H2O2诱导骨骼肌卫星细胞凋亡及法舒地尔的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨骼肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间具有增殖分化潜能的肌源性干细胞，研究表明骨骼肌卫星细胞的有效性及安全性，但是移植后的干细胞成活率极低，极大的限制了骨骼肌卫星细胞的应用。
目的：观察过氧化氢(H₂O₂)对大鼠骨骼肌卫星细胞凋亡的影响以及法舒地尔的保护作用。
方法：取体外培养的骨骼肌卫星细胞，随机分为正常对照组，H₂O₂组，H₂O₂⁺法舒地尔组(法舒地尔组)，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，ELISA法检测白细胞介素4、肿瘤坏死因子a的浓度，Western blot检测Bax蛋白的表达。
结果与结论：同H₂O₂组相比，法舒地尔组凋亡发生率明显下降(P < 0.05)，Bax蛋白水平表达明显降低(P < 0.05)，白细胞介素4、肿瘤坏死因子a的分泌显著减少(P < 0.05)。结果提示，法舒地尔抑制Rho激酶信号途径发挥抗凋亡保护作用，其机制可能与减少Bax蛋白的表达有关。

关键词: 组织构建, 组织工程, 过氧化氢, 骨骼肌卫星细胞, 凋亡, 法舒地尔

Abstract:

BACKGROUND: Skeletal muscle satellite cells are muscle-derived stem cells with proliferation and differentiation potential distributing between the muscle cell membrane and the base film. Studies have shown that skeletal muscle satellite cells are of efficacy and safety, but the survival rate of the transplanted stem cells is very low, which greatly limits the application of skeletal muscle satellite cells.
OBJECTIVE: To observe the effects of Fasudil on apoptosis of skeletal muscle satellite cells induced by H₂O₂.
METHODS: Skeletal muscle satellite cells cultured in vitro were randomly divided into three groups including H₂O₂group, H2O2+Fasudil group (Fasudil group) and control group. Apoptosis rates were observed by flow cytometry. The concentrations of interleukin-4 and tumor necrosis factor-a in each group were detected by ELISA. Western blot was employed to measure the protein level of Bax in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the H₂O₂ group, a significant decrease was found in the apoptosis rate of cells, protein level of Bax, and concentrations of interleukin-4 and tumor necrosis factor-a in the Fasudil group (all P < 0.05). These findings indicate that Fasudil can play anti-apoptosis protection by inhibiting Rho-kinase signaling pathway, which may be related to the reduced expression of Bax.

