神经元钙传感蛋白R102Q突变体的动力学构象特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经元钙传感蛋白参与多种生理功能，在大脑皮质不同脑区都有很高的分布。在自闭症患者基因测序中识别出神经元钙传感蛋白第102个氨基酸精氨酸ARG102突变成谷氨酰胺Glu102(R102Q)。实验研究显示，R102Q突变对神经元钙传感蛋白局部区域影响很大，发生本质性的构象改变。
目的：确定神经元钙传感蛋白单一氨基酸R102Q突变引起结构构象动力学变化的具体原因。
方法：采用计算机分子动力学模拟的方法，进行6个独立的、模拟时间是450 ns的全原子动力学模拟。
结果与结论：①神经元钙传感蛋白R102Q突变对蛋白整体结构影响不大，在整个模拟过程中都没有进行大的构象重组，但导致螺旋改变，结构更加稳定。②R102Q突变导致盐桥网络发生改变，一方面降低了L2的柔性，使其更加稳定；另一方面改变L3在疏水口袋中的位置，使其在疏水口袋中更加舒展。结果表明，螺旋在蛋白结构稳定中起到一定的作用，盐桥改变也是蛋白动力学变化的重要原因。这项研究可能从分子的层面和结构的视角，为与R102Q突变有关的蛋白质功能缺失提供理论参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 神经元钙传感蛋白, R102Q突变, 盐桥, 自闭症, 神经系统, 分子动力学

Abstract:

BACKGROUND: Neuronal calcium sensor-1 protein has a variety of different neuronal functions and has a high distribution in different areas of the brain. A single residue R102Q mutation in human neuronal calcium sensor-1 protein is demonstrated to be associated with autism disease. The experiment studies have reported that this R102Q mutant has essential conformation changes in local area of the neuronal calcium sensor-1.
OBJECTIVE: To well understand the specific reasons of the R102Q mutation of the neuronal calcium sensor-1 to the conformational dynamic changes.
METHODS: Six independent extensive all-atom molecule dynamic simulations during 0-450 ns were conducted.
RESULTS AND CONCLUSION: We have found that (1) there is no obvious recombination during the simulations between wild type and mutant type, but R102Q mutant alters the helix and makes the structure of the protein more stable; (2) R102Q mutation alters the salt bridges, reduces the flexibility of L2, and makes L3 extend in hydrophobic crevice. These results reveal that the helix plays an important role in the structural stability, and salt bridge is the important reason for the dynamic changes of neuronal calcium sensor-1 protein. This study may provide a structural insight into the function of protein deficiency associated with R102Q mutant.

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Key words: Neuronal Calcium-Sensor Proteins, Amino Acids, Mutation, Neurons

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

运动对人的身体和大脑都能产生相应的作用^[1]。体育活动能够调整神经网络的状态，加强相应区域内细胞/神经元的能力^[2]；不仅能触发^[3]，而且能引起中枢神经系统内与记忆过程有关的很多区域的塑化变化^[4-5]；有规律的体育活动对人类的认知表现也产生积极的影响^[6-8]；心肺功能强和运动技能水平高都有利于认知发展^[9]；运动能够提高青少年的认知表现和专业成就，运动强度起到重要的积极作用^[10]；长期的游泳训练通过增强大鼠海马体区域的空间短时记忆，能够提高对物体的定位，加强对移动物体的识别^[2]。而体育运动以上功能的发挥所依赖的其中一个很重要的信号蛋白就是神经元钙传感蛋白。近5年，神经元钙传感蛋白的研究热点之一是有关蛋白突变体和其功能障碍而导致各种疾病的研究^[11]。神经元钙传感蛋白生理功能的发挥与其结构有很大的关系，结构的不同变化对生理功能的发挥影响不同。神经元钙传感蛋白第144个氨基酸proline144突变成serine144的小鼠，显示出精神分裂症和抑郁症的内表型特征^[12]。在对自闭症患者基因测序的过程中，识别出神经元钙传感蛋白第102个氨基酸精氨酸 ARG102突变成谷氨酰胺Glu102^[13]，这一突变引起蛋白结构和功能的缺失，采用荧光技术、核磁共振等实验方法，结果表明：①氨基酸或者位置发生改变^[14]，或者共振强度发生变化，或者完全消失^[15]，这些氨基酸包括N段，也包括C段^[14-15]。② F螺旋(H6：E99-D109)靠近突变的位置变化很大^[15]，另外螺旋H9(L166-K174)，C末端尾部L3(D176-V190)也受到突变点的影响，并改变了L3在疏水口袋的位置^[14-15]，这一点也得到分子动力学研究的支持^[16]，但这些变化是如何引起的尚不清楚。文章采用分子动力学模拟的方法，分别对神经元钙传感蛋白野生型和突变体R102Q在水溶液中进行了3个独立的、持续时间为450 ns的分子动力学模拟，从分子层面探讨神经元钙传感蛋白R102Q突变引起其结构和功能变化的机制，进一步阐明其发挥生理功能的分子机制。

