新型阳离子磷酸胆碱聚合物可作为反义寡核苷酸基因的运输载体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (51): 8292-8296.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.017

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新型阳离子磷酸胆碱聚合物可作为反义寡核苷酸基因的运输载体

鲁永织¹，孙甜甜²，曹希传²，张卓琦¹，王志荣¹，徐晤¹，郝湛军¹，王向东¹，张超群¹，夏勇¹，李东野¹

¹徐州医学院附属医院心内科，江苏省徐州市 221002；²中国矿业大学材料科学与工程学院，江苏省徐州市 221116

出版日期:2014-12-10 发布日期:2014-12-10
通讯作者: 张卓琦，徐州医学院附属医院心内科，江苏省徐州市 221002
作者简介:鲁永织，女，1984年生，山东省青岛市人，汉族，2010年徐州医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事心血管基因治疗研究。
基金资助:
课题受国家自然科学基金(30800219，30670557)；江苏省高校自然科学基金(08KJD320013)；徐州医学院院长专项人才基金(07KJZ26)资助

Novel cationic phosphorylcholine polymer acts as an anti-sense oligonucleotide gene delivery carrier

Lu Yong-zhi¹, Sun Tian-tian², Cao Xi-chuan², Zhang Zhuo-qi¹, Wang Zhi-rong¹, Xu Wu¹, Hao Zhan-jun¹, Wang Xiang-dong¹, Zhang Chao-qun¹, Xia Yong¹, Li Dong-ye¹

¹Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China; ²College of Materials Science and Engineering, Chinese University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, Jiangsu Province, China

Online:2014-12-10 Published:2014-12-10
Contact: Zhang Zhuo-qi, Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
About author:Lu Yong-zhi, Master, Attending physician, Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30800219, 30670557; Natural Science Foundation of Jiangsu Universities, No. 08KJD320013; Special President Talent Fund of Xuzhou Medical College, No. 07KJZ26

摘要/Abstract

摘要：

背景：病毒类基因载体虽然具有较高的转染效率，其安全性一直受到人们的质疑。

目的：以阳离子磷酸胆碱聚合物作为基因药物运输的载体，研究其对人类c-myc反义寡核苷酸(AS-ODN)的负载和运输能力，并对其安全性和有效性进行评价，

方法：应用原子转移自由基聚合法合成具有高度生物相容性的双嵌段磷酸胆碱聚合物MPC₃₀-DEA₇₀，并对其溶液进行表征。用DNA凝胶电泳法对MPC₃₀-DEA₇₀与针对AS-ODN生成不同N/P比值的基因复合物进行表征。将MPC₃₀-DEA₇₀/AS-OD基因复合物转染至体外培养的HEK293细胞，检测其细胞相容性、转染效率和细胞内转运机制。

结果与结论：MPC₃₀-DEA₇₀在pH=4.0-11.0范围内的0.01 mol/L PBS中显示出高度水溶性，其正电性随pH值降低而增强。MPC₃₀-DEA₇₀/AS-ODN基因复合物在DNA凝胶电泳中显示出不同程度的电泳迟滞，随电性增强而显著。MTT法检测显示MPC₃₀-DEA₇₀对HEK293细胞株的毒性呈剂量依赖性，高浓度下细胞毒性显著增强。流式细胞术检测发现复合物的转染随N/P比值增加而显著增强；共聚焦显微镜观察到AS-ODN分子在细胞核内的转运，提示其有效的核定位。证实新型阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载和运输反义寡核苷酸，是一种高效安全的非病毒类转基因载体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 组织工程, 磷酸胆碱聚合物, 反义寡核苷酸, 基因运输, 非病毒载体, 基因治疗, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although viral gene vector has high transfection efficiency, its safety has been questioned.

OBJECTIVE: To study the effect of gene-based drug delivery with the carrier of cationic phosphorylcholine polymers on the load and transport capacity of human c-myc anti-senseoligodeoxynucleotide, and to evaluate the safety and efficacy.

METHODS: Highly biocompatible diblock phosphorylcholine copolymer MPC₃₀-DEA₇₀ was synthesized using atom transfer radical polymerization and the copolymer solutions were characterized. Under different conditions, DNA complexes were formed between MPC₃₀-DEA₇₀ and c-myc anti-senseoligodeoxynucleotide at different N/P ratios, which were characterized by DNA gel electrophoresis. The MPC₃₀-DEA₇₀/AS-OD gene complexes

were transfected into the in vitro cultured HEK293 cells to detect the cell compatibility, transfection efficiency and mechanism of intracellular transport.

