人胎盘间充质干细胞的超微结构及其吞噬功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：胎盘间充质干细胞组织来源丰富，与骨髓间充质干细胞有着类似的形态、表面标记物、潜在分化能力，是人体理想的间充质干细胞来源之一。目前对胎盘间充质干细胞超微结构和吞噬功能的研究较少，对其在胎盘组织中的生理功能也鲜有探讨。

目的：了解胎盘间充质干细胞的超微结构和吞噬功能。

方法：分离培养5个正常娩出胎盘来源的胎盘间充质干细胞，经体外培养后在透射电子显微镜下观察细胞的超微结构；在培养上清中添加荧光微球，孵育3 h后用流式细胞仪检测细胞的吞噬能力。

结果与结论：胎盘间充质干细胞在透射电镜下表现为细胞核比较大，核仁明显；核膜折叠、内陷显著，常染色质多，核浆比例正常。内质网系统发达，可见大量狭小或扩张的粗面内质网。胞浆内高尔基器、溶酶体常见；细胞表面微绒毛发达，偶可见细胞间连接。5个标本的胎盘间充质干细胞中均有部分细胞能吞噬荧光微球，最多有49.6%，最少有18.4%。上述胎盘间充质干细胞的超微结构特点提示细胞功能活跃，可合成和分泌大量蛋白质，并具有吞噬功能；而吞噬实验进一步验证胎盘间充质干细胞吞噬异物的能力，提示胎盘间充质干细胞在胎盘中可能起着维持微环境稳态、清除异物的功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 人胎盘间充质干细胞, 超微结构, 吞噬功能

Abstract:

BACKGROUND: Placental mesenchymal stem cells with rich sources are similar to bone marrow mesenchymal stem cells in terms of morphology, surface markers and differentiation potential, which are one of ideal mesenchymal stem cells in human body. However, there are few studies addressing the ultrastructure and phagocytotic function of human placental mesenchymal stem cells and its physiological role in the the placenta has been little explored.

OBJECTIVE: To investigate the ultrastrcture and phagocytotic function of placental mesenchymal stem cells.

METHODS: Placental mesenchymal stem cells obtained from five placentae of normal pregnancy were cultured in vitro and observed for ultrastructure under transmission electron microscope. The fluorescent beads were added in the supernatant for 3 hours, and then the phagocytosis of placental mesenchymal stem cells was evaluated by flow cytometry.

RESULTS AND CONCLUSION: Under the transmission electron microscope, placental mesenchymal stem cells had large nuclei with prominent nucleoli. In the cytoplasm, a plenty of rough endoplasmic reticula was seen, dilated or stacked. The cytoplasm was also rich in Golgi apparatus and lysosomes. The cell surfaces were covered by microvilli. The intercellular junctions could be seen occasionally. A part of cells from these five samples could phagocytose fluorescence beads, which ranged from 49.6% to 18.4%. The ultrastructural characteristics of placental mesenchymal stem cells suggested these cells were active to synthesize and secrete proteins and had phagocytotic function, indicating placental mesenchymal stem cells may play a role in keeping the balance of micro-environments and clean the foreign substances in the placenta.

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Key words: Placenta, Mesenchymal Stem Cells, Cellular Structures, Microscopy, Electron, Transmission, Phagocytosis

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 胎盘间充质干细胞的鉴定 流式细胞仪检测结果提示：胎盘间充质干细胞表面标志物表达十分均一：强表达CD44和CD29，CD73、CD90和CD105；极少表达造血干细胞标志物CD34，CD45和CD14；强表达HLA-Ⅰ类分子(HLA-ABC)，极少表达HLA-Ⅱ分子(HLA-DR)。经诱导后，细胞能向成脂细胞和成骨细胞方向分化，结果详见课题组的前期研究报道^[16]。