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材料方法

1 资料和方法 Data and methods

设计：原子水平的对比观察。

时间及地点：于2013年5至12月在复旦大学物理系计算机中心完成。

人类神经元钙传感蛋白及其R102Q突变体来源：根据Heidarsson等^[14]研究，在本文中，野生型神经元钙传感蛋白的最初结构是来自于蛋白质库(Protein data bank，PDB)中编号ID为2LCP的结构，神经元钙传感蛋白 R102Q突变体是在野生型蛋白质的基础上，用Accelrys Discovery Stutio 2.5软件将谷氨酰胺Glu102替代精氨酸ARG102，作为突变体的初始结构。

纳入标准：①与神经元钙传感蛋白突变体相关的实验研究文献。②与神经元钙传感蛋白突变体相关的分子动力学模拟研究文献。

排除标准：与神经元钙传感蛋白突变体无关的文献。

分子动力学模拟的方法：

方法介绍：分子动力学模拟(molecular dynamic simulation，MD)是一门结合数学、物理、化学及生物学的综合技术。1957年，Alder 和Wainwright完成了首次基于刚球势的分子动力学模拟。自此以后，分子动力学不断发展完善，现在已成为应用最为广泛的分子模拟方法之一。随着计算机运算速度的大幅度提高、各种模拟算法的不断改进，以及经验力场的发展与完善，分子动力学模拟应用于各种体系，尤其在生物大分子模拟中起到极其重要的作用^[17-19]。一方面，分子动力学模拟可以解决目前实验仪器无法从原子层面上观察到生物大分子在溶液中行为的不足；另一方面，动力学模拟中用到的各种势能参数来源于实验数据，它们对某一原子体系具有共性，能够发现共有规律。因此，分子动力学模拟方法可以给出蛋白质、核酸等生物大分子内部运动随时间最详实的变化情况，从而用于分析体系的诸多运动性质。

操作步骤：

第1步：确定起始构型。一个能量较低的起始构型是进行分子模拟的基础，一般分子的起始构型主要来自实验数据或量子化学计算。根据实验数据，从蛋白质数据库中下载相应的蛋白质结构，作为分子模拟的起始结构。本文中神经元钙传感蛋白取自蛋白质库ID为2LCP结构。

第2步：结构转换。将从PDB数据库中下载的蛋白质结构转换成用于模拟的topology文件。

第3步：力场的确定。首先采用不同的蛋白质经验力场(包括OPLS力场和CHARMM27力场)对研究体系进行测试，把模拟结果跟实验结果进行比较，并参考前人研究中采用的力场，从而选取合适的力场，或对现有力场进行进一步优化。本文最终确定的力场是CHARMM27力场。

第4步：能量优化。对于生物大分子体系，在进行分子动力学模拟之前，通常用分子力学方法进行优化，从而获得能量较低的起始构型。根据实验条件中的各个参数，将蛋白质置于一个类似于真实环境的体系中，包括给蛋白质加盒子、加水、加离子、加盐浓度，使整个体系保持中性环境，从而使得动力学模拟环境与实验环境对这一原子体系具有共性，能够发现共有规律，并对体系进行能量优化。