RESULTS AND CONCLUSION: The results showed that the material MPC₃₀-DEA₇₀ at pH=4.0-11.0, showed a high degree of water-soluble property in 0.01 mol/L PBS solution, and the positive charge was increased with the decreasing of solution pH value. MPC₃₀-DEA₇₀/AS-ODN complexes showed different degrees of gel retardation in DNA gel electrophoresis, and was increased significantly with the increasing of N/P ratios. Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide assay showed that the MPC₃₀-DEA₇₀ inhibited the viability of the HEK293 in a dose-dependent manner, and cell toxicity was significantly increased in high dose MPC₃₀-DEA₇₀. Flow cytometry study showed the transfection of the complexes was significantly enhanced with the increasing of N/P ratios. Confocal microscopy study found the transferred anti-senseoligodeoxynucleotide molecules in the cell nucleus, suggesting its effective nuclear localization. The results indicate that novel cationic phosphorylcholine copolymer can load and transport anti-senseoligodeoxynucleotide, which may act as an efficient and safe non-viral gene transfer vector.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: gene therapy, genetic vectors, oligonucleotides, antisense, cations, polymers

中图分类号:

R318

鲁永织，孙甜甜，曹希传，张卓琦，王志荣，徐晤，郝湛军，王向东，张超群，夏勇，李东野. 新型阳离子磷酸胆碱聚合物可作为反义寡核苷酸基因的运输载体[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(51): 8292-8296.

Lu Yong-zhi, Sun Tian-tian, Cao Xi-chuan, Zhang Zhuo-qi, Wang Zhi-rong, Xu Wu, Hao Zhan-jun, Wang Xiang-dong, Zhang Chao-qun, Xia Yong, Li Dong-ye. Novel cationic phosphorylcholine polymer acts as an anti-sense oligonucleotide gene delivery carrier[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(51): 8292-8296.

图/表（结果） 7

参考文献

引言

材料方法

设计：单一样本研究。

材料：

反义寡核苷酸序列：针对人类c-myc基因的反义寡核苷酸(c-myc AS-ODN)，序列为5’-AAC GTT GAG GGG CAT-3’，5’末端加FAM标记(Eurogentec Ltd, U. K.)。

方法：

阳离子磷酸胆碱聚合物的合成制备及表征：参照文献[5-6]，应用原子转移自由基聚合法(atom transfer radical polymerization，ATRP)合成基于人工细胞膜材料MPC的双嵌段磷酸胆碱聚合物MPC₃₀-DEA₇₀。称取进制 20 mg MPC₃₀-DEA₇₀加到20 mL 0.01mol/L的NaH₂PO₄/ Na₂HPO₄缓冲液(自配，pH=6.8)中，于磁力搅拌器上搅拌过夜至完全溶解。并用孔径0.22 μm的滤器过滤，置 4 ℃保存，质量浓度为1 g/L。分别取1 mL，以HCl和NaOH调节pH值，范围为4.0-11.0^[7-8]。分别取上述溶液20 μL，以1%的琼脂糖凝胶电泳进行表征，电泳30 min后，以 0.1 g/L的考马斯亮蓝G-250染色10 min，再以冰醋酸/甲醇溶液脱色1.0-2.0 h，待显带清楚后取出观察，可见光下拍照。

DNA凝胶电泳表征MPC₃₀-DEA₇₀/AS-ODN基因复合物：用去离子水溶解c-myc AS-ODN，使其终浓度为 0.1 g/L，-20 ℃避光保存。取10.0 μL AS-ODN溶液加到90.0 μL的去离子水中，轻轻震荡使之混合均匀。再分别取0，0.5，1.0，3.0和5.0 μL的MPC₃₀-DEA₇₀溶液并依次加入到盛有100.0，99.5，97.0和95.0的去离子水的EP管中。最后将ODN溶液与上述MPC₃₀-DEA₇₀溶液分别混合形成载体基因复合物共200.0 μL，并在室温下平衡30 min，其质量比等同于摩尔比，即N/P比值分别为0∶1，0.5∶1，1∶1，3∶1和5∶1。

平衡结束后，分别取各基因载体复合物20 μL与 4 μL DNA上样缓冲液(6×，Fermentas)混合，分别加到不含溴化乙锭(ethidium bromide，EB)的1%的琼脂糖凝胶上样孔中，在1×TBE电泳液(自配)中以100 V的电压电泳 20 min，后在紫外灯下观察并拍照记录^[9]。

MTT法检测MPC₃₀-DEA₇₀对HEK293细胞株的毒性：对数生长期的HEK293细胞，按照1×10³/孔接种于96孔板(Costar，USA)，在含体积分数10%FBS的DMEM培养基中37 ℃，体积分数5% CO₂培养24 h，细胞贴壁后弃培养基，PBS冲洗2次，再分别加入含0，0.5，1.0，3.0，5.0，10.0，20.0和40.0 μL MPC30-DEA70的全培养基，总体积200.0 μL，终浓度分别为0，2.5，5，15，25，50，100和200 mg/L。每组各设6个复孔，同时设空白对照组和DMSO组，继续培养24 h后弃培养基，PBS冲洗2次，换含有20.0 μL(5 g/L)MTT的全培养基继续孵育4 h，小心弃培去养基，每孔加200.0 μL DMSO，于摇床上避光低速震荡10 min使结晶物充分溶解，全自动酶标仪检测570 nm下吸光度(A)，计算细胞活力，绘制浓度效应曲线。