Key words: Hydrogen Peroxide, Satellite Cells, Skeletal Muscle, Apoptosis

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

数据表明国内每年有200多万新发心肌梗死患者，且每年以10.4%的速度递增，成为严重危害人类健康的难治性疾病之一。虽然经皮腔内冠脉成形及支架置入(PCI术)、冠脉搭桥、药物治疗以及器械治疗等治疗手段广泛应用于临床取得了较好效果，但仍有很多患者出现心力衰竭，其5年生存率与恶性肿瘤相似，这与上述治疗方法无法逆转坏死的心肌，对终末期心力衰竭的疗效差有关。因此解决心肌梗死后心肌组织损伤的修复和功能重建是心血管研究领域的关键科学问题^[1]。
干细胞是一类具有活跃的增殖能力及多向分化潜能的细胞，能替代、修复或改善受损的心肌组织的生物学功能，成为心肌梗死治疗的一个新的里程碑，显示出了良好的应用前景^[2-6]。骨骼肌卫星细胞和骨髓间充质细胞是最早应用于临床两类干细胞，两者在心肌梗死后心肌修复领域取得了令人振奋的成果。
骨骼肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间具有增殖分化潜能的肌源性干细胞。骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖和分化能力，并且取材方便，免疫原性低和耐缺血缺氧能力强^[7]，是对心肌梗死后心肌进行细胞移植治疗和基因治疗的理想靶细胞。国内外的多个心脏中心将骨骼肌卫星细胞用于临床，能改善患者心功能，取得了较好的临床效果^[8-11]。多个临床研究均表明了骨骼肌卫星细胞的有效性及安全性，但是移植后的干细胞成活率极低^[12-14]，这样极大的限制了骨骼肌卫星细胞的应用。因此，如何提高移植细胞的成活率是目前急需解决的主要问题。
Rho激酶信号转导通路是机体组织中普遍存在的一条信号通路，它参与许多细胞功能的调节，特别是参与血管痉挛、动脉硬化、缺血再灌注损伤等病理生理过程[15-19]。Rho激酶直接参与高血压、冠心病、心力衰竭、肺动脉高压等多种心血管疾病的病理生理过程，各种心血管疾病的发生发展关系密切，近年来已经成为心血管病及脑血管病治疗的新靶点^[19]。法舒地尔是目前在临床上应用的惟一的Rho激酶抑制剂，它通过与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点，竞争性拮抗作用阻断了Rho激酶的活性，从而发挥扩张血管、抑制炎细胞的迁徙、减轻炎症反应的药理作用。法舒地尔最初用于治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛，近年来，随着对其药理作用的研究不断深入，其临床作用扩展到心血管领域，对许多心血管疾病都有很好的治疗效果^[20]。
已有研究表明，法舒地尔对急性心肌梗死、心力衰竭、病毒性心肌炎、肺动脉高压等有较好的作用，能缩小心肌梗死面积，抑制心肌细胞的凋亡，对抗心肌缺血，减轻心肌缺血再灌注损伤等^[21-24]。法舒地尔已应用于临床多年，其安全性及有效性有保证。如果能在体外研究证明法舒地尔对提高移植的干细胞的存活率，并联合体内作用，将是骨骼肌卫星细胞移植的一大突破。本研究采用H₂O₂模拟心肌梗死后细胞移植的缺血缺氧的环境，观察法舒地尔对骨骼肌卫星细胞在缺氧条件下的保护作用及可能机制，为进一步探讨法舒地尔对骨骼肌卫星细胞的保护作用提供实验依据。

材料方法

设计：随机对照观察细胞学实验。
时间及地点：实验于2013年5月至2015年1月在深圳市人民医院中心实验室地点完成。
材料：
实验动物：1-3日龄SD大鼠乳鼠，雌雄不拘，体质量15-20 g，SPF级别，许可证号SYXK(粤)2010-0068。购于广东省医学实验动物中心。

法舒地尔对H₂O₂诱导大鼠骨骼肌卫星细胞凋亡的影响实验所用试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
法舒地尔(Fasudil)	天津红日药业股份有限公司
体积分数30%H₂O₂	广州化学试剂厂
percoll工作液、DIOC6	SIGMA公司
α-sarcometric actine(骨骼肌横纹肌肌动蛋白)单克隆抗体、Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒	博士德公司
流式细胞仪	Beckman Coulter公司
酶标仪	BIO-RAD公司