第5步：约束动力学。约束分子动力学方法是为了满足实验上已知的某一距离/角度约束或为了提高分子动力学模拟的抽样效率，而在体系的势能函数中加入一个简谐项，是分子动力学模拟中一种比较常用的方法。本文中，在整个体系保持中性环境的基础上，确定温度和压强，使模拟环境保持恒温恒压。

第6步：动力学模拟。分子动力学技术已被公认为一个用来改善实验结构的可靠的工具。这一过程类似于一个高速摄像机，以ps(10^-¹² s)为单位的速度记录蛋白质在模拟体系中最详尽的运行和变化情况，从而分析蛋白质诸多的运动性质，分析所用数据正是从这个过程中获取的。

第7步：数据分析。采用VMD1.9.1、origin8、gromacs4.5.3等相关软件对动力学模拟结果进行分析和处理。

参数设置：分子动力学模拟采用GROMACS 4.5.3程序包和CHARMM27力场^[20-21]，水分子采用显型模型TIP3P，盒子大小是10.07×6.98×6.70 nm³，在溶液中加入0.05 mol的NaCl，使溶液呈中性。温度耦合采用速度调节法^[22]，压力耦合采用Parrinello-Rahman法^[23]，采用的耦合常数分别是0.1 ps和1.0 ps，温度保持在310 K，压强保持在100 kPa(1 bar)，使整个体系保持等温等压。蛋白质和水分子内的键长分别用LINCS和SETTLE算法^[24-25]，每步的时间是2fs，库伦类型为Particle mesh Ewald (PME)，静电的相互作用采用cut-off=1.0 nm，范德华作用采用cut-off=1.4 nm。

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讨论

2 结果与讨论 Results and discussion

神经元钙传感蛋白是一个含有190个氨基酸的蛋白质，通过EF-hand对钙离子进行结合，并呈现“高亲和力，低容量”的特点^[26]，4个EF-hand中有3个(EF2、EF3和EF4)能够结合Ca^2+[27]，而EF1是不能与Ca²⁺结合的^[27-28]。其中，EF1和EF2称为N段(N-domain)，EF3和EF4称为C段(C-domain)。通过NMR光谱法已经解析出人类非酰化的神经元钙传感蛋白溶液结构^[14]，图1显示了人类神经元钙传感蛋白的三维立体结构(pdb ID=2LCP)。

神经元钙传感蛋白的结构呈现螺旋-环-螺旋的特点，主要包括9个α螺旋(Helix)和3个环(Loop)，根据Heidarsson等^[14]的研究，这9个α螺旋分别命名为：H1(E11-R18)、H2(E24-F34)、H3(A45-Q54)、H4(T62-F72)、H5(F82-S93)、H6(D98-Y108)、H7(R118-V132)、H8(E146-M155)、H9(L166-K174)；3个环分别是连接螺旋H3和H4的L1(F56-P61)、螺旋H7和H8之间的L2(G133-P145)、蛋白C端尾部L3(D176-V190)。其中8个螺旋H2-H9构成了疏水口袋，螺旋H4、H5和H6构成了疏水口袋的底部，H3和H7是疏水口袋的一边，H9在另一边，H2和H8分别在疏水口袋的两头。EF-hand各段分别是：EF1（E24-Q54）、EF2(T62-S93)、EF3(D98-V132)、EF4(E146-K174)。图1显示的神经元钙传感蛋白疏水口袋中没有配体，蛋白C端尾部L3部分在疏水口袋中充当配体，并占据着疏水口袋。为了使图示更为清晰，EF-hand及Ca²⁺没有在图中显示出来。

2.1 单一氨基酸R102Q突变对蛋白的整体结构影响不大蛋白在整个分子动力学模拟过程中结构的调整可以用均方根偏差（Root mean square deviations，RMSD）表示，均方根偏差值大，说明在模拟过程中蛋白的结构变化大；均方根偏差值小，说明结构变化不大。作者计算神经元钙传感蛋白聚类中心结构Backbone E11-K174各部分的均方根偏差，以比较蛋白在模拟前后整体结构构象的变化情况。本文分别进行了6个独立的动力学模拟，包括3个野生型(wild type)和3个突变体(mutant type)模拟，分别表示为WT1、WT2、 WT3和MT1、MT2、MT3。野生型和突变体神经元钙传感蛋白的均方根偏差平均值分别用

