用新鲜的完全培养基换液。再培养48 h后，用荧光显微镜计数荧光细胞数量，一般情况下，在最高稀释梯度10 m的孔数出现N (N < 10个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10 m TU/μL，即病毒滴度为N×10 m+3 TU/mL，若N >10，则需要继续稀释。
主要观察指标：双酶切鉴定阳性克隆结果。

讨论

有研究表明HLA-A*0206亚型与鼻咽癌高发病率正相关。影响鼻咽癌发病率的因素包括遗传因素^[3-4]、EB病毒感染^[5-7]、环境因素^[8]。EB病毒是一种疱疹病毒，90%以上成人感染EB病毒，它与多种癌症相关，包括鼻咽癌，胃癌，伯基特淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤等^[15]。EB病毒感染具有普遍性，但是只有小部分个体有肿瘤易感性，这是因为遗传因素和环境因素也影响鼻咽癌易感性。Chin等^[16]挑选了马来西亚184例鼻咽癌患者和236例健康个体进行常染色体多态性分析，发现HLA-A与鼻咽癌的易感性有很强的关系。Goldsmith等^[17]通过meta分析认为HLA-A2(P=1.57×10^-5)、HLA-B14(1.13×10^-3)、HLA-B46(6.38×10^-5)与鼻咽癌呈正相关。Tang等^[10]发现HLA-A*0206亚型与鼻咽癌呈高发病率有关。HLA-A* 0206亚型是东南亚人群特有的亚型，这很可能与鼻咽癌在东南亚高发病率相关。HLA-A*0206有可能是中国华南地区鼻咽癌发病率高的原因之一。目前，只有关于LMP1的转基因鼻咽癌小鼠模型^[11-13]，尚未有与鼻咽癌遗传相关基因的转基因动物模型。因此，若能建立一个表达HLA-A*0206的转基因动物，可为研究HLA-A*0206与鼻咽癌关系及为下一步研究免疫和基因疗法治疗鼻咽癌提供重要的转基因动物模型。
慢病毒载体导入外源基因的效率更高。转基因小鼠基因导入的方法主要有：原核显微注射法^[18-20]、慢病毒载体法^[21]、精子载体法^[22-23]、干细胞转移法等^[24]。原核显微注射法是目前最经典最成熟的方法，但是需要昂贵的仪器设备和熟练的操作技术，且效率比较低。比较而言，慢病毒载体法只需将病毒液注入受精卵的卵周隙，而不用注入核内，对细胞膜和核膜均无损伤，胚胎存活率高，转基因效率远远高于显微注射法^[25]，转基因大动物较多使用慢病毒载体法。例如，Monzani等^[26]通过慢病毒系统生产了能够表达人凝血因子Ⅸ的转基因牛。Liu等^[27]通过慢病毒系统制备了增强型绿色荧光蛋白转基因羊模型。Baxa等^[28]利用慢病毒系统构建了亨廷顿疾病小型猪模型。由于慢病毒载体的高效性以及易操作性，其同样适用于转基因小动物制作^[29-30]。
实验在HLA-A*0206基因的3’端引入HA标签，有利于下一步对转基因小鼠进行Western bolt验证。将HLA-A*0206-HA插入pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen骨架质粒，转基因阳性鼠可在整体成像仪下发出绿色荧光，方便进行转基因阳性鼠的鉴定。成功构建了pLVX-CMV-HLA- A*0206-HA-mCMV-ZsGreen重组质粒与四质粒包装系统一起共转染293T细胞，获得慢病毒。与三质粒包装系统相比，四质粒系统通过3个方面增加了安全性。一是将rev基因单独放在一个质粒上，rev编码的蛋白可调节编码病毒基本结构的gag，pol，env的表达水平；二是删除了U3区3’长末端重复序列，使载体失去增强子和启动子序列；三是删除了tat基因，tat基因编码的蛋白可调节RNA的转录。通过荧光法测得慢病毒滴度为5×10⁸，可用于成功制备HLA-A*0206转基因小鼠。

制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A*0206基因慢病毒载体构建及鉴定

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[5]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[6]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[7]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[8]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[9]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[10]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[11]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[12]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[13]	陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.
[14]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[15]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.

引物序列信息如下：
序列名称	序列信息
pLVX-HLA-A0206-Eco* RⅠ-F	5’-CCG GAA TTC GCC ACC ATG GCC GTC ATG GCG CCC CGA ACC C-3’
pLVX-HLA0206*-HA-R1	5’-AGC GTA ATC TGG AAC ATC GTA TGG GTA CAC TTT ACA AGC TGT GAG AGA CAC-3’
pLVX-HLA-HA0206- Bam* HI-R2	5’-CGC GGA TCC TCA AGC GTA ATC TGG AAC ATC GTA T-3’
表注：曲线下划线为Eco RⅠ酶识别位点，双下划线为HA序列。单下划线为 Bam HⅠ酶识别位点。