2.2 胎盘间充质干细胞的超微结构特征 透射电镜下可见胎盘间充质干细胞胞核比较大，核仁明显；核膜折叠、内陷显著，常染色质多，核浆比例正常。部分细胞内可见大量狭窄短小的粗面内质网，且均匀分布于胞浆内。但也有部分细胞内质网系统发达，粗面内质网体积较大，内质网扩张，腔内可见电子致密物。偶可见游离糖原颗粒。胞浆内高尔基器常见，多分布于粗面内质网密集区和细胞核周围。胞浆内溶酶体或脂褐素样结构常见，可见少量自噬体。细胞表面被覆微绒毛，偶可见细胞间连接，呈桥粒样结构，见图2。

2.3 胎盘间充质干细胞的吞噬能力 流式细胞仪检测结果提示，5个标本的胎盘间充质干细胞均有部分细胞能吞噬荧光微球，但也有部分细胞没有吞噬。从流式峰图中可以明显的看出细胞吞噬了不同个数的微球发出相应强度的荧光(图3)。将不同吞噬峰分别标记为M1，M2，M3，M4，由CELLQuest软件计算4个区域吞噬细胞占总细胞数的比例。实验数据表明不同个体的胎盘间充质干细胞吞噬比例有较大差距，最高有49.62%的细胞吞噬了荧光微球，最低有18.4%的细胞吞噬了荧光微球，见表1。

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引言

间充质干细胞最早被描述为从骨髓中分离出的贴壁细胞、非吞噬细胞，形态与成纤维细胞相似^[1]。间充质干细胞在人体内分布广泛，在骨髓，肾、肺、肝、胎盘、脐带等组织中都可见。间充质干细胞具有多重分化潜能，可分化为骨、脂肪、软骨、肌肉甚至是内皮细胞^[2-3]，还具有免疫调控能力^[4]。随着研究的深入，人们对间充质干细胞的认识越来越多，包括其形态、分化潜能、表面标志物、免疫调节功能、组织修复能力等等^[5]。但是到目前为止，对间充质干细胞超微结构的报道还比较少见^[6]。

间充质干细胞作为在组织工程和再生医学领域最有应用前景的细胞，已经有大量的体内、体外实验研究其生物学特性和治疗疾病的可能机制^[7-10]。目前认为间充质干细胞参与组织损伤修复治疗的机制还不是十分明确，有可能是通过以下几种途径：①分泌可溶性细胞因子促进受损细胞存活和功能恢复。②间充质干细胞输入体内后归巢于受损组织、炎症组织。③低免疫原性，能够调节免疫反应，减轻炎症反应。间充质干细胞具有干细胞特性，能分泌多种细胞因子，表达趋化因子受体，细胞体可以迁徙移动^[11]，这些特点是由细胞本身结构决定的。细胞的超微结构、细胞器特点能反映细胞的生理功能和状态，因此研究间充质干细胞的超微结构有助于理解细胞的生物学特性和生理功能，对进一步探讨间充质干细胞参与组织损伤修复治疗的机制也有一定的参考价值。

胎盘是分娩后的废弃物，足月娩出胎盘组织直径18-20 cm，厚1-3 cm，质量450-650 g^[12]，组织来源十分充足，很容易获取，不易涉及社会伦理问题，取材对供者毫无损伤。胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞有相似的细胞形态、表面标记物、潜在分化能力、免疫调节能力，因此，胎盘是人体理想的间充质干细胞来源之一。本研究选取5个正常娩出胎盘，在无菌条件下进行组织消化、细胞纯化、体外培养获得胎盘来源间充质干细胞，经体外传代、鉴定后进行固定、包埋、切片、染色处理，在透射电子显微镜下观察细胞的超微结构，并进一步探讨其吞噬功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2010年1月至2014年10月在暨南大学生命技术科学院完成。

材料：5个胎盘标本由暨南大学附属第一医院提供，均为正常足月妊娠产妇(38-40周)娩出胎盘，产妇无妊娠期疾病和感染性疾病，胎儿发育正常，因产科因素和社会因素行剖宫产术。产妇及其家属对胎盘可能用于科学研究均签署知情同意书^[13]。