WT-Average和MT-Average表示(见图2)。

从6个结构的均方根偏差值及其平均值看出，①野生型和突变体各部分均方根偏差值的趋势一致，说明野生型和突变体神经元钙传感蛋白有类似的构象变化。②从图2可以看出，两种状态下各部分均方根偏差值都很小，平均值约为0.2 nm，说明野生型和突变体构象变化不大，在整个模拟过程中没有进行大的构象重组。③突变体大部分结构的均方根偏差值小于/等于野生型的，说明相对野生型蛋白，突变体构象变化更小，结构更稳定。但有趣的是，在神经元钙传感蛋白野生型和突变体中，L2的均方根偏差数值都很大,说明L2的柔性都比较大；而突变体L2的均方根偏差值明显小于野生型蛋白，说明在突变体中L2的动力学降低，构象变化减小。

2.2 单一氨基酸R102Q突变导致蛋白结构中螺旋改变，构象更加稳定R102Q突变没有使蛋白整体结构发生很大的构象重组，但突变体大部分的均方根偏差值均小于野生型，尤其是L2的均方根偏差值减小的更为明显，表明神经元钙传感蛋白突变体的构象更为稳定，这一点也能从蛋白的三维结构中显示出来，为了更清晰的表明结构中螺旋改变及L2的构象变化，采用蛋白的侧面图示(见图3)。

在图3中，神经元钙传感蛋白的结构用紫色表示，蓝绿色是L2，紫罗兰色标示出来的是3₁₀螺旋。对蛋白结构的稳定性而言，α螺旋的稳定性大于3₁₀螺旋，而非螺旋的结构稳定性最差。在野生型神经元钙传感蛋白结构中，α螺旋H7上有一个3₁₀螺旋，而在突变体结构中，H7上的3₁₀螺旋消失，只有9个α螺旋，这表明突变体结构比野生型更加为稳定，这跟均方根偏差值计算的结果一致。Heidarsson等^[14]的研究也显示，突变体的结构更加紧凑，也与本文的研究结果一致。另外，相比野生型神经元钙传感蛋白，在突变体结构中，L2上有一个3₁₀螺旋，由于3₁₀螺旋的稳定性大于非螺旋的，这也可能是导致L2的均方根偏差值明显比野生型神经元钙传感蛋白小很多，从而使其结构更加稳定的原因之一。

单一氨基酸R102Q突变导致盐桥改变，使L2和L3动力学减弱神经元钙传感蛋白是一个含有190个氨基酸的蛋白，而且还是一个多电荷蛋白。在构成结构的190个氨基酸中，包含24个正电荷和33个负电荷，电荷与电荷之间存在相互作用，其中正电荷和负电荷之间的相互作用在一定范围内就形成盐桥。而盐桥在维持蛋白质结构稳定中起到极其重要的作用^[29-30]，而且还能够控制蛋白质的变构动力学及其功能^[31-33]。为了更为清楚的了解突变体构象稳定的具体细节，深入了解功能变化的机制，作者进一步探讨盐桥的变化。为了清晰的描述盐桥间的相互作用以及动态盐桥的形成，按照蛋白结构中盐桥的相对位置，做了一个盐桥网络简易图(见图4)。突变对各盐桥的影响是不同的，将受R102Q突变体影响最大的各个盐桥在蛋白质结构图中标示出来。图4中蓝色氨基酸表示带正电荷，红色氨基酸表示带负电荷，氨基酸之间有箭头的连线表示氨基酸之间形成了盐桥，氨基酸之间没有连线表示没有形成盐桥，箭头线的粗细表示形成盐桥的概率大小，箭头线越粗，表示形成盐桥的概率越高；反之，越低。