实验方法：
细胞的原代取材培养：取1-3日龄的SD大鼠乳鼠(雌雄不拘)，在无菌条件下分离四肢肌组织，剪碎成1 mm×1 mm× 1 mm大小，加入0.2%胶原酶Ⅰ消化60 min。弃上清，再加入0.25%胰蛋白酶消化30 min。将所得的细胞悬液 1 500 r/min 离心5 min，弃去上清，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞悬液依次经100目和200目滤网过滤。得的细胞滤液接种于塑料培养瓶中，37 ℃、体积分数5%CO₂无菌细胞培养箱中，静置培养2 h。取15 mL无菌离心管，从下至上分别轻轻铺制60%percoll工作液2 mL，20%percoll工作液6 mL，最上层加入经初次纯化得到的含未贴壁细胞的培养基2 mL，4 000 r/min离心5 min。无菌吸管轻轻吸取60%和20%percoll工作液交界面的乳白色混浊带约1 mL，移至另一无菌离心管，用无血清的培养基1 000 r/min离心清洗2次，每次5 min，弃去上清，体积分数10%FBS的DMEM培养基重悬，接种于培养瓶中3 d后首次换液，以后每2 d换液1次。
免疫细胞化学鉴定骨骼肌卫星细胞：收获培养至第3代的卫星细胞，消化后以1.0×105个细胞/孔接种入预铺制了盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基培养，常规处理后进行α-sarcometric actine免疫组织化学染色，以成纤维细胞为阴性对照。
分组处理：取第3代的对数生长期的细胞，待80%融合时，根据细胞是否接受H₂O₂损伤和法舒地尔干预，将培养的细胞随机分为3组。对照组：不加H₂O₂处理，不加法舒地尔；H₂O₂组：加H₂O₂处理，不加法舒地尔；法舒地尔+H₂O₂组：加入100 mmol/L的法舒地尔作用48 h，再加入终浓度为100 μmol/L的H₂O₂作用，检测凋亡时作用24 h。
细胞凋亡率检测：分别用0.25%胰蛋白酶消化收集各组细胞，PBS洗涤3次，体积分数70%乙醇4 ℃固定24 h，离心除去乙醇，加PBS洗涤1次，调整细胞密度为2×10⁶，采用Annexin V-PE/7-AAD双染法测定各组凋亡情况。
白细胞介素4、肿瘤坏死因子α质量浓度的检测：取各组细胞上清液，采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒说明书操作于酶联仪450 nm波长处读取吸光度值，用标准曲线法求得各标本质量浓度。
Western Bloting检测Bax的表达：收集上述3组细胞，提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量。取70 μg样品，加入蛋白体积1/4的loading buffer混匀，在100 ℃沸水中煮 10 min，以12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白用半干电转移法转移到PVDF膜上，0.5%奶粉封闭过夜后加入用封闭液稀释的小鼠抗Bax单克隆抗体(1∶300 稀释)，4 ℃过夜。用生物素标记的Ⅱ抗(1∶5 000稀释)孵育1 h，洗膜液洗后用化学发光法显色，X射线底片曝光。以GAPDH为内参照，实验重复5次。用Quantity One软件对各时点蛋白条带平均吸光度值进行分析。
主要观察指标：①免疫细胞化学鉴定骨骼肌卫星细胞。②H2O2诱导凋亡的结果。③Western Bloting检测Bax的表达。④白细胞介素4、肿瘤坏死因子α质量浓度的检测结果。
统计学分析：所有数据以x±s表示，使用SPSS 16.0统计学软件，采用单因素方差分析，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