实验方法：

胎盘间充质干细胞的制备：实验采用胰酶+DNAse Ⅰ共同消化胎盘组织，用Percoll不连续梯度密度分离液分离不同细胞组分，保留悬浮密度为1.072-1.073 g/mL的胎盘间充质干细胞和淋巴细胞^[4]，将获得的细胞贴壁培养，去除悬浮的淋巴细胞。分离的人胎盘间充质干细胞经培养、传代至第3-5代，冻存备用。

胎盘间充质干细胞的鉴定：使用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记物，每个标本均需检测CD14，CD29，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ共10个表面标记物，每个标记物用流式细胞仪计数 10 000个细胞。将部分胎盘间充质干细胞诱导分化为成骨细胞及成脂细胞，证明其具有潜在分化能力。获得的胎盘间充质干细胞数量充足，纯度可达90%以上^[14]。

胎盘间充质干细胞透射电子显微镜标本制备和观察：①取培养至第3-5代的胎盘间充质干细胞用0.25%胰酶- EDTA消化，加入小牛血清终止消化反应，PBS重悬、清洗细胞，每个标本细胞数大于2×10⁷个。②将细胞悬液放入1.5 mL的EP管，以800 r/min低速离心15 min。③弃去上清，小心保持细胞成团块状，加入2.5%戊二醛固定液，在4 ℃冰箱固定2 h以上。④去除上清，小心清洗戊二醛溶液，再加入1%锇酸固定液，4 ℃冰箱中固定2 h，直至细胞团变成黑色，然后逐步清洗、脱水(图1)。⑤在试管中加入Epon812包埋剂和100%丙酮1︰1混合液，室温下渗透4 h。⑥用牙签将细胞团(黑色)挑出，放在塑料模具顶端，在模具中加入适量含有DMP-30的Epon812包埋剂，使细胞团完全浸没于包埋剂中。⑦将模具置于40 ℃恒温烤箱中烘烤24 h，然后在60 ℃下聚合48 h。⑧取出包埋块，用刀片和不锈钢锉将包埋块顶端修成梯型。在光学显微镜下进一步将包埋块顶端平面修成1 mm×1 mm大小，再用超薄切片机切片。由于标本为体外培养后离心的细胞团，固定后内部结构比较均一，因此无需做半薄切片进行组织定位。⑨将超薄切片置于镀膜铜网上染色：先浸入醋酸双氧铀中染色15 min，用三蒸水漂洗3遍，尽量去除染色；再用硝酸铅液染15 min，用三蒸水漂洗3遍。⑩用滤纸吸干铜网上液体，TECNAI 10透射电子显微镜下观察并拍照^[15]。

Fluospheres黄绿色荧光微球(1 μm)悬液制备：取20 μL Fluospheres悬液(1×10¹³ L^-¹)，用无菌三蒸水按照1︰50倍稀释，得2×10¹¹ L^-¹的悬液，避光保存于4℃备用。

胎盘间充质干细胞吞噬实验：取第3-5代的胎盘间充质干细胞接种于12孔板上，每个标本2孔，每孔5×10⁴个细胞。用完全培养基培养48 h后，在一个孔的培养液中加入4 μL Fluospheres 黄绿色荧光微球(1 μm，2×10¹¹ L^-¹)作为吞噬孔；另一个孔不加Fluospheres黄绿色荧光微球，作为对照孔，于体积分数为0.5%的CO₂培养箱中继续培养3 h。培养结束后，弃去上清，用胰酶-EDTA消化细胞，PBS洗细胞2遍，尽量去除未吞噬的荧光微球。用40 g/L多聚甲醛溶液重悬细胞，每管细胞悬液终体积为500 μL，反复吹打，防止细胞黏附聚集。由于细胞个体比较大，在用流式细胞仪检测前，把细胞悬液用200目尼龙滤网过滤，防止聚集在一起的细胞堵塞流式细胞仪内管。