从图4中可以看出，受影响最大的盐桥包括N段的某些氨基酸，如氨基酸K63、E74和R94；也包括C段某些氨基酸，按氨基酸序列顺序分别是氨基酸D98、E99、K100、R102、D123、D126、E140、E142、R148、R151、K174、D176、D187。这与前人的研究结果一致^[14-15]。从图4可以看出，整个结构中受影响最大的盐桥在突变体中明显减少，盐桥内部也发生了变化。结果显示：野生型蛋白质结构中，氨基酸R102与E99和E74形成动态盐桥，氨基酸D187与K100、R148形成动态盐桥，氨基酸R148与E142、D187形成动态盐桥，氨基酸K63分别与D123和D126形成动态盐桥，而氨基酸D123和D126靠近L2的N端，氨基酸E142靠近L2的C端，这些动态盐桥的相互拉动，使L2构象变化较大；而在突变体中，由于R102突变为Q102，Q102呈中性，氨基酸E99和E74被释放出来，氨基酸E99与R94，氨基酸R94与D187都形成动态盐桥，氨基酸D187与K63形成盐桥，使氨基酸K63和D123、D126之间的盐桥断裂，L2 的N端受力显著减小，螺旋H7相对更加稳定；而氨基酸R148与D176和E140形成动态盐桥，氨基酸D176与R151形成盐桥，即氨基酸D176与R148、R151形成动态盐桥，这两对盐桥的作用力，导致L2 的C端相对稳定，使螺旋 H8也更加稳定。以上盐桥的变化使得处于螺旋H7和H8之间的L2更加稳定，一定程度上可以解释相对于野生型蛋白，L2在突变体中均方根偏差值更小。另外，在野生型神经元钙传感蛋白中，氨基酸R148与E142、D187形成动态盐桥，氨基酸D187靠近蛋白L3的 C端部位，活动幅度相对较大；而在突变型神经元钙传感蛋白中，氨基酸D148与E140、D176形成动态盐桥，氨基酸D176在L3的 N端部位，更靠近螺旋H9，活动幅度较小，一方面，我们可以认为这些盐桥的改变，使得L2在野生型和突变体神经元钙传感蛋白中的稳定性不同，在野生型中较大，这与NMR研究结果一致^[16]；另一方面，氨基酸D176是蛋白尾部L3(D176-V190)的N端，氨基酸D187是靠近L3尾部C端的氨基酸，盐桥网络的改变导致L3在疏水口袋中的位置发生很大的改变，这与以前的研究结果一致^{[14-15, 34]}。而且三对盐桥D176-R148、D176-R151、D148-E140共同牵动螺旋H9、蛋白C端尾部L3向螺旋H8靠拢，从而使氨基酸K174与D98间的作用力减小，盐桥断开，这与螺旋H6(E99-D109)靠近突变的位置以及螺旋H9变化很大这一研究结果一致^[15]。

另外，靠近L3尾部C端的氨基酸D187在野生型和突变型结构中形成的盐桥发生明显改变，在野生型中氨基酸D187与K100、R148形成动态盐桥，在突变体中与氨基酸R94、K63形成动态盐桥，这一盐桥变化拉动蛋白尾部L3的C端部位远离N端，而L3的N端氨基酸D176在野生型神经元钙传感蛋白中没有形成盐桥，在突变体中与氨基酸R148和R151形成盐桥，而且氨基酸R148和E140形成盐桥，共同牵动L3的N端向螺旋H8靠近。这些动态盐桥的改变导致蛋白C端尾部L3在疏水口袋中更加舒展，这已经在作者的研究中得到证实^[31]。

3 结论 Conclusion

神经元钙传感蛋白R102Q突变对蛋白整体结构影响不大，在整个模拟过程中都没有进行大的构象重组，但导致结构中螺旋改变，使其结构更加稳定；也导致盐桥网络发生改变，从而一方面降低了L2的柔性，使其更加稳定，另一方面改变L3在疏水口袋中的位置，使其更加舒展，阻碍受体与疏水口袋中结合位点的结合，致使其功能受限。

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