流式细胞仪检测复合物转染效率：将HEK293细胞按照2×10⁴/孔接种于24孔板(Costar，USA)，37 ℃，体积分数5% CO₂培养24 h，细胞贴壁后弃培养基，PBS冲洗 2次，选择N/P=0，0∶1，0.5∶1，1∶1，3∶1和5∶1的基因载体复合物，配好后每孔加200.0 μL，再加入800.0 μL含体积分数10% FBS的全培养基，继续孵育 24 h后弃上清，PBS冲洗2次，每孔加50.0 μL 0.05%的胰酶消化3-5 min，轻拍板底使细胞完全脱落，分散均匀，收集到做好标记的EP管中，常温1 000 r/min 离心5 min，小心弃上清，用200.0 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测转染效率和荧光强度。

共聚焦显微镜检测细胞相容性与细胞内的转运机制：在24孔板中放置直径为10 mm圆形载玻片，以100.0 μL 0.1%的明胶铺板，接种细胞及转染方法同上，最后以40 g/L多聚甲醛固定，DAPI(0.5 μmol/L)染核5 min，以Prolong Antifade试剂封固，待封片液干燥后于共聚焦显微镜下观察并拍照。

主要观察指标：MPC₃₀-DEA₇₀的表征及细胞相容性；MPC₃₀-DEA₇₀/AS-ODN的转染效率。

统计学分析：实验数据应用SPSS 10.0软件分析，结果以x(_)±s表示，计量资料应用q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

3.1 磷酸胆碱聚合物MPC₃₀-DEA₇₀的表征自从2003年Ma等^[5]应用ATRP法合成系列水溶性磷酸胆碱聚合物MPCm-DEAn 以来，人们发现其在作为转基因载体方面表现出了优良的特性，其溶液胶束半径和阳离子正电性是保证成功转染的关键。实验结果可见材料MPC₃₀-DEA₇₀在pH=4.0-11.0范围内的0.01 mol/L PBS中显示出高度的水溶性，用考马斯亮蓝进行染色发现，材料MPC₃₀-DEA₇₀的正电性随pH降低而增强，向电泳正极泳动更加明显(图2)。正是其水溶特性和受pH影响的阳离子特性，才是保证其成功转染DNA分子的关键。 3.2 琼脂糖凝胶电泳表征MPC₃₀-DEA₇₀/c-myc AS-ODN基因载体复合物在pH=7.0的条件下，磷酸胆碱聚合物MPC₃₀-DEA₇₀由于MPC的存在而具有很好的亲水性，因DEA的局部质子化作用而带有正电荷，而AS-ODN分子因磷酸根的存在而带有负电荷，这说明MPC₃₀-DEA₇₀/c-myc AS-ODN基因载体复合物的形成靠的是静电引力作用。随着N/P比值的不同，由于两者的电荷量不同，复合物表现出不同的净电性，随着N/P比值的增大，正电性就越强，复合物在电场中泳动时就会出现不同的迟滞现象，N/P比值越大，迟滞现象越明显(图3)。

3.3 MTT法检测MPC₃₀-DEA₇₀对HEK293细胞的细胞毒性 MTT法检测细胞毒性发现在载体MPC₃₀-DEA₇₀质量浓度< 5 mg/L时，细胞活力可以保持在95%以上，< 25 mg/L时细胞活力仍然在85%以上，对细胞的生长没有明显的影响。但是再增加载体浓度其出现毒性，细胞活力显著降低，浓度越大，毒性越强(图4)。MPC₃₀-DEA₇₀之所以有细胞毒性主要是因为“质子海绵”效应。

3.4 基因载体复合物在HEK293细胞中的转染效率和荧光强度 FCM检测显示N/P比值为0∶0，0∶1，1∶1和5∶1时，HEK293细胞的转染效率分别为(2.22±0.20)%，(2.37±0.08)%，(46.29±2.07)%和(85.62± 2.90)%，荧光强度分别为10.46±0.58，11.08±0.33，71.00±3.99和 125.96±7.53，可见c-myc AS-ODN本身虽然可以进入细胞但是仅仅是极少量的，与阴性对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，也就说只有c-myc AS-ODN本身时(N/P=0∶1)，几乎没有转染效率，对细胞也不会产生影响，与文献报道相一致。当c-myc AS-ODN与MPC₃₀-DEA₇₀形成复合物后，转染效率显著增加，无论是较低的N/P比值(1∶1)，还是较高的N/P比值(5∶1)，在转染效率增加的同时，荧光强度的峰值也明显向右移，说明有大量的荧光标记的c-myc AS-ODN进入到细胞内部。从共聚焦显微镜观察可见(图5)，AS-ODN不仅在细胞质中大量存在，在细胞核中也有较多的分布，说明MPC₃₀-DEA₇₀可以将AS-ODN分子转运到细胞中从而发挥其生物学活性，具有有效的核定位效应。

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全文链接：

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