使用FACSCalibur流式细胞仪检测吞噬情况，CELLQuest软件分析数据，设置激发光波长为488 nm，选择荧光1(FL1)通道。每个样品检测8 000个细胞。

主要观察指标：①胎盘间充质干细胞表面标记物的表达及潜在分化能力。②透射电镜下胎盘间充质干细胞的细胞器特征。③胎盘间充质干细胞吞噬荧光微球的比例。

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讨论

胎盘间充质干细胞的细胞核出现核膜内陷、折叠，核仁明显，提示细胞核处于一个活跃的生理状态，这与胎盘间充质干细胞在体外培养时表现的旺盛的自我复制、增殖能力相一致。胎盘间充质干细胞的内质网系统发达，部分细胞胞浆内有大量狭长或短小的粗面内质网；部分细胞中粗面内质网扩张，膜内含有电子致密物，这一点和Pasquinelli等^[6]报道的骨髓间充质干细胞结构相似。胎盘间充质干细胞还有一个特征：细胞内可见发达的高尔基器。高尔基器在人胎盘间充质干细胞胞浆内很常见，经常分布于胞核周围，有时1个视野中能见到多组高尔基器。粗面内质网的主要功能是合成大分子蛋白质，在粗面内质网合成的蛋白质分子运输到高尔基器逐步成熟、分泌到细胞外。因此上述这些特点提示人胎盘间充质干细胞可合成和分泌大量蛋白质。

有研究表明间充质干细胞可分泌多种细胞因子和趋化因子。在正常培养条件下，骨髓间充质干细胞和脐血来源的间充质干细胞都表达白细胞介素8、血小板生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、基质细胞衍生因子1α和干细胞因子等^[17-20]。胎盘来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞有着相似的细胞超微结构，也表达大量的细胞因子^[21-22]，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、γ-干扰素、白细胞介素2、白细胞介素4、单核细胞趋化蛋白1、基质细胞衍生因子1等。这些研究结果与课题组研究发现相一致。

钟志年等^[23]使用原子力电子显微镜直接扫描了贴壁生长的胎盘间充质干细胞表面结构，结果发现细胞呈长梭型，可见与细胞长轴平行的微丝束，细胞骨架明显，有触突状骨架伸出，这可能对维持细胞的形态、运动和物质运输起着关键的作用。本研究中将胎盘间充质干细胞消化离心、固定切片后在透射电镜下观察，发现大部分胎盘间充质干细胞表面均可见发达的微绒毛(非肠上皮型)，这可能与细胞贴壁生长的生物学行为有关。突触状的细胞骨架在经胰酶消化后可能变形而在透射电镜下表现为微绒毛结构。

此外，体外培养的人胎盘间充质干细胞最显著的超微结构特点是溶酶体，几乎在每个细胞内均可见大量溶酶体及少量脂褐素样结构。溶酶体是由质膜包被的囊状细胞器，内含多种水解酶，可降解特定的底物。长久以来溶酶体一直被认为是细胞的“焚化炉”，能降解细胞代谢废物、细胞碎片。除此之外，溶酶体还具有分泌功能，并参与细胞膜修复、细胞内信号传导、能量代谢^[24]。细胞外需要被降解的物质通过“胞吞”途径达到溶酶体内^[25]；细胞内的成分则通过自噬行为运输到溶酶体内^[26-27]。溶酶体通过与细胞膜融合，可以分泌释放其内容物，这个过程被称为“胞吐”^[28]。经溶酶体作用后剩下的不能再被消化的物质形成残余体，称为脂褐素，脂褐素的出现往往提示细胞老化。胎盘间充质干细胞在原代细胞获取和每次传代过程中使用了胰酶进行消化，可能损伤了部分细胞器，在细胞内被溶酶体消化降解，这可能是细胞内出现大量溶酶体的原因之一。由于实验选用的是体外培养的第3-5代细胞，细胞的增殖能力很强，也有很好的分化潜能，因此细胞内大量的溶酶体不能说明胎盘间充质干细胞出现老化现象。这些丰富的溶酶体也可能为胎盘间充质干细胞分泌多种细胞因子的表现；或者提示胎盘间充质干细胞具有吞噬功能，吞噬并消化培养基中的有形物质。为了进一步确认这一点，研究中选用了Fluospheres荧光微球，用流式细胞仪检测细胞的吞噬功能。