3.1 本研究设计背景近年来，国内外研究者对骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死进行了大量基础实验和临床研究，包括移植途径(静脉途径、动脉途径、经导管、细针穿刺注射等)、移植细胞数量、移植时机(心梗后1周、心梗后1个月等)、移植后干细胞的追踪、移植细胞与宿主细胞的融合等，但移植后干细胞大量死亡从而导致移植成功率低是目前困扰研究者的主要问题。有研究表明，在干细胞移植后的早期(2 h)即有大量移植细胞死亡，4 d后检测的存活率不到1%^[25]。国外学者Hale研究发现用骨骼肌卫星细胞移植治疗大鼠心肌梗死约90%以上在24 h内发生凋亡或坏死^[26]。
造成移植后干细胞存活率低的主要原因有：①心肌梗死后细胞赖以生存的微环境改变，中性粒细胞、单核巨噬细胞、肿瘤坏死因子a、白细胞介素4、白细胞介素6等促炎因子释放，造成早期梗死区炎症反应剧烈，从而导致了移植细胞的死亡。②缺血-再灌注损伤，活性氧生成增加导致移植细胞的死亡。③梗死区血供匮乏。④移植过程中的机械损伤。⑤细胞体外培养使活力下降，对免疫排斥反应耐受力差。⑥移植区域内产生肿瘤坏死因子α有促凋亡作用，从而导致移植细胞凋亡。因此提高移植细胞的抗缺血、抗缺氧、抗凋亡能力能提高移植的存活率^[27-28]。常用的提高移植细胞存活率的方法包括缺氧预处理、外源基因修饰、热休克处理、使用药物预处理等。
本研究组在数年前即开展骨骼肌卫星细胞心肌移植的基础研究，先后与酸性成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素等药物共移植^[29]，取得了一定的成果。但促红细胞生成素可起血压升高、血栓形成的风险限制了进一步的应用。Rho激酶抑制剂法舒地尔在临床已应用多年，其安全性和效果有保证，本研究尝试使用Rho激酶抑制剂法舒地尔预处理骨骼肌卫星细胞，观察骨骼肌卫星细胞的在缺氧条件下的抗凋亡、抗炎症反应的能力。
3.2 法舒地尔抗炎症、抗凋亡作用的检测国外学者Saraste等^[30]发现凋亡是是心肌梗死急性期细胞死亡的主要形式之一。急性心肌梗死发生后，心肌中Rho激酶蛋白表达上调并活化，参与调控炎症反应、氧化应激、自由基损伤、内皮功能障碍和细胞凋亡等多种病理生理途径^[31]。心肌细胞凋亡是Rho激酶、Bax蛋白等多种细胞因子共同作用结果。Rho激酶具有介导黏着斑、整合素活性，并参与细胞生存的功能，抑制Rho激酶可损伤细胞骨架内的肌动蛋白丝的完整性进而诱发细胞凋亡。Rho激酶还可抑制Bcl-2活性，降低炎症反应，进而降低细胞凋亡率，这表明Rho激酶可通过降低Bcl-2活性来参与细胞凋亡过程。
国内外已有大量研究证明Rho激酶抑制剂法舒地尔有抗心肌细胞的凋亡的作用，且能减轻心肌缺血再灌注损伤，明显减少心肌细胞凋亡、缩小心肌梗死范围，改善心肌梗死所致血流动力学障碍，为防治缺血再灌注损伤提供新靶点之一^[32]。在细胞凋亡的机制研究中，线粒体凋亡通路是凋亡主要的凋亡途径。
炎症反应贯穿于心肌缺血的全过程，炎症反应产生大量炎性细胞因子，在心肌细胞凋亡中发挥重要作用。肿瘤坏死因子α是炎症反应中的关键递质，可以触发其他炎性细胞因子的产生，如白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素8等；同时对心肌有负性肌力作用，表现为抑制心肌收缩力，减少射血分数，降低血压；肿瘤坏死因子α诱导心肌细胞凋亡、坏死，增加心肌梗死面积，参与心肌的损伤及重构。因此抑制炎症反应和抗凋亡是法舒地尔保护缺血再灌注心肌损伤的重要机制。
本研究首先用过氧化氢模拟心肌梗死后缺血、缺氧的环境，观察骨骼肌卫星细胞的凋亡情况，并和使用法舒地尔与处理后的细胞进行对比。本研究观察在缺血缺氧环境下H₂O₂组细胞凋亡发生率最高，经法舒地尔预处理后骨骼肌卫星细胞凋亡率明显下降。本研究还发现H₂O₂损伤组肿瘤坏死因子a和白细胞介素4较正常对照组显著性升高，表明H₂O₂所致的缺氧环境下炎症反应强烈，而经法舒地尔预处理的实验组肿瘤坏死因子a和白细胞介素4的浓度较低，同H₂O₂损伤组比较有显著性统计学意义，说明法舒地尔能有效抑制氧化损伤导致炎症反应，能改善缺氧条件下的骨骼肌卫星细胞的微环境。同时，本实验的细胞凋亡结果显示，经法舒地尔预处理的各组的细胞凋亡蛋白Bax同H₂O₂损伤组比较均显著性降低，表明法舒地尔有良好的抗氧化作用，能有效抑制氧化损伤导致的骨骼肌卫星细胞的凋亡。
3.3 不足之处当然本研究仍有较多不足之处，如法舒地尔的作用时间、剂量、具体机制仍待进一步研究，如过氧化氢能否完全模拟乃至替代心肌梗死后的缺血、缺氧微环境，体外和体内环境改变法舒地尔对骨骼肌卫星细胞有无作用，法舒地尔对骨骼肌卫星细胞的生物学特性有无影响等。这些都是本研究下一步需要深入研究的地方。
综上所述，从本研究可以认为法舒地尔能有效抑制H₂O₂诱导的细胞凋亡，即通过模拟体外心肌梗死后缺血缺氧的环境，经法舒地尔预处理后骨骼肌卫星细胞凋亡率较对照组明显减少，其机制可能与抑制凋亡蛋白、抑制炎症反应有关。