吞噬实验的结果提示胎盘间充质干细胞确实具有较强的吞噬功能。实验中所用Fluospheres荧光微球是直径为 1 μm聚苯乙烯微球，包被了强荧光染料，在激发光作用下能发出黄绿色荧光，能够被流式细胞仪识别这种荧光微球直径和大肠杆菌、细胞碎片大小比较接近^[29]，因此胎盘间充质干细胞吞噬荧光微球的现象在一定程度上反映了其吞噬异物和细胞碎片的能力。

巨噬细胞存在于淋巴组织和非淋巴组织中，能够吞噬清除凋亡细胞、微生物等有害物质，并产生细胞因子，以此来维持组织环境的平衡稳态^[30]。巨噬细胞表达多种表面受体，包括七次跨膜受体、Toll-like受体、甘露糖受体等。这些受体能广泛识别细菌脂多糖、脂蛋白、病毒融合蛋白、双链RNA、N-甲酰蛋氨酸残基和趋化因子等分子^[31]，是介导巨噬细胞迁移、识别和吞噬异物的重要分子。在这些方面胎盘间充质干细胞与巨噬细胞比较相似。现有研究表明间充质干细胞也可表达趋化因子受体(七次跨膜受体家族)^[32]、Toll-like受体^[33]，可以分泌多种细胞因子。本研究结果提示胎盘间充质干细胞具有与巨噬细胞相似的吞噬功能。胎盘是妊娠期特有器官，具有多种功能：如物质交换、防御、物质合成、免疫调节等^[12]，是维持胎儿宫内生长发育的重要器官。因此，作者推测在胎盘组织中胎盘间充质干细胞有可能担当“清道夫”，清除组织中的异物或碎片，维持胎盘组织的稳态；胎盘没有经典的淋巴系统，胎盘间充质干细胞的吞噬功能可能参与了胎儿、胎盘防御机制。

巨噬细胞还是一种重要的抗原提呈细胞，它识别和处理抗原，并提呈给T细胞^[34]，特异性激活T淋巴细胞和产生抗体的B淋巴细胞。但在这方面胎盘间充质干细胞和巨噬细胞不同，在正常情况下，间充质干细胞表达HLA-Ⅰ类抗原但不表达Ⅱ类抗原。由于缺乏共刺激分子如CD86、CD40、CD40L^[35-36]，间充质干细胞可能不被活化的T细胞识别，也不会在异基因移植时被宿主排斥。胎盘间充质干细胞不激活淋巴细胞，不具有巨噬细胞的抗原提呈功能，甚至还有抑制淋巴细胞增殖的能力和免疫调节作用；研究表明胎盘间充质干细胞在体外可以显著抑制T细胞的增殖，包括抑制丝裂原活化的T细胞和同种异基因刺激的T细胞，即混合淋巴细胞反应^[37-38]。记忆T细胞和naive T细胞以及CD4⁺和CD8⁺ T细胞都可以受间充质干细胞的调节^[37,39]。而且胎盘间充质干细胞不表达单核-巨噬系统表面标记物CD14，所以胎盘间充质干细胞有别于传统的巨噬细胞。

总而言之，研究结果提示，胎盘间充质干细胞的超微结构具有细胞核功能活跃、内质网系统发达、高尔基器常见、胞浆中富含溶酶体、细胞表面微绒毛丰富等特点。进一步的吞噬实验说明胎盘间充质干细胞具有吞噬功能，因此有可能在胎盘组织中担任清除异物、组织碎片的职责。细胞的超微结构往往提示着细胞的状态与功能，胎盘间充质干细胞的超微结构特点说明其在胎盘组织中可能有人们未知的多重功能，还需要进一步探讨和研究。